煙草生長調節(jié)作用叢枝菌根真菌的篩選

胡彥江，夏淑春，鄢洪海，金靜，張茹琴

(1.青島農業(yè)大學生命科學學院，山東青島 266109；2.青島農業(yè)大學植物醫(yī)學學院/山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室)

煙草(NicotianatobacumL.)是重要的經濟及藥用作物[1]，2020年我國煙草行業(yè)實現(xiàn)工商稅利總額12 803億元，在國民稅收中占較大的比例，為國家和地方財政增收、經濟發(fā)展做出了積極貢獻[2]。我國煙草種植面積和產量居世界首位，每年需要大量的煙苗用于移栽[3]。育苗是煙草生產的重要環(huán)節(jié)，培育生長整齊、健壯無病的煙苗是實現(xiàn)煙葉優(yōu)質、適產、高效、低成本生產的基礎[4-6]。目前，生產上主要采用漂浮育苗技術培育煙苗[4]，但因整個育苗過程在溫室中進行，空氣溫濕度較大，基質中養(yǎng)分和水分充足，煙葉生長過快，導致煙苗柔嫩、抗逆性差，且因地上部分生長較快，影響了根系的發(fā)育，因此必須通過一定的控苗技術達到壯苗的目的。目前生產上主要采用剪葉和化控技術來控制煙苗的旺長，前者在煙草漂浮育苗過程中一般進行3～5次，增加了勞動強度、用工成本及花葉病毒病的傳播概率，后者易對環(huán)境及煙草產品造成污染[5-6]。

叢枝菌根(arbuscular mycorrhizae，AM)真菌是土壤中的一種有益微生物，80%以上的陸生植物能與其形成共生體[7]。在菌根共生體中，寄主植物為AM真菌提供光合產物，而AM真菌從土壤中吸取水分和礦質營養(yǎng)輸送給其寄主植物，促進植物的生長、改善土壤營養(yǎng)狀況、調節(jié)植物激素、改變植物根系形態(tài)，從而提高植物的產量、質量和抗逆性[8]，但偶爾也有菌根對寄主植物的生長無影響甚至抑制生長的報道[8-9]。煙草由于能與AM真菌形成良好的共生關系，是研究較多的模式作物之一[10-11]。目前從煙草根系土壤分離報道的AM真菌已達13屬54種，表明煙草栽培的潛在AM真菌資源較為豐富[11]。AM真菌對煙草育苗、生長發(fā)育、養(yǎng)分吸收、抗脅迫能力以及抗病蟲害能力等研究報道較多[1-3,10-13]。利用漂浮育苗技術在煙草播種時接種AM真菌，有助于培育壯苗，菌根煙苗移栽后，可較早地發(fā)揮菌根效應，促進煙苗根系的生長發(fā)育和形態(tài)建成，并縮短緩苗期，為生產高產優(yōu)質烤煙奠定了基礎[13]。

作者在試驗中發(fā)現(xiàn)，煙草播種時接種AM真菌，菌根煙苗株高、葉面積等均小于非菌根煙苗?；谏鲜鲅芯勘尘?，提出了一個假設：在煙草播種時接種AM真菌，是否可利用菌根共生關系建立早期AM真菌消耗煙草營養(yǎng)達到控苗的目的。因此，本試驗以烤煙‘K326’為供試品種，以12株AM真菌為供試菌種，在穴盤播種時接種AM真菌，研究菌根對不同生長期煙草生長的影響，以期篩選出能控苗的AM菌種，達到利用生物技術調節(jié)煙草生長的目的，這對于實現(xiàn)煙葉生產可持續(xù)性發(fā)展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試煙草品種

選用生產上主栽烤煙品種‘K326’包衣種，種子由中國煙草總公司云南省煙草公司玉溪市公司提供。

1.1.2 供試AM真菌及其菌劑制作

供試的12株AM真菌，包括1株幼套近明球囊霉(Claroideoglomusetunicatum)(編號AM1)，11株摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)(編號分別為AM2、AM3、AM4、AM5、AM6、AM7、AM8、AM9、AM10、AM11和AM12，簡寫為AM2至AM12，下同)，其中菌株AM12購自北京市農林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所，其他菌株由同行贈送，均保藏于青島農業(yè)大學植物病生理學研究室。

