赤霉烯酮通過PI3K-Akt信號通路誘導(dǎo)驢支持細(xì)胞炎癥與細(xì)胞凋亡的機(jī)制

孫瀟，于樹濤，孫玉江，張孝忠，張國梁，宋俊霖

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109，2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院；3.萊陽市動物疫病預(yù)防控制中心，山東煙臺 265200)

赤霉烯酮 (zearalenone，ZEA ) 是由鐮刀菌產(chǎn)生的霉菌毒素，常見于玉米、小麥、燕麥和麥草中，分子式 C18H22O5。ROMER檢測中心國內(nèi)畜禽谷物原料與飼料霉菌毒素檢測報(bào)告顯示[1]，大中型飼料與養(yǎng)殖企業(yè)采集樣品中霉菌毒素的檢出比例為95%，青貯飼料中ZEA檢出率為65%。有報(bào)道表明，動物攝入霉菌毒素后可能會出現(xiàn)腹瀉、腸道出血、繁殖性能降低、發(fā)育異常等癥狀[2]。驢誤食霉菌毒素后會發(fā)生肝出血、脾淤血、腸道積液等病理現(xiàn)象，嚴(yán)重中毒時(shí)可能會死亡[3-5]。2019年全國驢存欄量260.1萬頭[6]，產(chǎn)值近千億元。山東省規(guī)?；B(yǎng)驢場存欄量占全省驢存欄總量的80%，同時(shí)占全國300頭以上規(guī)模養(yǎng)殖場的61%[7]。目前，馬屬動物飼草料中霉菌毒素含量尚未出臺國家或者地方標(biāo)準(zhǔn)，然而集約化養(yǎng)驢場的飼草料中ZEA等霉菌毒素含量過高已經(jīng)成為損害驢繁殖性能的重要原因之一[8-9]。但是，到目前為止此類問題并未引起廣泛和足夠的重視。因此，探究ZEA等霉菌毒素妨害驢繁殖性能的主要途徑與作用機(jī)制可制定飼草料中該毒素限量的國家標(biāo)準(zhǔn)，為促進(jìn)家畜高效繁殖和健康養(yǎng)驢提供理論支持。

PI3K (胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，Phosphatidylinositide 3-kinases)參與調(diào)節(jié)了細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄等多種細(xì)胞內(nèi)生物過程[10]。PI3K的主要下游效應(yīng)子是Akt (絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，又稱 PKB，protein kinase B)，PI3K被激活與磷酸化后引起Akt活化來調(diào)節(jié)生物過程[11]。Hossini等[12]報(bào)道了PI3K/Akt途徑異常能夠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的凋亡。Koh等[13]研究了PI3K/Akt通路參與了細(xì)胞的增殖、分化和遷移，細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)因子可以激活PI3K途徑，進(jìn)而促進(jìn)了Akt1的磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖。因此，PI3K-Akt信號分子在細(xì)胞凋亡與增殖等多種生物過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

支持細(xì)胞(sertolicells，SCs)在家畜睪丸曲細(xì)精管中具有營養(yǎng)、支持、分泌、吞噬等多種功能，是血-睪屏障的重要組成部分之一[14-16]。支持細(xì)胞能夠分泌多種因子保證精子發(fā)生正常進(jìn)行[17]，其異常發(fā)育或受損后將會對精子發(fā)生產(chǎn)生較為嚴(yán)重的影響[6]。目前為止，國內(nèi)外有關(guān)ZEA暴露引起馬屬動物繁殖障礙的研究通常是從毒素暴露后影響動物的攝食或流產(chǎn)等現(xiàn)象去解釋，而毒素直接作用的靶器官如睪丸，卵巢或子宮等蛋白、基因表達(dá)差異卻鮮有報(bào)道，且ZEA等霉菌毒素的毒性作用機(jī)制尚不完全清楚[18-21]。本研究通過采用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)方法分析評估了10 μmol·L-1和30 μmol·L-1ZEA在體外培養(yǎng)的驢睪丸支持細(xì)胞毒性作用，探討ZEA通過PI3K-Akt信號通路誘導(dǎo)驢支持細(xì)胞炎癥與細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，試驗(yàn)結(jié)果將為研究霉菌毒素?fù)p害驢睪丸發(fā)育的機(jī)制和制定馬屬動物飼草料中ZEA等霉菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

