不同劑量分割放射治療對(duì)直腸癌細(xì)胞促血管生成作用的比較研究

童潮旭，張 濤，龔惠英，毛偉靈，李龍浩 400016 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科

大腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上常見的惡性腫瘤之一，按部位可分為結(jié)腸癌和直腸癌，其中直腸癌約占60%以上[1]。臨床實(shí)踐中，直腸癌患者就診時(shí)往往已屬中晚期[2]，而放射治療在中晚期直腸癌的治療中有著重要地位。術(shù)前放療能縮小腫瘤的體積，降低其臨床分期，為患者爭(zhēng)取根治性切除的機(jī)會(huì)，并降低術(shù)后局部復(fù)發(fā)率；同時(shí)對(duì)于低位直腸癌，術(shù)前放療可能通過(guò)提高保肛率來(lái)使患者的生活質(zhì)量得到提高[3-4]。目前局部晚期直腸癌的術(shù)前放療主要有長(zhǎng)程放療(1.8～2.0 Gy×25次，5～5.5周完成)和短程放療(5 Gy×5次，1周完成)兩種模式[5]。兩種模式的主要區(qū)別為單次劑量的照射強(qiáng)度和照射次數(shù)，即前者為常規(guī)分割多分次照射，而后者為大分割少分次照射。

腫瘤生長(zhǎng)依賴于腫瘤血管的生成[6]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)擁有維持血管內(nèi)皮細(xì)胞活性和誘導(dǎo)其增殖等多種功能，并在大多數(shù)癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，是腫瘤血管生成最重要的刺激因子[7-8]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1-alpha，HIF-1α)是VEGF的重要調(diào)控因子，HIF-1α/VEGF 軸是低氧激活腫瘤血管生成的主要機(jī)制[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，放射輻照同樣能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)，激活HIF-1α /VEGF 通路[11]，但目前關(guān)于不同劑量放射輻照對(duì)直腸癌腫瘤血管生成影響的研究較少。本研究在臨床樣本中發(fā)現(xiàn)，不同劑量分割模式的放療對(duì)直腸癌腫瘤血管生成的影響可能存在差異，并通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討不同劑量分割放射治療對(duì)直腸癌血管生成的影響，以期為直腸癌放療方案的優(yōu)化提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例和組織標(biāo)本 收集2017-2020年重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科經(jīng)病理確診為直腸癌的患者56例，其中男性32例，女性24例，年齡44～74(61.00±9.90) 歲?；颊呔M(jìn)行術(shù)前新輔助放療，在放療結(jié)束后6～8周內(nèi)完成手術(shù)治療，且在術(shù)后由病理科進(jìn)行病理的腫瘤退縮評(píng)級(jí)(tumor regression grade，TRG)。根據(jù)術(shù)前放療方案分為兩組：常規(guī)分割放療組(總劑量50 Gy，單次劑量2 Gy，共進(jìn)行25次，每周5次，5周內(nèi)完成)42例，大分割放療組(總劑量為25 Gy，單次劑量5 Gy，共進(jìn)行5次，1周內(nèi)完成)14例。根據(jù)AJCC腫瘤退縮分級(jí)(tumor regression grade, TRG)系統(tǒng)對(duì)放療效果進(jìn)行分級(jí)：TRG0，無(wú)活的癌細(xì)胞殘留；TRG1，單個(gè)或小簇癌細(xì)胞殘留；TRG2，殘留癌灶，間質(zhì)纖維化；TRG3，僅少數(shù)或未見癌細(xì)胞消退。直腸腺癌組織樣本來(lái)源于2021年1-12月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科病理確診、并經(jīng)術(shù)前局部放療的直腸腺癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織。其中術(shù)前行常規(guī)分割、大分割放射治療各5例，男性3例，女性2例，年齡47～71(55.79±9.22)歲。從同一患者手術(shù)切除的腫瘤組織中取2份樣本，一份多聚甲醛固定用于包埋切片，另一份超低溫冰箱保存。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過(guò)(2022-57)。

