高效液相色譜法快速測(cè)定小麥粉中的偶氮甲酰胺

王若男，楊慧晴，趙俊峰，鐘建權(quán)，盧婉婷，周棣楊

（廣東省綠色產(chǎn)品認(rèn)證檢測(cè)中心有限公司，廣東 廣州 510440）

偶氮甲酰胺（azodicarbonamide，ADA），又名偶氮二甲酰胺，無(wú)氣味、淡黃色固體粉末。加拿大、中國(guó)等國(guó)家將它作為一種面粉的增筋劑使用[1-2]。在面粉加水制面團(tuán)時(shí)，偶氮甲酰胺遇水會(huì)釋放出活性氧，活性氧將小麥蛋白質(zhì)氨基酸的巰基（—SH）氧化為二硫鍵（—S—S），蛋白質(zhì)鏈相互連接，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，面團(tuán)的強(qiáng)度顯著提升[3]。實(shí)驗(yàn)研究表明，當(dāng)偶氮甲酰胺達(dá)到一定濃度時(shí)會(huì)誘發(fā)人類哮喘和人皮膚的致敏反應(yīng)[3-5]。在食品的加工過(guò)程中，偶氮甲酰胺在高溫高濕的環(huán)境下會(huì)分解雙縮脲（biurea，BIU）和氨基脲（semicarbazide，SEM），實(shí)驗(yàn)表明，SEM對(duì)人類健康具有潛在的致癌和誘變作用[3]。歐盟等國(guó)家已經(jīng)明令禁止使用偶氮甲酰胺，我國(guó)現(xiàn)行使用的GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定小麥粉中偶氮甲酰胺的使用限量為0.045 g/kg。

目前，偶氮甲酰胺的檢測(cè)主要是通過(guò)高效液相紫外檢測(cè)器法/質(zhì)譜法[6]，主要分為直接檢測(cè)法和通過(guò)衍生增加基團(tuán)的方法，直接檢測(cè)法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低。但是，丙酮和乙腈溶劑的溶解度低，通過(guò)濃縮增加檢測(cè)器的響應(yīng)，增加了檢測(cè)過(guò)程中的損耗[7]。衍生反應(yīng)增加基團(tuán)轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)通過(guò)液質(zhì)液相間接測(cè)定，可以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度、靈敏度、儀器的響應(yīng)度，但是衍生過(guò)程長(zhǎng)，檢測(cè)難度增加[8]。本文建立了一種快速檢測(cè)面粉中偶氮甲酰胺的方法，用N，N-二甲基甲酰胺提取面粉中的偶氮甲酰胺，并直接進(jìn)行衍生，用高效液相色譜紫外檢測(cè)器對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析，能夠滿足小麥粉樣品的檢測(cè)要求，并且操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)方法較同類實(shí)驗(yàn)所花時(shí)間短。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品，超市購(gòu)買(mǎi)；偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，純度99.0%，上海安譜催世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；N-N 二甲基甲酰胺，分析純，麥克林；三苯基膦，色譜純，麥克林；無(wú)水硫酸鈉，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；甲醇，色譜純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水，符合GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》中一級(jí)水的規(guī)定。

1.2 設(shè)備

高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器，thermo scientific UltiMate 3000；立式高速冷凍離心機(jī)，HR/T20MM，湖南赫西儀器裝備有限公司；多管渦旋混合器，EFAA-HM-01，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；水浴恒溫振蕩器，SHZ-C，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；超聲波清洗機(jī)，鈺潔。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取10.00 mg 偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用N，N-二甲基甲酰胺溶解并定容至100 mL，混勻，配置成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，0 ℃～4 ℃避光保存。

1.3.2 樣品處理方法

稱取2.50g小麥粉，加入1g無(wú)水硫酸鈉，加入25mL N，N-二甲基甲酰胺溶液，振蕩10 min，以10 000 r/min，離心10min，取上清液待衍生。準(zhǔn)確移取1mL 上清液于15 mL 離心管中，加入0.1mL 10 mg/mL 三苯基衍生溶液，混合均勻，放入40℃水浴振蕩器上，避光衍生，過(guò)0.22 μm 微孔有機(jī)濾膜，供液相色譜上機(jī)。使用空白小麥粉按照樣品處理方法進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)提取液。

1.3.3 工作液曲線的配置

分別取樣品10、50、100、300、600、1 000 μL 于10 mL 容量瓶中，用空白基質(zhì)提取液定容至10 mL，分別取1 mL 于15 mL 離心管中,與樣品同時(shí)進(jìn)行衍生。

