人乳庫捐贈人乳病原學(xué)譜分析及關(guān)鍵風(fēng)險控制

劉 可，劉智勇，陳旭飛，王柔芝，王 丹 400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第一附屬醫(yī)院：婦產(chǎn)科，檢驗科

嬰兒喂養(yǎng)首選母乳，當(dāng)親母母乳不能成為新生兒喂養(yǎng)的第一選擇時，世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦選擇來自健康的產(chǎn)婦或人乳庫(human milk bank)的捐贈人乳(donor human milk,DHM)[1]。人乳庫是收集DHM，并負責(zé)人乳消毒、加工、檢測、儲存、分配使用等的專業(yè)機構(gòu)。建立人乳庫是收集DHM的重要方式，可使母乳缺失或母乳不足的新生兒能獲得母乳喂養(yǎng)。自1909年奧地利建立首家人乳庫以來，全球已建立600余家人乳庫[2]，截止2019年我國大陸地區(qū)共建立19家人乳庫[3]。

人乳是一種生物產(chǎn)品，從采集、儲存、加工到食用的過程中出現(xiàn)污染很常見，DHM的分享存在病毒或病原體傳播的風(fēng)險。中國大陸地區(qū)人乳庫運行質(zhì)量與安全管理專家的建議中提出巴氏消毒是DHM質(zhì)量的關(guān)鍵風(fēng)險控制點[4]。微生物學(xué)檢測可對DHM巴氏消毒效果進行驗證及篩選，人乳庫環(huán)境感染控制可保障DHM滅菌條件[5]。2020年7月中國營養(yǎng)學(xué)會發(fā)布了醫(yī)療機構(gòu)人乳庫建立與管理規(guī)范團體標準[6]，但目前各地人乳庫DHM微生物學(xué)檢測方法及環(huán)境感控效果檢測尚無統(tǒng)一規(guī)范，DHM病原學(xué)譜分析及人乳庫環(huán)境衛(wèi)生相關(guān)研究較為缺乏。因此，本研究回顧性分析我院人乳庫DHM的微生物學(xué)檢測結(jié)果及環(huán)境衛(wèi)生學(xué)監(jiān)測結(jié)果，探討采用液體增菌培養(yǎng)方法對DHM進行微生物學(xué)檢測，并對人乳庫進行環(huán)境感控監(jiān)測，以期有效預(yù)防、消除DHM的潛在風(fēng)險，為人乳庫運行質(zhì)量安全管理、風(fēng)險控制措施提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年12月至2021年12月在陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院人乳庫捐贈的1 601例DHM，均為本院住院分娩的健康產(chǎn)婦無償捐贈，并簽署捐乳知情同意書。納入標準：①捐贈資格符合《2013年北美母乳庫建立和運行管理指南》及T/CNSS 2020-003《醫(yī)療機構(gòu)人乳庫建立與管理規(guī)范》中捐贈篩查要求；②冷凍儲存不超過3個月，冷藏儲存不超過24 h;③捐贈乳儲存環(huán)境符合要求：獨立區(qū)域放置且冷藏儲存溫度為4 ℃，冷凍儲存溫度為-20 ℃。排除標準： ①儲奶容器有破損或可疑污染；②外觀可見異物或性狀異常。本研究已獲得陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準[(B)KY202239]。

1.2 方法

1.2.1 微生物學(xué)檢測方法 采用液體增菌培養(yǎng)法進行DHM微生物學(xué)檢測，培養(yǎng)皿使用血培養(yǎng)瓶。隨機抽取同一捐贈者的同一批次DHM，全部混裝后用無菌注射器抽吸乳汁樣本，分別注入?yún)捬跖囵B(yǎng)瓶及需氧培養(yǎng)瓶各8～10 mL進行孵育。培養(yǎng)基采用Thermo Scientific液體微生物培養(yǎng)基，35～37 ℃孵育120 h，檢測儀器使用Thermo ScientificTM、 VersaTREKTM528、VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定系統(tǒng)及VITEKMS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對標本進行菌種鑒定。參照全國臨床微生物檢驗操作標準流程進行采樣及細菌的分離培養(yǎng)，藥敏標準參照美國抗微生物藥物敏感性試驗操作方法和判斷標準(CISIM-100)。