1.1.2 細(xì)胞、試劑與儀器 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院分子腫瘤及表觀遺傳學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；人直腸腺癌細(xì)胞SW1463購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。胎牛血清和1640培養(yǎng)基分別購(gòu)自BI公司和Gibco公司；HIF-1α和VEGF的兔抗人多克隆抗體均購(gòu)自博士德公司；β-actin的鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自碧云天公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗購(gòu)自碧云天公司；PVDF膜、胰蛋白酶、RIPA裂解液和蛋白上樣緩沖液均購(gòu)自碧云天公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE電泳配膠試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒、DAB顯色試劑盒、CCK-8試劑盒和ELISA試劑盒等購(gòu)自碧云天公司。直線加速器購(gòu)自VARIAN Medical Systems公司。

1.2 方法

1.2.1 組織標(biāo)本處理及免疫組化 收集兩組患者的術(shù)后直腸腺癌組織，多聚甲醛固定、石蠟包埋后切片。用內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD34抗體孵育，然后用DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒按說(shuō)明書步驟對(duì)癌組織切片進(jìn)行DAB染色。顯微鏡下觀察不同放療方案癌組織中的CD34陽(yáng)性表達(dá)情況，拍照記錄，參照Weidner校正方法[12]計(jì)算微血管密度(microvessel density，MVD)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人直腸腺癌細(xì)胞株SW1463和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞孵箱環(huán)境中用1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)單獨(dú)培養(yǎng)。每2天進(jìn)行細(xì)胞換液，當(dāng)細(xì)胞處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期、融合度達(dá)80%左右可進(jìn)行細(xì)胞傳代或凍存。傳代時(shí)用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)在PBS清洗細(xì)胞后進(jìn)行消化，凍存時(shí)采用無(wú)血清凍存液在-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存細(xì)胞。

1.2.3 不同劑量照射腫瘤細(xì)胞及條件培養(yǎng)基制備 采用放射線照射細(xì)胞以模擬體內(nèi)放療情況。將培養(yǎng)的SW1463細(xì)胞以5×107/皿接種于直徑10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)分成4組，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)[13]，分別給予0、4、12、24 Gy單次放射線照射。以細(xì)胞培養(yǎng)皿表面為入射中心，SSD設(shè)置為100 cm，射野大小為10 cm×10 cm，輸出輻射能量為6 MV。細(xì)胞輻照結(jié)束后立即進(jìn)行細(xì)胞換液，用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。收集上述不同分組腫瘤細(xì)胞照射后培養(yǎng)基，1 000×g離心10 min。取離心后的上清并用0.45 μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾即得到照射后條件培養(yǎng)基。

1.2.4 Western blot分別檢測(cè)HIF-1α和VEGF在組織和細(xì)胞中的表達(dá) 將收集的經(jīng)常規(guī)分割放射治療和經(jīng)大分割放射治療的直腸腺癌組織剪成合適大小，加入適量液氮冰凍后再加入100 μL裂解液長(zhǎng)程研磨，再用勻漿器進(jìn)一步研磨。研磨結(jié)束后移入1.5 mL EP管，用4 ℃離心機(jī)12 000 r/min離心10 min，離心后吸取上清移至新1.5 mL EP管得到組織總蛋白。

將不同劑量照射后的SW143細(xì)胞用PBS清洗3遍，每皿加入100 μL RIPA裂解液(含1%PMSF)后于搖床上反應(yīng)25 min。用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，超聲裂解，4 ℃離心機(jī)12 000 r/min離心10 min，吸取離心后的上清移至1.5 mL EP管得到細(xì)胞總蛋白。

總蛋白提取后用BCA試劑盒按說(shuō)明書測(cè)蛋白濃度，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后100 ℃加熱變性蛋白5 min。用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒按說(shuō)明書配制濃縮膠和分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳(每孔蛋白上樣量為40 μg)，冰上250 mA轉(zhuǎn)膜，配制脫脂奶粉(5%濃度)封閉1 h，TBST清洗PVDF膜3×10 min后孵育一抗(稀釋比例1∶1 000)，4 ℃搖床過(guò)夜。次日同樣步驟清洗PVDF膜3×10 min，孵育二抗2 h(稀釋比例1∶3 000),再次清洗PVDF膜后用ECL試劑盒進(jìn)行曝光顯影并保存結(jié)果。

