宮頸鱗狀細(xì)胞癌中聯(lián)合檢測(cè)HPV DNA和C-myc基因及E2F1蛋白的研究*

殷 艷，韋業(yè)平，麥 虹，張麗瀅

(廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣西南寧 530007)

宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率位居全球女性惡性腫瘤第四位，是女性癌癥死亡的第四大原因[1]。每年我國(guó)的宮頸癌新發(fā)病例大約有106 000例，我國(guó)與印度的新發(fā)病例約占全世界的1/3，是發(fā)達(dá)國(guó)家的6倍[2]。

大量研究已經(jīng)證實(shí)，持續(xù)感染高危型人乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)是宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical Intraepithelial Neoplasia,CIN)及宮頸癌的主要原因。C-myc基因能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，是與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的原癌基因，它參與了多種惡性腫瘤(如乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等)的發(fā)生發(fā)展[3]，可能是宮頸癌的一種潛在標(biāo)志物。E2F1蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用，在多種腫瘤(如肺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌)細(xì)胞呈高表達(dá)，表現(xiàn)為促癌基因的作用[4]。目前，關(guān)于E2F1蛋白在宮頸癌中的具體作用機(jī)制尚不明確。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程較長(zhǎng)，約10-15 a，其處于CIN狀態(tài)的時(shí)間較長(zhǎng)，可以有很多機(jī)會(huì)發(fā)現(xiàn)病變。目前，發(fā)達(dá)國(guó)家通過(guò)有效的篩查方法和廣泛的注射HPV疫苗，已使宮頸癌的發(fā)病率大大降低，但發(fā)展中國(guó)家仍面臨著巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。因此，臨床上開(kāi)展早期篩查、分流管理及適當(dāng)干預(yù)治療至關(guān)重要。

本研究通過(guò)檢測(cè)高危型HPV(16，18，31，33，35，39) DNA、C-myc基因及E2F1蛋白在不同宮頸組織中的表達(dá)情況，探討其與宮頸癌的相關(guān)性及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于篩查宮頸癌的臨床應(yīng)用價(jià)值，旨在進(jìn)一步提高宮頸癌的早期確診率，為患者病情評(píng)估及干預(yù)治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選擇2016年1月至2020年6月廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院的活檢及手術(shù)切除的宮頸組織石蠟標(biāo)本100例，包括正常宮頸組織20例為對(duì)照組，患者年齡為35-65歲，平均為(46±12.3)歲；宮頸病變80例為實(shí)驗(yàn)組，包括CIN Ⅰ級(jí)20例，CIN Ⅱ-Ⅲ級(jí)30例，宮頸鱗狀細(xì)胞癌30例，患者年齡為25-66歲，平均為(46±16.5)歲。其中，宮頸鱗狀細(xì)胞癌中臨床分期Ⅰ期20例，Ⅱ期10例；分化程度Ⅰ-Ⅱ級(jí)17例，Ⅲ級(jí)13例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性11例，陽(yáng)性19例。兩組之間的一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往無(wú)宮頸物理治療及手術(shù)史；(2)無(wú)其他惡性腫瘤病史；(3)未接受過(guò)放化療及腫瘤藥物治療；(4)所有病理結(jié)果均經(jīng)病理科兩位高級(jí)職稱醫(yī)師審核確定。

1.2 主要試劑

生物素標(biāo)記的高危型HPV探針、原位雜交試劑盒購(gòu)自福建泰普生物科學(xué)有限公司；C-myc和E2F1單克隆抗體購(gòu)自廣西卓一生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固態(tài)石蠟標(biāo)本制作

組織標(biāo)本離體后立即進(jìn)行取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟，制作石蠟標(biāo)本并常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 原位雜交技術(shù)檢測(cè)

將組織切成4 μm的薄片，APES處理后烤片，二甲苯脫蠟3次，每次10 min，分別于100%、95%、80%的乙醇溶液脫水3 min，用蒸餾水沖洗3 min，放入盛有雜交增強(qiáng)液的容器里，微波爐高溫處理20 min，自然冷卻至室溫后，用蒸餾水沖洗2 min，擦干。然后再添加探針，蓋上蓋玻片，置于原位雜交儀上95℃變性5 min，37℃培養(yǎng)箱中雜交過(guò)夜。用PBS緩沖液浸片，蓋玻片脫落后，用PBS緩沖液沖洗10 min。滴加適量一抗，放入濕盒中37℃孵育30 min，PBS緩沖液洗滌3次，每次2 min。滴加適量二抗，濕盒中37℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗3次，每次2 min。然后再添加DAB顯色劑，PBS緩沖液終止顯色。自來(lái)水充分沖洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，氨水反藍(lán)，乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。結(jié)果判定：高危型HPV DNA原位雜交陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核內(nèi)棕黃色點(diǎn)、片狀著色。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)