1.2.2 環(huán)境衛(wèi)生學(xué)檢測方法 醫(yī)院感控專職人員每月對人乳庫進行環(huán)境衛(wèi)生學(xué)檢測，檢測項目包括室內(nèi)空氣、物體表面、人乳庫工作人員手、咽拭子共4項。①空氣采樣：消毒或規(guī)定通風(fēng)換氣后且無人走動的情況下靜止10 min采樣，采樣高度距離地面0.8～1.5 m，放在采樣位置暴露5 min，采樣完成后標記培養(yǎng)區(qū)域及時送檢；②物體表面：用5 cm×5 cm滅菌規(guī)格板放在被檢物體表面，用浸有無菌0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液棉拭子在規(guī)格板內(nèi)橫豎往返各涂5次，連續(xù)采樣1～4個規(guī)格板面積，將棉拭子放入裝有10 mL無菌檢驗用洗脫液的試管內(nèi)送檢；③工作人員手：人乳庫工作人員進行衛(wèi)生手消毒后，用浸有無菌0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液棉拭子在手指曲面從指根到指端來回涂擦各2次，一只手涂擦面積約30 cm2，將棉拭子放入10 mL采樣液試管內(nèi)及時送檢；④咽拭子：選擇人乳庫工作人員，使其暴露喉嚨，無菌拭子輕柔迅速擦拭雙側(cè)咽扁桃體和咽后壁3次，將拭子垂直放入試管內(nèi)，避免擦拭瓶口，及時送檢。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有原始數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)整理與分析，描述性統(tǒng)計方法，分類數(shù)據(jù)采用例數(shù)和百分率n(%)，兩組間分類資料比較采用卡方檢驗，不同年份間分類資料間分布采用卡方趨勢檢驗，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DHM微生物學(xué)檢測結(jié)果

2.1.1 消毒前DHM病原體分布情況 共送檢1 601例DHM樣本，巴氏消毒前組共866例。消毒前DHM樣本共培養(yǎng)出病原體644株，占比74.36%，無病原體生長222例，占比25.64%。檢出革蘭陽性菌334株，占比51.86%,革蘭陰性菌235株，占比36.49%，疑似污染73例，占比11.34%，真菌2株，占比0.31%。共檢出兩種厭氧菌：產(chǎn)氣莢膜梭菌(3株)、第三梭菌(1株)，菌種分布見表1。消毒前DHM樣本病原體檢出株數(shù)最多的前10位中，前3位分別是表皮葡萄球菌(89株)、鮑曼不動桿菌(59株)、金黃色葡萄球菌(18株)，病原體檢出株數(shù)前10位統(tǒng)計情況見圖1。

表1 消毒前DHM菌種分布情況及構(gòu)成比 (n=644)

圖1 消毒前DHM病原體檢出株數(shù)前10位統(tǒng)計情況

2.1.2 消毒后DHM病原體分布情況 巴氏消毒后組共735例DHM樣本，培養(yǎng)出病原體92株，占比12.52%，無病原體生長643例，占比87.48%。檢出病原體中革蘭陽性菌59株，占比64.13%,革蘭陰性菌33株，占比35.87%。消毒后DHM樣本檢出兩種厭氧菌：產(chǎn)氣莢膜梭菌(1株)、第三梭菌(1株)，菌種分布見表2。病原體檢出株數(shù)最多的前10位中，前3位分別是蠟樣芽孢桿菌(23株)、芽孢桿菌屬(12株)、表皮葡萄球菌(7株)，檢出病原體株數(shù)前10位統(tǒng)計情況見圖2。

圖2 消毒后DHM病原體檢出株數(shù)前10位統(tǒng)計情況

表2 消毒后DHM菌種分布情況及構(gòu)成比 (n=92)

2.1.3 DHM消毒前后微生物學(xué)檢測結(jié)果對比 巴氏消毒后的病原體檢出率明顯低于巴氏消毒前，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=612.283，P<0.01)。消毒后致病菌檢出率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=418.154，P<0.01)，見表3。

表3 DHM消毒前后微生物學(xué)檢測結(jié)果對比 [n(%)]

2.2 環(huán)境衛(wèi)生學(xué)檢測結(jié)果

2015-2021年人乳庫空氣、物體表面、工作人員手、咽拭子進行Ⅱ類環(huán)境監(jiān)測，檢測結(jié)果經(jīng)過卡方趨勢檢驗，人乳庫空氣合格率顯著提升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，物體表面、工作人員手檢測、工作人員咽拭子檢測合格率逐年遞增，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 人乳庫Ⅱ類環(huán)境衛(wèi)生學(xué)檢測結(jié)果

3 討論

3.1 巴氏消毒是保證DHM質(zhì)量安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

母乳并非無菌，研究表明采集人乳中，>75%的人乳樣本有細菌生長[7]。本次調(diào)查結(jié)果顯示，74.36%的DHM在巴氏消毒前存在病原體。檢出的病原體中75.8%為致病菌，檢出菌株數(shù)的前三位中包括鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌兩種致病菌。鮑曼不動桿菌是臨床最重要的致病菌之一，可引起醫(yī)院獲得性肺炎、血流感染、腹腔感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染、皮膚軟組織感染等[8]。若喂養(yǎng)污染的DHM可能導(dǎo)致新生兒敗血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎等不良后果，尤其對早產(chǎn)兒及低體重出生兒危害更大。疑因喂養(yǎng)污染采集母乳引起的新生兒敗血癥及壞死性小腸結(jié)腸炎的病例報道并非少見[9-10]。本次調(diào)查結(jié)果顯示，經(jīng)巴氏消毒后DHM病原體檢出率明顯降低，且消毒后檢出的病原體中，致病菌檢出率降低。因此，對DHM進行巴氏消毒，有效消滅人乳中本身存在或加工處理過程中可能污染的細菌，是保證DHM質(zhì)量安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