1.2.5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中HIF-1α和VEGF的濃度 收集不同劑量照射后的SW1463細(xì)胞培養(yǎng)基，離心后收集上清液，使用ELISA試劑盒檢測(cè)VEGF在各組細(xì)胞上清液中的濃度水平。

1.2.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 將培養(yǎng)的SW1463細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞以2 000/孔接種于96孔板中。待細(xì)胞貼壁后分成4組，分別給予0、4、12、24 Gy單次放射線輻照。照射后更換新鮮培養(yǎng)基，并于照射后的0、24、48、72 h加入10 μL/孔的CCK-8試劑。用酶標(biāo)儀在避光孵育2 h后檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm時(shí)的光密度值[D(450)]。

將培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞以2 000/孔接種于96孔板中，并分成4組，分別加入收集的SW1463細(xì)胞不同劑量(0、4、12、24 Gy)照射后條件培養(yǎng)基100 μL/孔。于接種后的0、24、48、72 h加入10 μL/孔的CCK-8試劑。用酶標(biāo)儀在避光孵育2 h后檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm時(shí)的光密度值[D(450)]。

1.2.7 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將HUVEC細(xì)胞以500/孔接種于6孔板中，加入收集的SW1463細(xì)胞照射后條件培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)7 d。當(dāng)肉眼可觀察到細(xì)胞集落形成后終止培養(yǎng)，棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗后加入4%多聚甲醛(1 mL/孔)固定30 min。結(jié)晶紫(1 mL/孔)染色15 min，PBS清洗、干燥后拍照，并計(jì)算克隆數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腫瘤退縮評(píng)級(jí)情況

常規(guī)分割放療組42例患者術(shù)后病理標(biāo)本中TRG0共8例，TRG1共7例，TRG2共11例，TRG3共16例；大分割放療組14例患者術(shù)后病理標(biāo)本中TRG0共1例，TRG1共2例，TRG2共8例，TRG3共3例。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩組放療方案效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 不同分割放療組直腸癌患者病理TRG評(píng)級(jí)

2.2 免疫組化檢測(cè)直腸癌樣本內(nèi)CD34陽(yáng)性表達(dá)并進(jìn)行MVD計(jì)數(shù)

為了比較常規(guī)分割、大分割放射治療后直腸癌患者癌組織內(nèi)血管密度情況，采用DAB染色，血管內(nèi)皮細(xì)胞用CD34標(biāo)記，血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿或胞膜呈現(xiàn)棕色或棕黃色染色顆粒為陽(yáng)性表現(xiàn)。結(jié)果顯示，大分割放療組CD34陽(yáng)性染色情況及MVD計(jì)數(shù)顯著高于常規(guī)分割放療組(P<0.05，圖1)。

A：免疫組化檢測(cè)常規(guī)分割放療組(左)、大分割放療組(右)術(shù)后直腸腺癌組織標(biāo)本CD34陽(yáng)性表達(dá)；B：兩組患者直腸癌組織MVD計(jì)數(shù)(n=5) 1： 常規(guī)分割放療組；2：大分割放療組；a：P<0.05，與常規(guī)分割放療組比較

2.3 Western blot檢測(cè)直腸癌組織中VEGF和HIF-1α蛋白的表達(dá)

為了檢測(cè)不同放射治療模式下直腸癌組織中促血管生成因子的表達(dá)情況，采用Western blot檢測(cè)直腸癌樣本中促血管生成相關(guān)蛋白VEGF和HIF-1α的表達(dá)，并用Image J軟件定量分析各蛋白條帶的灰度值(蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的/內(nèi)參蛋白灰度值)。結(jié)果顯示，大分割放療組直腸癌組織中VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著高于常規(guī)分割放療組(P<0.01，圖2)。