赤霉烯酮(Z2125)、牛血清蛋白(BSA)、AnnexinV-FITC/7-AAD凋亡檢測試劑盒(APOAC)均購自Sigma-Aldrich?公司(美國)；青-鏈霉素(雙抗)混合液(PS,P1400)、DMSO(D8371)、非必需氨基酸(NEAA,N1250)、丙酮酸鈉(SP,SP0100)、膠原酶Ⅳ(C8160)、透明質(zhì)酸酶(H8030)、DNA酶Ⅰ(D8071)均購自Solarbio?公司(北京)；FBS(ST30-3302)購自PAN?公司(巴伐利亞)；胰酶(SH30042.01)、DMEM/HIGHGLUCOSE(SH300 22.01)購自Hyclone?公司(北京)；TUNEL(A113)凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；InvitrogenTRIzol(15596026)購自Thermo Fisher Scientific?公司(美國)。細(xì)胞免疫熒光抗體信息見表1。

表1 抗體信息表Table 1 The information of the antibodies

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 驢睪丸收集與睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)處理

取新鮮屠宰的驢(Equusasinus)睪丸，迅速放置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5%青-鏈霉素生理鹽水的保溫杯中，1 h以內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。使用含體積分?jǐn)?shù)1%青-鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS) 清洗驢睪丸，去除多余脂肪與結(jié)締組織。清洗后的組織放入無水乙醇中浸泡10～20 s，使用PBS沖洗3遍，睪丸樣品置于無菌操作臺上，除去白膜，將剩余睪丸實(shí)質(zhì)剪碎至2～3 mm3小塊，去除可見血管和結(jié)締組織，用含雙抗的PBS沖洗后移入50 mL離心管中，加入2～3倍體積膠原酶IV(約2 mL)與0.2 mL·L-1透明質(zhì)酸酶(約2 mL)消化液，用1 mL移液器輕輕吹打混勻，37 ℃消化10～15 min，每隔3～5 min觀察曲細(xì)精管分散狀況；之后將睪丸組織與消化液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，加入相同體積不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，1 200 r·min-1離心5 min，棄上清；分別加入2 mL 37 ℃ 預(yù)熱的0.25 mL·L-1胰酶與10 μg·mL-1DNA酶 I的消化液，37 ℃培養(yǎng)箱消化5～8 min，其間每隔1 min 200 r·min-1震蕩一次；加入等體積含體積分?jǐn)?shù)1% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化；過200目和300目高壓滅菌的細(xì)胞篩過濾得細(xì)胞懸液；細(xì)胞懸液1 200 r·min-1離心5 min，加入10 mL含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基在體積分?jǐn)?shù)5 % CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)6～8 h，然后更換全液。試驗(yàn)中采用10 μmol·L-1和30 μmol·L-1ZEA連續(xù)72 h體外培養(yǎng)并處理支持細(xì)胞。

1.2.2 驢睪丸支持細(xì)胞純度鑒定

本研究通過對支持細(xì)胞特異表達(dá)的SOX 9蛋白，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色的方法鑒定支持細(xì)胞的分離純度[22]。采用Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 TUNEL檢測

收集ZEA處理后的支持細(xì)胞，使用4 mL·L-1多聚甲醛溶液常溫下固定30～40 min，取細(xì)胞懸液于多聚賴氨酸處理的載玻片上，涂抹均勻后于42 ℃熱臺上烘烤2 h左右。PBS洗2～3次，每次5 min。使用1 mL·L-1Triton X-100透化10 min。PBS洗3次，每次5 min，置于濕盒中保持濕潤。按照試劑盒說明書對樣品進(jìn)行TUNEL標(biāo)記，之后使用Hoechst 33342染細(xì)胞核，最后每個(gè)樣品滴加100 μL抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，4 ℃干燥避光保存。波長620 nm熒光觀察BrightRed紅色熒光，波長460 nm熒光觀察Hoechst 33342藍(lán)色熒光。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

收集ZEA處理后的支持細(xì)胞，加入4 ℃的PBS后混勻，300 r·min-1離心5 min后棄上清，1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1 × 106個(gè)·mL-1。設(shè)置陰性對照組、單染對照組、對照組和試驗(yàn)處理組。每組取100 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL的7-AAD和Annexin V-FITC，輕輕吹打混勻，25 ℃避光孵育15 min。最終加入400 μL 1×Binding Buffer終止反應(yīng)，上機(jī)檢測。