3.2 采用嚴格的微生物學(xué)檢測方法，提高DHM病原體檢出率是關(guān)鍵控制點

采用液體增菌培養(yǎng)法對DHM進行嚴格的微生物學(xué)檢測篩選，可提高病原體檢出率，有利于監(jiān)控巴氏消毒效果，篩選出不合格DHM進行丟棄銷毀。本次調(diào)查中12.5%的DHM因消毒后仍存在細菌而被丟棄。澳大利亞Perron Rotary Express人乳庫4年間數(shù)據(jù)顯示，有26%的巴氏消毒人乳因嚴格微生物學(xué)檢測篩選被丟棄[11]。本次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)DHM中檢出了金黃色葡萄球菌及坂崎腸桿菌，食品安全國家標準微生物檢驗技術(shù)[12-14]中對于該類細菌均推薦進行增菌培養(yǎng)。同時，延長細菌培養(yǎng)時間，可降低假陰性風(fēng)險。本次調(diào)查檢出細菌中包括苛養(yǎng)菌諾卡菌屬，此類細菌生長速度緩慢，一般5～7 d可見菌落，所需培養(yǎng)時間較長[15]。并且對DHM樣本同時進行需氧和厭氧培養(yǎng)，可以提高厭氧菌檢出率。本次調(diào)查中DHM檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌和第三梭菌兩種厭氧菌，其中產(chǎn)氣莢膜梭菌是人類氣性壞疽的主要細菌，所致疾病包括氣性壞疽、食物中毒，引起壞死性結(jié)腸炎等嚴重后果。該菌需在厭氧環(huán)境進行培養(yǎng)，可形成芽孢，能耐受100 ℃、30 min的加熱[16]，無法通過巴氏消毒完全殺滅。本次調(diào)查結(jié)果顯示，產(chǎn)氣莢膜梭菌生長的DHM樣本消毒前后的微生物檢測結(jié)果中，需氧培養(yǎng)基結(jié)果均為陰性，而厭氧培養(yǎng)基結(jié)果為陽性，我院檢驗科立即報危急值，人乳庫啟動追溯及召回程序，對DHM緊急溯源、召回，人乳庫封庫采樣后終末消毒，未造成不良后果。因此，對DHM進行嚴格的微生物學(xué)檢測，使用液體增菌培養(yǎng)，延長培養(yǎng)時間，需氧和厭氧培養(yǎng)同時進行，嚴格病原體篩選，是控制DHM質(zhì)量的最后環(huán)節(jié)，可預(yù)防及消除DHM安全危害，是保證DHM質(zhì)量安全的關(guān)鍵控制點。

3.3 加強環(huán)境清潔消毒，提高人乳庫環(huán)境衛(wèi)生檢測合格率，是確保人乳庫運行安全的關(guān)鍵風(fēng)險控制點

對DHM的處理區(qū)域進行清潔和消毒的過程及評價應(yīng)依照醫(yī)療機構(gòu)環(huán)境表面清潔與消毒管理規(guī)范和醫(yī)院感染預(yù)防與評價規(guī)范執(zhí)行[6]。2019年我院人乳庫改為使用醫(yī)用等離子體空氣消毒器每日進行2次空氣循環(huán)消毒，環(huán)境衛(wèi)生學(xué)檢測結(jié)果顯示自2019年起人乳庫空氣培養(yǎng)合格率顯著提高。2020年我院人乳庫參照我國最新頒布的人乳庫團體標準對操作區(qū)域物體表面、超凈臺、冰箱、巴氏消毒水浴箱等儀器設(shè)備校準和消毒方式以及人乳庫操作人員工作規(guī)范進行了調(diào)整和細化，環(huán)境衛(wèi)生學(xué)檢測結(jié)果顯示，2020年起，我院人乳庫物體表面和操作人員手衛(wèi)生及咽拭子檢測合格率均逐年上升。規(guī)范人乳庫環(huán)境清潔與消毒，按照Ⅱ類環(huán)境進行環(huán)境衛(wèi)生學(xué)監(jiān)測，是保障DHM在加工、消毒、儲存和分裝等環(huán)節(jié)的質(zhì)量安全的關(guān)鍵控制點。

3.4 研究局限及結(jié)論

本研究的不足之處在于，只對DHM微生物檢測實驗方法進行了探討，未觀測DHM微生物檢測時機及采樣方式是否對檢測結(jié)果及DHM質(zhì)量造成影響。例如DHM微生物檢測是采用隨機抽樣混裝后采樣，還是全批次混裝后采樣進行檢測，仍需進一步探索。

綜上所述，本研究表明：對DHM進行嚴格的微生物學(xué)檢測，加強人乳庫環(huán)境衛(wèi)生學(xué)監(jiān)測可以提高DHM質(zhì)量，有效預(yù)防、消除DHM安全危害。我國人乳庫發(fā)展建設(shè)正處于起步階段，也是快速發(fā)展階段，對潛在危害因素進行風(fēng)險評估，確定控制措施，才能切實保障人乳庫運行質(zhì)量，保證提供更安全優(yōu)質(zhì)的DHM，推動人乳庫可持續(xù)發(fā)展，使新生兒受益。