A：Western blot檢測(cè)結(jié)果 1： 常規(guī)分割放療組；2：大分割放療組；B：蛋白相對(duì)表達(dá)量 a：P<0.01，與常規(guī)分割放療組比較

2.4 CCK-8檢測(cè)直腸癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖情況

采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)模擬人體放療情況，并使用CCK-8檢測(cè)兩種細(xì)胞受不同劑量輻照后的增殖情況。結(jié)果顯示，72 h后SW1453細(xì)胞(P<0.05)和HUVEC細(xì)胞(P<0.05)的增殖能力均隨所受照射劑量的加大而降低，且4、12、24 Gy組均顯著低于0 Gy組(P<0.05，圖3)。

A：SW1453細(xì)胞；B：HUVEC細(xì)胞； a：P<0.05，與0 Gy比較

2.5 Western blot檢測(cè)直腸癌細(xì)胞中VEGF和HIF-1α表達(dá)

采用Western blot檢測(cè)放療后SW1463細(xì)胞中促血管生成因子的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，未經(jīng)放射處理的SW1463細(xì)胞中VEGF和HIF-1α的蛋白表達(dá)水平較低，隨著所受放射劑量的加大，SW1463細(xì)胞中VEGF(P<0.01)和HIF-1α(P<0.01)蛋白的表達(dá)水平均逐漸提高，且4、12、24 Gy均顯著高于0 Gy(P<0.01，圖4)。

A：Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：蛋白相對(duì)表達(dá)量 a：P<0.01，與0 Gy比較

2.6 ELISA檢測(cè)直腸癌細(xì)胞上清液中VEGF的濃度

為了檢測(cè)不同劑量射線照射后SW1463細(xì)胞促血管生成因子VEGF的分泌情況，收集SW1463細(xì)胞上清并采用ELISA檢測(cè)其中VEGF的蛋白濃度水平。結(jié)果顯示，SW1463細(xì)胞上清中VEGF含量與所受放射的劑量大小呈正相關(guān)，未經(jīng)放射處理的SW1463細(xì)胞上清中的VEGF含量較低，隨著放射劑量的增加，細(xì)胞上清中VEGF的含量逐漸升高，且4、12、24 Gy均顯著高于0 Gy(P<0.01，圖5)。

a：P<0.01，與0 Gy比較

2.7 CCK-8檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞在條件培養(yǎng)基影響下的增殖情況

通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC細(xì)胞在不同劑量輻照條件培養(yǎng)基干預(yù)下的增殖情況。結(jié)果顯示，與未放射條件培養(yǎng)基組相比，大劑量放射處理的直腸癌細(xì)胞培養(yǎng)基干預(yù)顯著提高了HUVEC細(xì)胞的增殖能力(P<0.01)，且4、12、24 Gy均顯著高于0 Gy(P<0.01)；隨條件培養(yǎng)基所受放射劑量的加大，其干預(yù)提高HUVEC細(xì)胞增殖能力的作用越明顯(P<0.01，圖6)。

a：P<0.01，與0 Gy輻照條件培養(yǎng)基比較

2.8 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證血管內(nèi)皮細(xì)胞在SW1463細(xì)胞輻照后條件培養(yǎng)基干預(yù)下的增殖情況， 采用克隆形成實(shí)驗(yàn)并計(jì)數(shù)了各組條件培養(yǎng)基干預(yù)培養(yǎng)后HUVEC細(xì)胞形成克隆的情況。結(jié)果表明，大劑量輻照處理的直腸癌細(xì)胞培養(yǎng)基相比于未經(jīng)輻照的條件培養(yǎng)基，能顯著提高人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的增殖能力(P<0.01)，且4、12、24 Gy均顯著高于0 Gy(P<0.01，圖7)。