1.2.5 RNA提取和轉(zhuǎn)錄組分析

每個(gè)樣本使用1 mL Invitrogen TRIzol裂解收集大約1×107個(gè)細(xì)胞，7 500 r·min-14 ℃離心5 min。上下顛倒混勻后室溫放置10 min。12 000 r·min-14 ℃離心10 min，棄上清。加1 mL體積分?jǐn)?shù)75 % DEPC水配置酒精。短暫渦旋后7 500 r·min-14 ℃離心5 min，棄上清，風(fēng)干10 min。加30 μL DEPC水溶解RNA。RNA測序由Novogene使用Hiseq 4000平臺進(jìn)行，每組至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.6 差異表達(dá)基因的數(shù)據(jù)預(yù)處理和鑒定

測序數(shù)據(jù)分為對照組(CTRL)、10 μmol·L-1處理組(低濃度處理組)、30 μmol·L-1處理組(高濃度處理組)，使用NovoMagic平臺對支持細(xì)胞進(jìn)行分析、富集并篩選差異表達(dá)基因(differential expression genes，DEGs)。使用DEseq2軟件檢測差異表達(dá)基因，設(shè)置參數(shù)為| log 2 FoldChange|>1，P<0.05。使用NovoMagic平臺對DEGs進(jìn)行差異表達(dá)分析和功能富集分析。

1.2.7 細(xì)胞免疫熒光染色

收集驢支持細(xì)胞，體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定1 h。吹打混勻細(xì)胞懸液滴加在多聚賴氨酸處理過的載玻片上，于42 ℃熱臺上烤1.5 h。PBS洗3次，每次4 min。PBST溶液透明10 min，PBS洗1遍。在細(xì)胞區(qū)域滴加等體積封閉液，室溫封閉1 h。細(xì)胞樣品區(qū)域加50 μL一抗(使用封閉液稀釋)，濕盒內(nèi)4 ℃過夜孵育。隨后將樣品置于室溫30 min進(jìn)行復(fù)溫。用含體積分?jǐn)?shù)1% BSA的PBS洗3次，每次3 min。滴加100 μL二抗，37 ℃避光孵育1 h。PBS洗3次，每次5 min。使用10 μg·mL-1Hoechst 33342染核2 min，PBS洗1遍。滴加抗熒光衰減封片劑，蓋蓋玻片，4 ℃干盒中避光保存。使用Image J軟件進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。熒光二抗為：山羊抗兔AlexaFluor594-IgG和山羊抗兔AlexaFluor488-IgG。以上試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究使用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對照組和處理組之間的差異分析使用雙尾t檢驗(yàn)的方法，若P<0.05時(shí)，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，用*表示，若P<0.01時(shí)，認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，用**表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外分離培養(yǎng)驢支持細(xì)胞純度檢測結(jié)果

為檢測分離培養(yǎng)驢支持細(xì)胞的純度，本鑒定方法為利用細(xì)胞免疫熒光染色測定支持細(xì)胞特異蛋白SOX 9的表達(dá)[22-23]。統(tǒng)計(jì)SOX 9陽性數(shù)與細(xì)胞核染色 Hoechst 33342數(shù)量的比率(圖1B)，最終計(jì)算驢支持細(xì)胞占培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)的比例。結(jié)果顯示，SOX 9蛋白在分離培養(yǎng)的驢睪丸支持細(xì)胞內(nèi)均呈現(xiàn)正常定位 (圖1A)，陰性對照 (驢成纖維細(xì)胞) 觀察到熒光信號 (圖1A)。結(jié)果顯示了支持細(xì)胞的分離純度。

2.2 ZEA處理導(dǎo)致驢支持細(xì)胞的凋亡增加

體外培養(yǎng)的驢支持細(xì)胞使用10 μmol·L-1和30 μmol·L-1濃度ZEA連續(xù)處理72 h (圖1C)。TUNEL檢測結(jié)果顯示:ZEA暴露可能導(dǎo)致驢支持細(xì)胞顯著凋亡 (圖2A、2B)。TUNEL陽性率為：對照組為5.17%±0.72%；10 μmol·L-1ZEA處理組為14.77%±0.91%；30 μmol·L-1ZEA處理組為23.59%±1.15%，結(jié)果與ZEA處理濃度的升高呈正相關(guān)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：ZEA連續(xù)處理72 h后，10 μmol·L-1ZEA處理組凋亡率可達(dá)8.06%±0.06%，30 μmol·L-1處理組凋亡率達(dá)到14.22%±0.09% (圖2C)。以上結(jié)果表明ZEA可能誘導(dǎo)驢支持細(xì)胞凋亡。

