FTO通過m6A調(diào)節(jié)c-MYC/CD47/PD-L1通路調(diào)控胃癌免疫微環(huán)境及預(yù)后預(yù)測①

楊 曦 高 鵬孫洋（三亞市人民醫(yī)院腫瘤外科，三亞 572000）

胃癌是世界上最常見惡性腫瘤之一，其病死率在所有惡性腫瘤中位居第三，僅次于肺癌和肝癌［1-2］。中國的胃癌發(fā)病率和病死率在所有惡性腫瘤中位居第二［3］。由于早期缺乏特異性癥狀和胃鏡檢查，多數(shù)患者在初診時已處于晚期［4］。近60%手術(shù)患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移，其中位總生存期（overall survival，OS）不超過12個月［4］。胃癌患者預(yù)后較差的另一個原因是缺乏靶向藥物且現(xiàn)有靶向藥物均存在一定局限。雖然曲妥珠單抗聯(lián)合化療可提高患者OS，但僅有約20%患者過表達HER2，限制了曲妥珠單抗的應(yīng)用范圍［5-7］。貝伐珠單抗也僅能提高無進展生存期和非亞裔患者OS［8］。雷莫蘆單抗聯(lián)合紫杉醇僅能用于二線治療［9］。非小細胞肺癌等其他腫瘤中取得突破性進展的免疫治療對胃癌療效仍然欠佳，帕博利珠單抗在二線治療中單藥并不優(yōu)于紫杉醇，納武單抗也僅可用于三線及后期治療［10-11］。因此，闡明胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制對早期診斷、開發(fā)新的治療靶點，更好改善胃癌患者的生存時間和質(zhì)量具有重要意義。

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是真核生物最常見RNA修飾方式之一，廣泛存在于mRNA、長鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA［12-14］。參與m6A修飾調(diào)控的蛋白大致可分為三類：m6A甲基化酶，包括METTL3、METTL14、WTAP等［15-17］；m6A去甲基化酶，包括FTO、ALKBH5等［18-19］；m6A識別蛋白，包括YTHDC1/2、YTHDF1/2/3等［20-24］。m6A修飾在包括胃癌在內(nèi)的多種實體瘤中具有重要調(diào)控作用［25-27］。FTO在急性髓系白血病、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌等惡性腫瘤中具有重要調(diào)節(jié)作用［28-31］。FTO在胃癌中的作用僅有少量報道，其具體作用機制尚未明確［32］。因此，本研究擬分析FTO在胃癌中的表達及其表達與預(yù)后、臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，進一步證實FTO表達對腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤的調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 材料BGC和SGC細胞系（上海中科院細胞庫）；m6A檢 測 試 劑 盒（ab185912）、FTO一 抗（ab126605，Abcam公司）；靶向人源FTO的siRNA、siRNA轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑（Santa Cruz）；蛋白提取試劑盒（P0013，碧云天）；抗FTO、c-MYC、CD47、PD-L1、GAPDH一抗抗體（Cell Signaling Technology）；對應(yīng)抗兔、鼠二抗（Affinity）。

1.2 方法

1.2.1 FTO在胃癌及癌旁組織中的差異表達分析采用TCGA在線分析工具GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析FTO在胃癌及癌旁組織中的差異表達。

1.2.2 TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫分析采用cbioportal下載TCGA胃癌數(shù)據(jù)庫，根據(jù)FTO mRNA表達，等于或高于中位值為高表達，低于中位值為低表達。在R Studio中采用“survival”和“survminer”程序包繪制生存曲線，Log-Rankt檢驗分析兩組生存期有無差異。采用TCGA胃癌數(shù)據(jù)分析FTO表達與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，分組方法同上，方差分析或Fisher確切概率法分析差異有無統(tǒng)計學(xué)意義。采用GEO在線工具K-M Plotter（http：//kmplot.com/analysis/）分析FTO表達與PFS、OS的關(guān)系，根據(jù)FTO mRNA表達，等于或高于中位值為高表達，低于中位值為低表達。在TCGA-STAD隊列應(yīng)用基因富集分析FTO下游調(diào)節(jié)通路，采用SPSS19.0軟件進行差異分析。