A：分別為0、4、12、24 Gy條件培養(yǎng)基；B：克隆形成數(shù)計(jì)數(shù) a：P<0.01，與0 Gy條件培養(yǎng)基比較

3 討論

隨著人們生活水平的提升，隨之而來(lái)的是生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升態(tài)勢(shì)[14]。放射治療作為直腸癌治療的重要組成方式之一，其時(shí)機(jī)和劑量的把控顯得尤為關(guān)鍵。長(zhǎng)久以來(lái)，臨床上采用先手術(shù)再放療來(lái)降低腫瘤復(fù)發(fā)率，延長(zhǎng)患者生存期。但近年來(lái)研究表明，術(shù)前放療不僅具有傳統(tǒng)術(shù)后放療模式的優(yōu)點(diǎn)，還具有縮小瘤體體積、降低腫瘤分期、增加部分患者進(jìn)行根治性切除手術(shù)的機(jī)會(huì)和提高保肛率等多種優(yōu)勢(shì)[15-16]。因此，直腸癌的術(shù)前放療得到了臨床醫(yī)師的廣泛認(rèn)可和運(yùn)用。

過(guò)去，研究者對(duì)直腸癌的術(shù)前放療模式進(jìn)行了多種劑量組合的探索，包括長(zhǎng)程的常規(guī)分割放療模式：每次劑量1.8～2.0 Gy，進(jìn)行25～28次；短程的大分割放療模式：每次劑量5 Gy，進(jìn)行5次；綜合的新型放療模式：每次劑量3 Gy，進(jìn)行10次。遺憾的是，在局部復(fù)發(fā)、 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和總生存率方面各放療模式并未發(fā)現(xiàn)顯著差異。但在患者依從性和醫(yī)療資源占用方面， 長(zhǎng)程常規(guī)分割放療存在一定的劣勢(shì)，且一般認(rèn)為長(zhǎng)程常規(guī)分割放療后患者更易發(fā)生輻射毒副反應(yīng)[5，17-18]。本研究通過(guò)術(shù)后病理TRG分級(jí)對(duì)常規(guī)分割放療模式和大分割放療模式進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩種放療分割模式在術(shù)后病理的TRG分級(jí)上無(wú)顯著差異。但是本研究在不同劑量分割方式放療后的直腸癌患者術(shù)后樣本中發(fā)現(xiàn)，大分割放療組直腸癌組織內(nèi)CD34陽(yáng)性染色和MVD計(jì)數(shù)均高于常規(guī)分割放療組，推測(cè)可能與短程放療采用的單次大劑量分割方式促進(jìn)直腸癌組織內(nèi)腫瘤血管的生成有關(guān)。為此，本研究檢測(cè)了各組樣本中HIF-1α和VEGF的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)大分割放療組直腸癌樣本中HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)水平顯著高于常規(guī)分割放療組。于是在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，本研究使用不同放射劑量處理直腸癌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞以模擬體內(nèi)情況。結(jié)果顯示，雖然大劑量的輻照直接降低了血管內(nèi)皮細(xì)胞和直腸癌細(xì)胞的增殖能力，但是通過(guò)檢測(cè)直腸癌細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、VEGF的水平及上清液中VEGF的蛋白濃度，證明了射線輻照的確能促進(jìn)這些因子在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)。VEGF可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)其增殖并促進(jìn)血管的構(gòu)建，還能通過(guò)旁分泌途徑間接促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，是目前已發(fā)現(xiàn)的促腫瘤血管生成因子中作用效果最強(qiáng)的刺激因子[19-20]。而HIF-1α是VEGF表達(dá)的主要調(diào)控因子，能增強(qiáng)VEGF的轉(zhuǎn)錄活性和增加VEGF mRNA穩(wěn)定性。在缺氧或受輻照的條件下，腫瘤細(xì)胞通過(guò)增強(qiáng)HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)VEGF表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤新生血管形成[11,21-22]。

為了證實(shí)VEGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，實(shí)驗(yàn)收集了照射后癌細(xì)胞的培養(yǎng)基以干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些條件培養(yǎng)基的確能呈放射劑量依賴性地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。推測(cè)直腸細(xì)胞受到大劑量輻照后，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、VEGF的表達(dá)增加，釋放到胞外的VEGF蛋白也隨之增多，VEGF作為強(qiáng)力的促血管生成因子，可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。