接種前先將12株AM真菌進行擴繁培養(yǎng)。擴繁培養(yǎng)基質為園土和河沙(體積比1∶1)，121 ℃ 0.1 MPa蒸汽滅菌2 h，放置約7 d后混勻裝入花盆(23 cm×20 cm×16 cm)，每盆先裝入2 000 g擴繁基質，然后接種50 g AM菌劑，其上撒白三葉草(TrifoliumrepensL.)種子，上覆約1 cm厚滅菌河沙，每周澆1次霍格蘭(Hoagland)營養(yǎng)液，其他均常規(guī)管理。播種后4個月時，用土壤鉆隨機挖取三葉草根系，剪成1 cm長的根段，染色后檢查菌根形成情況[14]。待形成泡囊、叢枝及孢子等結構時，剪去三葉草地上部，將基質、剪碎的根系混合均勻作為菌劑，裝入布袋保存在陰涼干燥的地方，待接種煙草用。

1.1.3 培養(yǎng)基質

河沙、草炭土、園土按體積比1∶1∶1混合，高溫高壓(121 ℃)滅菌2 h后用作煙草培養(yǎng)基質。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

在煙草培養(yǎng)基質中分別接種12個AM菌劑，另設不接種AM菌劑的處理為非菌根對照(CK)，共13個處理(CK、AM1至AM12)；采用50(5×10)穴盤育苗，每處理25穴(出苗后定植為每穴1株)；隨機排列，重復3次。

參考劉潤進等[14]的培養(yǎng)基質接種法，先在質量分數(shù)10%次氯酸鈉消毒的育苗盤穴中裝入等量的滅菌培養(yǎng)基質，在其上加入50 g AM菌劑，然后每穴均勻地撒上5粒煙草種子，再在上面撒上1 cm厚的培養(yǎng)基質覆蓋種子。澆透水后放置在溫室內培養(yǎng)，不同處理隨機放置。待出苗后定植至每穴1株煙苗。育苗期間，每周澆一次Hoagland營養(yǎng)液，每3 d左右澆一次水，其他常規(guī)管理。

1.2.2 煙草根系AM真菌侵染率測定

煙草播種后90 d，隨機挖取煙草根樣，流水沖洗掉根上的基質顆粒后，將根剪成1 cm長的根段進行染色。用鑷子和挑針將粗細一致的根段整齊地排列在載玻片上，每個載玻片排列25條根段，載玻片加蓋玻片[14]。在Leica DM750數(shù)碼顯微鏡(徠卡，德國)下觀察根外菌絲及孢子形成情況，然后輕敲蓋玻片壓裂根組織以便觀察根內叢枝、泡囊及菌絲等結構的形成情況并拍照。每處理觀察50個根段。AM真菌侵染率為真菌侵染根段數(shù)占調查總根段數(shù)的百分率[15]。

1.2.3 煙苗生長指標的測定

分別于接種后10 d、20 d、30 d、40 d、60 d、90 d，用軟尺測量煙草莖基部到莖尖生長點的長度作為株高。參考秦麗娟[16]的方法，模擬株高擬合曲線y，以下式計算株高生長率變化率y″，

接種后90 d，用游標卡尺測量煙草地徑。剪取地上部，置于80 ℃烘箱烘至恒重，用電子天平稱其干重作為生物量。

1.2.4 煙苗葉綠素含量測定

葉綠素含量用紫外分光光度法測定[17]。接種后90 d，取煙草從上往下數(shù)第四葉，用自來水沖洗葉表面浮塵，去掉中脈，將其剪碎后混勻。稱取剪碎的新鮮樣品0.2 g放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2.5 mL 體積分數(shù)95%乙醇，研成勻漿后再加入10 mL 95%乙醇，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3 min后，取1張濾紙置于漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻璃棒將提取液倒入漏斗中，過濾到25 mL棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣3次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中，直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至25 mL，搖勻。將提取液倒入光徑1 cm的比色杯內。以95%乙醇為空白對照，在波長665 nm、649 nm下測定吸光值A665、A649。根據(jù)吸光值用下式計算葉綠素a、b的提取濃度：