石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，放入盛有EDTA修復(fù)液的容器里，微波爐高溫處理10 min后進(jìn)行抗原修復(fù)。蒸餾水沖洗3次，每次1 min，放入3% H2O2溶液浸片10 min，蒸餾水沖洗3次，每次1 min，甩干擦凈后，滴加3% BSA,放入濕盒中封閉1 h。滴加一抗，4℃過(guò)夜，TBST沖洗4次，每次30 s。滴加二抗，37℃孵育30 min，TBST沖洗4次，每次30 s。滴加DAB液，蒸餾水充分沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度酒精及二甲苯脫水，樹(shù)膠封片。結(jié)果判定：C-myc基因、E2F1蛋白免疫組織化學(xué)陽(yáng)性細(xì)胞均為細(xì)胞核內(nèi)棕黃色染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同宮頸組織中HPV DNA、C-myc基因和E2F1蛋白的表達(dá)情況

不同宮頸組織中HPV DNA、C-myc和E2F1的表達(dá)情況如表1所示。HPV DNA在正常宮頸組織中的陽(yáng)性率為5.0%，在CINⅠ、CIN Ⅱ-Ⅲ、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性率分別為15.0%、53.3%和80.0%，其陽(yáng)性率呈明顯升高的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=36.012，P<0.001)。C-myc基因在正常宮頸組織中無(wú)陽(yáng)性表達(dá)；在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ-Ⅲ組織中的陽(yáng)性率分別為10.0%和36.7%，且表達(dá)強(qiáng)度增加；在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性率為80.0%，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；陽(yáng)性表達(dá)率顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=41.799，P<0.001)。E2F1蛋白在正常宮頸組織中陽(yáng)性率為5.0%；在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ-Ⅲ組織中的陽(yáng)性率分別為25.0%、66.7%；在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性率為90.0%，且為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；陽(yáng)性表達(dá)率有明顯增高的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=43.530，P<0.001)。病理染色結(jié)果如圖1、圖2所示。

表1 不同宮頸組織中HPV DNA、C-myc和E2F1的表達(dá)

圖1 CIN Ⅲ、宮頸鱗狀細(xì)胞癌HPV16/18原位雜交著色結(jié)果(40×)

圖2 C-myc、E2F1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(20×)

2.2 宮頸鱗狀細(xì)胞癌中HPV DNA、C-myc基因和E2F1蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HPV DNA與C-myc基因之間的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.621，P<0.01),HPV DNA與E2F1蛋白之間的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.579，P<0.01),C-myc基因與E2F1蛋白之間的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.555，P<0.01)。

2.3 宮頸鱗狀細(xì)胞癌中HPV DNA、C-myc基因和E2F1蛋白與臨床病理的關(guān)系

在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中HPV DNA、C-myc基因和E2F1蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)(分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況)的關(guān)系見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，C-myc基因的陽(yáng)性表達(dá)率在分化程度Ⅲ級(jí)明顯高于Ⅰ-Ⅱ級(jí)，差異有顯著性(P<0.05)，而其余各項(xiàng)差異均無(wú)顯著性(P>0.05)。

表2 宮頸鱗狀細(xì)胞癌中HPV DNA、C-myc、E2F1與臨床病理關(guān)系

3 討論

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，是由多種因素協(xié)同作用的結(jié)果。流行病學(xué)研究顯示，近年來(lái)我國(guó)宮頸癌發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢(shì)，并且存在發(fā)病年齡年輕化的現(xiàn)象，20-30歲女性發(fā)病率上升[5]。宮頸癌最常見(jiàn)的病理類型為鱗狀細(xì)胞癌，其次為腺癌，其他類型的比較少見(jiàn)。

持續(xù)的高危型HPV感染是CIN和宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必需條件之一[6]。研究已發(fā)現(xiàn)持續(xù)感染HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68等高危類型病毒能引起CIN和宮頸癌，所以將這些HPV類型定義為“致癌”病毒類型[7]。高危型HPV感染后整合到宿主細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致病毒癌基因E6和E7持續(xù)性表達(dá)，并與p53和Rb等抑癌基因結(jié)合使其失活，引發(fā)細(xì)胞異常增殖、凋亡，最終發(fā)生癌變。本研究證實(shí)，從正常宮頸組織到CIN各級(jí)病變，最終至宮頸鱗狀細(xì)胞癌，HPV DNA的陽(yáng)性表達(dá)率呈升高趨勢(shì)，說(shuō)明高危型HPV感染與CIN以及宮頸癌的發(fā)生進(jìn)展有密切關(guān)系。