另外，在實(shí)驗(yàn)中觀察到隨著放射劑量的增大，直腸癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力雖然逐漸下降，但下降率明顯放緩。推測(cè)這與細(xì)胞受到放射后DNA的損傷再修復(fù)有關(guān)，即小劑量照射后，細(xì)胞中亞致死性損傷的細(xì)胞占比例大。發(fā)生亞致死性損傷的細(xì)胞其DNA可在輻照停止后完成一定自我修復(fù)，從而逐漸恢復(fù)增殖能力。當(dāng)輻照達(dá)到一定劑量時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞將發(fā)生不可修復(fù)的致死性損傷。綜上，研究者推測(cè)大劑量的照射雖然直接降低了直腸癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力，但同時(shí)也促進(jìn)了促血管生成因子HIF-1α、VEGF的表達(dá)升高，由于受到放射損傷的細(xì)胞存在再修復(fù)的機(jī)制，使得血管內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤中增殖的總體水平呈上升表現(xiàn)。

如今，放療技術(shù)水平的提升使大劑量照射得到進(jìn)一步運(yùn)用。由于增加了照射時(shí)的生物等效劑量，大劑量分割放療在多種腫瘤的治療中取得了良好的臨床效果[23]。研究表明，相比于常規(guī)分割照射，大劑量分割照射在聯(lián)合免疫治療方面有明顯的理論優(yōu)勢(shì)：大劑量分割照射后能產(chǎn)生更多的腫瘤抗原，且可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞及時(shí)浸潤(rùn)[24]。此外，大劑量分割照射還能通過(guò)促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟、細(xì)胞因子分泌及激活T 細(xì)胞特異性殺傷能力來(lái)加強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)[25]。然而，腫瘤新生血管的增加會(huì)形成物理屏障，使免疫細(xì)胞到達(dá)腫瘤部位變得困難，限制免疫治療的有效性[10]。異常管脈系統(tǒng)還會(huì)形成缺氧和酸性微環(huán)境，使T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等抗腫瘤免疫細(xì)胞變成無(wú)反應(yīng)狀態(tài)，隨后發(fā)生凋亡，加劇免疫抑制[26]。另一方面，VEGF除了刺激腫瘤血管生成，還作為趨化因子對(duì)免疫細(xì)胞產(chǎn)生不同程度影響[27-28]，如使樹突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等抗腫瘤免疫細(xì)胞相對(duì)缺乏，髓源性抑制細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等免疫抑制細(xì)胞積累，誘導(dǎo)免疫失衡。因此，如何優(yōu)化組合使大分割放療與免疫聯(lián)合達(dá)到最優(yōu)協(xié)同作用是值得進(jìn)一步探索的問(wèn)題?，F(xiàn)在在肝癌、非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤領(lǐng)域運(yùn)用抗血管生成靶向藥物聯(lián)合免疫藥物的治療模式有了非常好的療效。在晚期結(jié)直腸癌領(lǐng)域，REGONIVO研究也證實(shí)了抗血管生成靶向藥物聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑的抗腫瘤效應(yīng)[29]。在大劑量放療的同時(shí)應(yīng)用抗血管生成的靶向藥物，而后與免疫治療聯(lián)合可能是本研究下一步的研究方向。

本研究仍存在局限，本研究雖然探討了不同劑量分割放射治療對(duì)直腸癌細(xì)胞增殖及血管生成的影響，但未進(jìn)一步探討放射次數(shù)帶來(lái)的影響。此外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)難以完全模擬臨床放療，研究者正在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證研究結(jié)果。

綜上所述，本研究證實(shí)了單次大劑量的放射促進(jìn)直腸癌細(xì)胞中HIF-1α和VEGF的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤血管的生成，為探索腫瘤大劑量放療聯(lián)合免疫治療的優(yōu)化提供了一定參考。