Ca=13.95A665-6.88A649；

Cb=24.96A649-7.32A665；

Ct=Ca+Cb；

葉綠素含量(mg/g)=Ct×V×N/W

其中，V表示提取液體積(L)，N表示稀釋倍數(shù)，W表示樣品鮮重(g)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 20.0數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 煙草菌根侵染率測定

煙草‘K326’播種后90 d測定菌根侵染率，發(fā)現(xiàn)12個AM菌劑接種的煙草根系均被侵染(圖1)，形成典型的泡囊、叢枝、外延菌絲及孢子等結構，菌根侵染率為100%。但在未接種AM菌劑的對照(CK)煙苗根系中未觀測到AM真菌結構。結果表明這12株AM真菌均能侵染‘K326’煙苗根系。

圖1 部分AM真菌侵染煙草‘K326’根系狀況Fig.1 Parts of AM fungi colonization of tobacco‘K326’roots

2.2 AM真菌對煙苗生長的影響

與對照相比，12個AM菌劑接種對煙苗株高均有顯著的影響(圖2，表1)。接種后30 d，所有菌根苗株高均小于對照(圖2A)；而接種后90 d，不同處理間株高有極顯著的差異(P<0.01)(圖2B)，其中AM3、AM4、AM6至AM10和AM12菌根煙苗株高均大于對照(表1)，煙苗生長速率變化率y″均大于0，分別為0.50、0.12、0.08、0.34、0.87、0.23、0.79和0.36，尤以AM3、AM7、AM8、AM10和AM12菌根煙苗y″增加顯著。而AM1、AM2、AM5、AM11與對照煙苗y″均小于0，分別為-0.12、-0.40、-0.15、-0.08與-0.01。上述結果表明，12株AM真菌侵染早期均能矮化煙苗，但在生長后期，AM3、AM4、AM6至AM10和AM12反而促進煙苗株高生長，促生效果從大到小依此為AM8>AM10>AM3>AM12>AM7>AM9>AM4>AM6。

A.AM真菌接種后30 d；B.AM真菌接種后90 d圖2 AM真菌對不同生長期煙草‘K326’株高的影響Fig.2 Effect of AM fungi on the plant height of tobacco ‘K326’ at different stages of growth

接種后90 d，不同菌根煙苗間地徑有極顯著的差異(P<0.01)(表1)，除AM6和AM11菌根煙苗外，AM1至AM5、AM7至AM10和AM12地徑均極顯著大于對照。表明AM1至AM5、AM7至AM10和AM12真菌侵染均極顯著地促進‘K326’煙苗地徑的生長，AM8促進效果極顯著大于AM2至AM5、AM9、AM10和AM12，但與AM1和AM7間無極顯著差異(P≥0.01)。

接種后90 d，不同AM菌劑接種對‘K326’煙苗生物量也有極顯著影響(P<0.01)(表1)，其中AM1、AM3、AM7和AM8菌根煙苗生物量均極顯著大于對照，而其他菌根煙苗生物量與對照無極顯著的差異(P≥0.01)。表明AM1、AM3、AM7和AM8菌劑接種均能極顯著地增加‘K326’煙苗的生物量，但這四個處理間無極顯著差異。

2.3 AM真菌對煙苗葉片葉綠素含量的影響

接種后90 d，不同菌根煙草間葉綠素含量有極顯著的差異(P<0.01)(表1)，其中AM1、AM2、AM4、AM5和AM7葉綠素含量均極顯著大于對照，而其他處理與對照無顯著差異(P<0.01)。表明菌根AM1、AM2、AM4、AM5和AM7均極顯著地提高了‘K326’煙苗葉綠素的含量，但這五個處理間無極顯著差異(P≥0.01)。