A.TUNEL (紅)和Hocehst 33342 (藍(lán))染色檢測結(jié)果，標(biāo)尺：50 μm；B.TUNEL陽性率統(tǒng)計(jì)圖；C.流式細(xì)胞檢測結(jié)果。圖2 10 μmol·L-1和30 μmol·L-1 ZEA誘導(dǎo)驢支持細(xì)胞72 h TUNEL、流式凋亡檢測結(jié)果Fig.2 The results of TUNEL and flow cytometry apoptosis detection of E. asinus sertoli cells treated by 10 μmol·L-1 and 30 μmol·L-1 ZEA for 72 h

2.3 ZEA暴露改變了驢支持細(xì)胞基因表達(dá)模式

RNA-seq結(jié)果(圖3A)顯示：與對照組相比較，在10 μmol·L-1處理組檢測到803個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因共391個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因共412個(gè)；30 μmol·L-1處理組檢測到5 947個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因共2 816個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因共3 131個(gè)。與10 μmol·L-1ZEA處理組相比較，在30 μmol·L-1ZEA處理組中共檢測到5 218個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因共2 407個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因共2 811個(gè)(圖3B)。VENN分析結(jié)果顯示30 μmol·L-1ZEA處理組差異基因與10 μmol·L-1ZEA處理組差異基因存在顯著差異(圖3C)。因此，30 μmol·L-1ZEA處理組與10 μmol·L-1ZEA處理組支持細(xì)胞基因表達(dá)模式差異顯著。

A.ZEA 處理驢支持細(xì)胞差異表達(dá)基因火山圖；B.柱狀圖表示差異表達(dá)基因數(shù)目，紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)；C.VENN圖顯示對照組與ZEA處理組之間的差異基因個(gè)數(shù)。圖3 ZEA處理影響驢支持細(xì)胞基因表達(dá)模式Fig.3 The effect of ZEA treatment on gene expression of E. asinus sertoli cells

2.4 差異表達(dá)基因功能富集分析

為分析ZEA不同處理組差異表達(dá)基因的功能，分別將10 μmol·L-1ZEA 與30 μmol·L-1ZEA處理組中的差異表達(dá)基因進(jìn)行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)信號通路富集分析，設(shè)置P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因顯著性高的信號通路(圖4)。結(jié)果顯示：10 μmol·L-1ZEA 處理影響的生物進(jìn)程有cell cycle(細(xì)胞周期)、p53信號通路等 (圖4A)，30 μmol·L-1ZEA處理影響的生物進(jìn)程有PI3K-Akt信號通路、MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)信號通路、Ras信號通路、Apoptosis(程序性細(xì)胞死亡)以及TNF(腫瘤壞死因子)信號通路等 (圖4B)。下調(diào)的信號通路包括PI3K-Akt信號通路 (P=0.001 458 6，計(jì)數(shù)：22)、類固醇合成途徑 (P=0.007 337 7，計(jì)數(shù)：10)、細(xì)胞周期 (P=0.006 938 9，計(jì)數(shù)：21)等信號通路。

A.10 μmol·L-1 ZEA處理組DEGs KEGG信號通路富集分析氣泡圖；B.30 μmol·L-1 ZEA處理組DEGs KEGG信號通路富集分析氣泡圖。圖4 對 10 μmol·L-1 ZEA 與 30 μmol·L-1 ZEA處理組驢支持細(xì)胞差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號通路富集分析結(jié)果Fig.4 The results of KEGG signal pathway enrichment analysis on the differential genes expression of E. asinus sertoli cells in 10 μmol·L-1 and 30 μmol·L-1 ZEA treatment group