C-myc基因位于染色體8q24，是一種重要的核內(nèi)癌基因，對(duì)多種惡性腫瘤均有特異性[8]。正常情況下C-myc基因由于受生長(zhǎng)抑制信號(hào)和有絲分裂原的調(diào)控而處于低表達(dá)水平，從而維持正常的細(xì)胞活動(dòng)。當(dāng)高危型HPV持續(xù)感染宮頸細(xì)胞后，通過(guò)基因整合C-myc發(fā)生擴(kuò)增或特異性重排，導(dǎo)致細(xì)胞中C-myc表達(dá)升高從而促進(jìn)了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[9]。有研究證實(shí)，從CIN Ⅰ發(fā)展至CIN Ⅲ直至宮頸癌，C-myc基因表達(dá)率明顯升高，并發(fā)現(xiàn)在接受化療后其表達(dá)降低[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常宮頸組織中C-myc基因無(wú)表達(dá)，而在宮頸病變組織中其陽(yáng)性率和表達(dá)程度明顯增加，提示C-myc基因參與了宮頸癌的發(fā)生，其在CIN Ⅰ時(shí)被激活并逐漸積累，持續(xù)存在于整個(gè)癌變過(guò)程中，如C-myc基因異常表達(dá)，則患者可能已經(jīng)存在CIN病變甚至是宮頸癌。該研究結(jié)果與Yang等[10]、盧建軍等[11]的研究結(jié)果一致，提示C-myc基因與宮頸病變的進(jìn)展情況密切相關(guān)，對(duì)宮頸病變的篩查具有一定的價(jià)值。烏守恒等[12]報(bào)道了C-myc基因的表達(dá)與宮頸癌臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究分析了C-myc基因與宮頸鱗狀細(xì)胞癌病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與分化程度有關(guān)，隨著分化程度的增加而增加，提示C-myc基因表達(dá)檢測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)宮頸癌進(jìn)展、觀察病情有指導(dǎo)作用。

E2F1位于染色體20q11，是一種重要的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)因子，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化等生物過(guò)程[13]。研究發(fā)現(xiàn)，E2F1在多種腫瘤如肺癌、乳腺癌、卵巢癌等組織細(xì)胞中高表達(dá)，發(fā)揮促癌基因的作用[14]。HPV感染宮頸細(xì)胞后，HPV E7致癌蛋白和低磷酸化的Rb基因結(jié)合，破壞了Rb/E2F1復(fù)合物，從而使E2F1得以釋放，促進(jìn)組織細(xì)胞進(jìn)入S期而加速細(xì)胞周期進(jìn)程，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和腫瘤形成[15]。本研究結(jié)果顯示，E2F1的陽(yáng)性表達(dá)率在CIN Ⅱ-Ⅲ及宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中明顯升高，提示E2F1過(guò)度表達(dá)能加速細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。另外，關(guān)于E2F1與腫瘤臨床病理相關(guān)性的研究，其中在乳腺癌中E2F1與分化程度低及預(yù)后差密切相關(guān)；外陰癌中E2F1表達(dá)與FIGO分期有關(guān)；宮頸癌中E2F1與分期和腫瘤分化程度有關(guān)。本研究也分析了宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中E2F1與病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示E2F1與分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均無(wú)表達(dá)差異，考慮為樣本量較少所致。

宮頸癌的癌前病變期較長(zhǎng)，有效篩查及處理是降低宮頸癌發(fā)病率的關(guān)鍵。目前，我國(guó)普遍使用液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(Thinprep Cytologic Test，TCT)聯(lián)合HPV的篩查方法，雖然能在早期篩查出宮頸病變，但是對(duì)于病變的進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸不能進(jìn)行判斷和預(yù)測(cè)。何志連等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HPV16/18表達(dá)與C-myc表達(dá)情況呈明顯正相關(guān)，推測(cè)C-myc基因是HPV16/18的靶基因。本研究發(fā)現(xiàn)，HPV DNA與C-myc基因、HPV DNA與E2F1蛋白、C-myc基因與E2F1蛋白之間的表達(dá)也存在密切的相關(guān)性，因此可作為宮頸病變?cè)缙诤Y查的生物學(xué)指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)對(duì)宮頸癌的診斷和評(píng)估具有重要的臨床意義。

4 結(jié)論

本研究表明，HPV DNA、C-myc基因及E2F1蛋白的表達(dá)均隨著宮頸病變的加重而增強(qiáng)。相關(guān)性分析顯示，HPV DNA與C-myc基因、HPV DNA與E2F1蛋白、C-myc基因與E2F1蛋白之間均呈正相關(guān)。C-myc基因在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)隨腫瘤分化程度的降低而增高，提示其與宮頸鱗狀細(xì)胞癌關(guān)系密切。今后還需進(jìn)一步通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)增加宮頸病變及宮頸癌的早期診斷，對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)患者進(jìn)行分流管理，適時(shí)干預(yù)治療，降低宮頸癌的發(fā)病率，這對(duì)于宮頸病變的診斷及監(jiān)測(cè)具有重要意義。