表1 AM真菌對煙草‘K326’生長及葉綠素含量的影響Table 1 Effects of AM fungi on the growth and the chlorophyll content of tobacco ‘K326’

2.4 Pearson相關性分析

不同AM煙草生物量與株高間、葉綠素含量與株高間、葉綠素含量與地徑間均無顯著相關性(P>0.05)(表2)，而煙草生物量與地徑間、生物量與葉綠素含量間有顯著相關性(P<0.05)，相關系數(shù)分別為0.757 7、0.587 2。這表明菌根煙草生物量、地徑的增加與葉綠素含量呈顯著正相關。

表2 株高、地徑、生物量及葉綠素含量間的相關性Table 2 Correlation between plant height,ground diameter,biomass and chlorophyll content

3 討論

植物播種期接種AM真菌具有矮化苗木的作用，原因是AM真菌從與寄主根系識別、侵染、形成菌根、再到發(fā)揮菌根效應需要一定的時間[13,18-19]。一般而言，從接種到大量出現(xiàn)根外菌絲至少需要35～45 d[13]。在此之前，AM真菌基本處于寄生狀態(tài)，不僅不發(fā)揮菌根效應，而且還要消耗寄主4%～20%的光合產物，用于菌絲生長發(fā)育[8-9,13]。本試驗中，在煙草‘K326’接種后30 d，發(fā)現(xiàn)12個供試AM菌劑接種均有矮化煙苗的作用，其結果與前人的報道基本一致[9,13]。接種后90 d，與對照相比，AM3、AM4、AM6至AM10和AM12均極顯著地促進了煙草株高生長，其效果從大到小依次為AM8>AM10>AM3>AM12>AM7>AM9>AM4>AM6；除AM6和AM11外，其他10個AM菌劑均極顯著地促進了煙苗地徑的生長，其中AM8促進效果極顯著大于AM2至AM5、AM9、AM10和AM12，但與AM1和AM7無極顯著差異；AM1、AM3、AM7和AM8菌根煙草生物量均極顯著地增加，但這四者間無極顯著差異；AM1、AM2、AM4、AM5和AM7菌根煙葉葉綠素含量極顯著地增加，而這五者間無極顯著差異。Pearson相關性分析表明，‘K326’生物量與地徑間、生物量與葉綠素含量間呈顯著正相關。因此，分析煙草生長后期生物量增加的主要原因是接種AM菌劑提高了煙葉葉綠素含量，從而導致地徑增加。

大量研究表明，接種AM真菌可促進煙草光合作用從而促進其生長[13,18-21]，增加其礦質營養(yǎng)含量和抗氧化能力[22]，甚至在嚴重干旱脅迫下，還可促進煙草的生長、提高其精油、次生代謝產物及產量[1]。在中煙100或秦煙96上施用100 kg/hm2摩西斗管囊霉或根內根孢囊霉菌劑，促進了煙草的生長發(fā)育，提高了煙葉的產量、產值，改善了煙葉內在化學成分的協(xié)調性[19]。菌根還可有效地促進烤煙根系形態(tài)的發(fā)育，優(yōu)化根系結構，進而促進煙株對養(yǎng)分的吸收和積累，干物質累積量、株高、最大根長、根表面積、根體積、總根長、根尖數(shù)及養(yǎng)分吸收量均得到不同程度提高[13,19]。在生產研究中，應用不同的技術來培育煙草壯苗[3-6,13]，但尚未見有利用AM真菌控苗的研究報道。

在本次試驗中，烤煙‘K326’播種時接種AM1、AM3、AM7和AM8，在生長早期均能矮化煙苗，達到控旺的目標，在生長后期通過提高煙草葉綠素含量和地徑生長，從而提高其生物量，達到調節(jié)煙草生長的目的。這種生物控苗技術具有潛在的生產應用價值，在大規(guī)模漂浮育苗以及移栽后大田培育過程中，接種適宜的AM真菌是培育壯苗、提高肥料利用的一種經濟有效的方法。