2.5 ZEA誘導(dǎo)驢支持細(xì)胞炎癥反應(yīng)并影響類固醇激素受體基因表達(dá)

對差異基因數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示：白介素-10受體因子A (IL 10 RA) 在ZEA處理組中表達(dá)量與對照組相比顯著升高；差異基因雌激素受體1 (ESR1) ZEA處理組中表達(dá)量與對照組相比顯著升高。為了驗(yàn)證該分析結(jié)果，我們使用細(xì)胞免疫熒光檢測ZEA處理后的驢支持細(xì)胞中炎癥反應(yīng)與類固醇激素受體相關(guān)差異基因蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，ZEA處理組顯著提高了支持細(xì)胞白介素-10受體因子A (IL 10 RA) 蛋白的相對表達(dá)水平(圖5)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，支持細(xì)胞中ESR 1蛋白表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相一致 (圖6)。

A.10 μmol·L-1 和30 μmol·L-1 ZEA處理組細(xì)胞免疫熒光檢測IL 10 RA的表達(dá) (綠色)；B.IL 10 RA蛋白陽性表達(dá)統(tǒng)計(jì)。圖5 細(xì)胞免疫熒光檢測ZEA影響驢支持細(xì)胞IL 10 RA蛋白的表達(dá)Fig.5 The effect of ZEA on IL 10 RA protein expression of E. asinus sertoli cells by ICC

A.10 μmol·L-1 和30 μmol·L-1 ZEA處理組細(xì)胞免疫熒光檢測ESR 1的表達(dá) (綠色)；B.ESR 1蛋白陽性表達(dá)統(tǒng)計(jì)。圖6 細(xì)胞免疫熒光檢測ZEA影響驢支持細(xì)胞ESR 1蛋白的表達(dá)Fig.6 The effect of ZEA on ESR 1 protein expression of E. asinus sertoli cells by ICC

3 討論

我國是全球唯一具備驢養(yǎng)殖、屠宰、加工及銷售等全產(chǎn)業(yè)鏈國家[24]。近年來，驢的功能與作用由役用逐步向肉用、藥用保健等多用途的“活體經(jīng)濟(jì)”方向轉(zhuǎn)型，且驢的飼養(yǎng)逐步向集約化養(yǎng)殖方向轉(zhuǎn)變。飼料中的霉菌毒素特別是ZEA污染已嚴(yán)重影響規(guī)?；曫B(yǎng)中驢的繁殖性能。本研究使用10 μmol·L-1和30 μmol·L-1濃度的ZEA連續(xù)72 h暴露體外培養(yǎng)的驢支持細(xì)胞，利用RNA-seq的手段分析并探討ZEA損害驢支持細(xì)胞發(fā)育并導(dǎo)致其凋亡的機(jī)制，采用TUNEL檢測、細(xì)胞免疫熒光與流式細(xì)胞檢測的方式驗(yàn)證了ZEA誘導(dǎo)驢支持細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

流式細(xì)胞檢測和TUNEL標(biāo)記結(jié)果顯示30 μmol·L-1濃度的ZEA處理顯著高于10 μmol·L-1驢支持細(xì)胞凋亡率，該結(jié)果與廖美芳[25]利用ZEA處理IPEC-J2細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡結(jié)果一致，也與利用ZEA誘導(dǎo)豬巨噬細(xì)胞凋亡的結(jié)果一致[26]。以上結(jié)果說明ZEA支持細(xì)胞發(fā)揮毒性作用具有呈劑量依賴性的特點(diǎn)。PI3K-Akt信號通路參與了多種生理過程，如細(xì)胞生長、增殖、運(yùn)動和代謝等[27]，還可能與多種類型細(xì)胞的炎癥反應(yīng)與癌變息息相關(guān)[28]。本研究結(jié)果顯示：ZEA處理支持細(xì)胞通過PI3K-Akt信號通路影響了與細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)：CDK1和CCNB1基因的mRNA表達(dá)量均顯著提高[29]；KEGG富集分析結(jié)果顯示，30 μmol·L-1的ZEA處理組DEGs多富集在Hippo信號通路，該結(jié)果與Zhang等[30]報(bào)道結(jié)果相符。另有研究表明，ZEA暴露可影響糖酵解過程，進(jìn)而干擾大鼠支持細(xì)胞內(nèi)乳酸合成，并可能影響雄性大鼠的繁殖機(jī)能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，ZEA處理后支持細(xì)胞內(nèi)PGK1和PFKM基因mRNA相對表達(dá)量顯著提高，這表明ZEA暴露可能導(dǎo)致驢支持細(xì)胞內(nèi)糖酵解進(jìn)程加快，支持細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)與能量代謝發(fā)生異常，進(jìn)而可能促進(jìn)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的發(fā)生或腫瘤的形成。