1.2.3 胃癌患者數(shù)據(jù)分析收集2011年至2016年進行胃癌手術(shù)且經(jīng)病理證實為胃癌的87例患者臨床資料并進行隨訪，統(tǒng)計無病生存期（disease free survival，DFS）和OS。胃癌患者石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本切片，脫蠟，EDTA抗原修復(fù)，加入FTO一抗孵育，免疫組織化學(xué)染色陰性（-）或弱陽性（+）為低表達組，中陽性（++）或強陽性（+++）為高表達組。Log-Rank檢驗分析兩組生存期有無差異，方差分析或Fisher確切概率法分析差異有無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.4 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染采用RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清培養(yǎng)BGC和SGC細胞系。按照靶向人源FTO的siRNA及轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。

1.2.5 總RNA m6A水平檢測SGC細胞轉(zhuǎn)染FTO siRNA或?qū)φ誷iRNA后，采用TRIzol提取總RNA，根據(jù)m6A檢測試劑盒說明書，利用分光光度法檢測總RNA m6A水平。

1.2.6 Transwell遷移實驗將轉(zhuǎn)染48 h的細胞用無血清培養(yǎng)基重懸至1×105個/100μl，接種至含24孔板的Transwell小室上室，下室加入600μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，48 h后取出Transwell小室，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS洗凈后顯微鏡下拍照計數(shù)。

1.2.7 克隆形成實驗將轉(zhuǎn)染48 h的細胞用無血清培養(yǎng)基重懸至50個/ml，在6孔板中加入100個細胞。14 d后甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS洗凈后計算克隆數(shù)。

1.2.8 Western blot BGC細胞轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，加入RIPA裂解液裂解，離心，BCA測定蛋白濃度，取35μg蛋白，凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉2 h，加入抗FTO、c-MYC、CD47、PD-L1、GAPDH 4℃孵育過夜，工作液濃度均為1∶1 000稀釋，洗膜，加入二抗室溫孵育2 h，洗膜3次后與發(fā)光液ECL反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參，分析目的蛋白條帶相對表達。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及癌旁組織中FTO表達采用TCGA數(shù)據(jù)庫分析工具GEPIA對比胃癌及癌旁組織中FTO表達，結(jié)果顯示FTO在胃癌組織中呈高表達（P＜0.05，圖1）。

2.2 TCGA胃癌數(shù)據(jù)庫中FTO表達與預(yù)后的關(guān)系為進一步探討FTO表達與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，課題組在TCGA胃癌數(shù)據(jù)庫中將所有胃癌患者按FTO mRNA表達分為高、低兩組，分別繪制了DFS和OS的K-M生存曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：FTO高表達患者中位DFS更短（HR=1.75，95%CI：1.14～2.70，P=0.011 2，圖2A），中位OS也更短（HR=1.7，95%CI：1.19～2.42，P=0.003 5，圖2B）。

2.3 GEO數(shù)據(jù)庫中FTO表達與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系在GEO數(shù)據(jù)庫中進一步驗證FTO表達和預(yù)后的關(guān)系，下載GEO數(shù)據(jù)庫GSE14210、GSE15459、GSE22377、GSE29272、GSE51105、GSE62254等數(shù)據(jù)集，按FTO mRNA表達分為FTO高表達和FTO低表達組，分別計算中位無進展生存期（progression free survivals，PFS）和中位OS并繪制K-M生存曲線，結(jié)果顯示：FTO mRNA高表達胃癌患者中位PFS更短（HR=1.59，95%CI：1.30～1.95，P＜0.000 1，圖3A），中位OS也更短（HR=1.51，95%CI：1.27～1.79，P＜0.000 1，圖3B）。

圖1 TCGA STAD隊列中腫瘤組織FTO表達高于正常組Fig.1 Tumor FTO expression was higher than normal in TCGA STAD cohort