1.4 色譜分析條件

色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫35℃，流速1.0 mL/min，洗脫流動(dòng)相V（甲醇）∶V（水）=55∶45，波長(zhǎng)230 nm，進(jìn)樣量5 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的討論

2.1.1 提取溶劑選擇

主要考慮偶氮甲酰胺的溶解性問(wèn)題，偶氮甲酰胺不溶于水和醇，在丙酮、乙腈、二甲基亞砜和N，N-二甲基甲酰胺中，丙酮和乙腈中的溶解性較差，二甲基亞砜和N，N-二甲基甲酰胺的溶解性較好。二甲基亞砜的黏稠度大，增加了前處理難度。偶氮甲酰胺室溫時(shí)在N，N-二甲基甲酰胺的溶解度能達(dá)到390 μg/mL[8]，完全可以滿足檢測(cè)要求。

2.1.2 衍生劑濃度的選擇。

用質(zhì)量濃度100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，當(dāng)衍生劑質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí)，衍生后的物質(zhì)峰面積達(dá)到最大，再增加衍生劑時(shí)峰面積幾乎不變。

2.1.3 衍生過(guò)程優(yōu)化

同類實(shí)驗(yàn)的衍生過(guò)程為移取1 mL 上清液于15 mL離心管中，加入0.1 mL 衍生溶液，混合均勻，避光靜置衍生12 h 以上，室溫下避光靜置衍生12 h 以上的工作液，峰面積與濃度之間關(guān)系如圖1 所示。

圖1 12 h 靜置衍生后的標(biāo)準(zhǔn)工作液曲線

先后嘗試了超聲和加熱振蕩兩種方式來(lái)加快衍生反應(yīng)，縮短衍生反應(yīng)時(shí)間，選取了質(zhì)量濃度0.5 mg/L和10 mg/L 的工作液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。圖2 表示超聲衍生曲線變化圖，直到2 h 以后衍生產(chǎn)物的增加速率減小，當(dāng)超聲2 h 時(shí)衍生產(chǎn)物峰面積達(dá)到靜置12 h 時(shí)的85%（工作液0.5 mg/L）和75%（工作液10 mg/L），回收率達(dá)到要求。圖3 和圖4 表示40 ℃和50℃加熱衍生曲線變化圖，2 h 以后衍生產(chǎn)物的增加速率減少，當(dāng)40 ℃加熱2 h 時(shí)衍生產(chǎn)物峰面積達(dá)到靜置12 h 時(shí)的124%（工作液0.5 mg/L）和82%（工作液10 mg/L），50℃加熱2 h 時(shí)衍生產(chǎn)物峰面積達(dá)到靜置12 h 時(shí)的145%（工作液0.5 mg/L）和98%（工作液10 mg/L），加熱溫度的增加響應(yīng)值也增加，同時(shí)考慮經(jīng)濟(jì)效應(yīng)和實(shí)驗(yàn)回收率的問(wèn)題，本文選用40 ℃加熱2 h 的方式進(jìn)行衍生，這樣前處理縮短時(shí)間至3 h 以內(nèi)，顯著提高檢測(cè)效率。

圖2 超聲衍生曲線變化圖

圖3 40 ℃加熱衍生曲線變化圖

圖4 50 ℃加熱衍生曲線變化圖

2.2 色譜條件選擇

色譜柱的選擇：本文實(shí)驗(yàn)了3 種色譜柱，根據(jù)分離情況和峰形改善，發(fā)現(xiàn)Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）效果良好，其色譜圖如圖5所示。

圖5 產(chǎn)物HPLC 色譜圖

2.3 線性范圍和檢出限

配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品得到不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線，其曲線如圖6 所示，同時(shí)用信噪比算出檢出限1.3 mg/kg 和定量限4.3 mg/kg。

圖6 40 ℃加熱工作液曲線圖

2.4 方法的回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取空白樣品18 份，每份2.50 g，共3 組，分別定量加入高、中、低3 個(gè)濃度的偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果見(jiàn)表1，加標(biāo)回收率97.7%～103.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～2.3%。

表1 空白樣品加標(biāo)回收率和精密度

3 結(jié)論

偶氮甲酰胺作為食品添加劑被許多國(guó)家允許使用，國(guó)家對(duì)偶氮甲酰胺的使用設(shè)定了限值。本文建立了一種快速檢測(cè)面粉中偶氮甲酰胺的方法，用N，N-二甲基甲酰胺提取面粉中的偶氮甲酰胺，并直接進(jìn)行衍生，用高效液相色譜紫外檢測(cè)器對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性定量。結(jié)果表明，該方法回收率高，線性好，精密度高，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。