腫瘤的形成與發(fā)展和細(xì)胞周期異常密切相關(guān)[31-32]。ZEA處理后支持細(xì)胞KEGG分析結(jié)果顯示其細(xì)胞周期通路相關(guān)基因的表達(dá)顯著異常 (圖4)。這一結(jié)果說明ZEA可能通過影響細(xì)胞周期通路內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致驢支持細(xì)胞基因表達(dá)模式改變，最終可能增加家畜睪丸癌變的風(fēng)險(xiǎn)。有報(bào)道表明[33]，LIN28A基因是睪丸內(nèi)腫瘤發(fā)生的標(biāo)記基因。另外，GADD45B基因在多種腫瘤中均被檢測到過表達(dá)，該基因參與調(diào)控細(xì)胞生存，DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期停滯，并與腫瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象密切相關(guān)[34]。結(jié)果顯示，ZEA處理后，支持細(xì)胞LIN28A、GADD45B基因的mRNA表達(dá)量均顯著升高，這說明ZEA具有導(dǎo)致支持細(xì)胞發(fā)生癌變風(fēng)險(xiǎn)的可能。KEGG分析結(jié)果得知，ZEA可引起IL17信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等炎癥相關(guān)信號通路上調(diào)。此外，KEGG結(jié)果顯示ZEA顯著下調(diào)細(xì)胞代謝及DNA復(fù)制相關(guān)信號通路 (圖4)，諸如半胱氨酸和蛋氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、DNA復(fù)制、同源重組等。這些結(jié)果表明ZEA可能引起驢睪丸支持細(xì)胞的炎癥反應(yīng) (圖5)，并干擾細(xì)胞正常代謝和DNA復(fù)制，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

支持細(xì)胞能夠合成并分泌多種激素[35]。磷酸戊糖途徑在支持細(xì)胞中較為活躍，該途徑可提供膽固醇、類固醇激素等合成所需的能量因子如NADPH+H+[36]。G6PD是該途徑氧化反應(yīng)階段的限速酶，能催化葡萄糖-6-磷酸形成6-磷酸葡萄糖酸-δ-內(nèi)脂，進(jìn)一步使NADP+還原形成NADPH+H+[37]。另外，關(guān)鍵酶DHCR24可進(jìn)一步催化合成膽固醇[38]。KEGG結(jié)果表明，ZEA顯著影響了磷酸戊糖途徑和類固醇生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)。由此可知，ZEA可能通過PI3K-Akt信號通路抑制磷酸戊糖途徑，降低NADPH+H+的合成進(jìn)而影響驢支持細(xì)胞類固醇激素的合成，且ZEA處理后支持細(xì)胞ESR1基因的蛋白表達(dá)顯著升高 (圖6)。因此，ZEA可能通過干擾類固醇或受體合成途徑影響睪丸的發(fā)育及家畜的繁殖性能。

總之，本研究首次利用RNA-seq手段分析探究了ZEA暴露改變驢支持細(xì)胞基因表達(dá)模式的毒性作用，該毒性作用具有呈劑量依賴性的特點(diǎn)。此外，ZEA暴露導(dǎo)致支持細(xì)胞凋亡增加，類固醇激素受體表達(dá)異常。且ZEA暴露可能通過影響支持細(xì)胞中凋亡和類固醇激素受體合成等過程關(guān)鍵基因的表達(dá)，直接或間接影響了睪丸發(fā)育和激素受體合成等生物學(xué)過程。30 μmol·L-1ZEA暴露能夠誘導(dǎo)驢支持細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而可能損害驢睪丸發(fā)育和誘導(dǎo)睪丸病變的潛在危害；另外，相同劑量ZEA暴露下，支持細(xì)胞存在被致癌的可能性。本研究將為國家或地方制定馬屬動物飼草料中ZEA含量標(biāo)準(zhǔn)提供理論借鑒，并對研究ZEA等霉菌毒素影響家畜睪丸發(fā)育提供新的研究思路。