圖2 TCGA中胃癌患者DFS/OS與FTO表達的關(guān)系Fig.2 Associations of DFS/OS and FTO expression of gastric cancer patients in TCGA

2.4 FTO表達與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系臨床研究收集87例胃癌患者手術(shù)標(biāo)本進行免疫組化染色，按免疫組化染色強度分為FTO高表達（++或+++）和低表達（-或+）組，計算兩組中位DFS和中位OS并繪制K-M生存曲線，結(jié)果顯示：FTO高表達組患者中位DFS更短（HR=3.18，95%CI：1.76～5.75，P=0.000 1，圖4A），中位OS也更短（HR=1.72，95%CI：1.03～2.87，P=0.037 1，圖4B）。

2.5 TCGA數(shù)據(jù)庫中FTO表達與病理學(xué)特征的關(guān)系TCGA數(shù)據(jù)庫中FTO表達與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，胃癌中FTO高表達和性別、M分期無關(guān)，與年齡（P=0.001 0）、T分期（P=0.000 5）有關(guān)，與N分期無關(guān)（P=0.051 7，表1）。

2.6 FTO表達與病理學(xué)特征的關(guān)系臨床研究進一步分析87例胃癌患者FTO表達與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)胃癌中FTO高表達和性別、年齡、M分期、分化無關(guān)，與T分期（P=0.005 6）、脈管侵襲（P=0.034 6）相關(guān)，與N分期無關(guān)（P=0.063 9，表2）。

圖3 GEO中胃癌患者PFS/OS與FTO表達的關(guān)系Fig.3 Associations of PFS/OS and FTO expression of gastric cancer patients in GEO

圖4 87例胃癌患者DFS/OS與FTO表達的關(guān)系Fig.4 Associations between DFS/OS and FTO expression in 87 gastric cancer patients

2.7 FTO在胃癌中的調(diào)節(jié)作用為尋找FTO在胃癌中的具體調(diào)節(jié)作用，在TCGA-STAD隊列中采用GSEA尋找FTO下游調(diào)節(jié)通路，結(jié)果顯示，多個腫瘤相關(guān)通路在FTO高表達的通路中富集，包括E2F通路、氧化磷酸化通路、MYC通路等（圖5A）。鑒于兩個MYC相的基因集均被富集，課題組選擇MYC作為FTO潛在調(diào)節(jié)靶標(biāo)進行后續(xù)實驗。在BGC細胞系中用siRNA敲低FTO表達后檢測總RNA m6A水平變化，結(jié)果顯示：相較于對照組，siRNA組總RNA m6A水平明顯降低（P=0.006 6，圖5B）。Transwell遷移實驗中，敲低FTO表達顯著抑制了BGC細胞和SGC細胞遷移（P＜0.01，圖5C）?？寺⌒纬蓪嶒炛?，F(xiàn)TO siRNA組較si-control組克隆形成數(shù)明顯減少（P＜0.01和P＜0.001，圖5D）。Western blot實驗表明，敲低FTO表達后，c-MYC表達降低，CD47和PD-L1表達也降低（圖5E）。

表2 FTO表達與臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Relationships between FTO expression and clinical pathological features

表1 FTO表達與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationships between FTO expression and clinical pathological features

2.8 FTO表達和免疫微環(huán)境的關(guān)系采用CIBERSORTx算法對TCGA中胃癌樣本進行免疫細胞浸潤估算，并按FTO mRNA表達分為FTO高表達和FTO低表達組，對比兩組免疫細胞浸潤發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO高表達組na?ve B細胞、記憶性B細胞、單核細胞、M2型巨噬細胞、非活化的肥大細胞更多（P＜0.05），F(xiàn)TO低表達組活化的肥大細胞、活化的NK細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、濾泡輔助性T細胞更多（P＜0.05，圖6）。

圖5 FTO通過調(diào)節(jié)m6A修飾調(diào)節(jié)MYC-CD47/PD-L1通路Fig.5 FTO regulates MYC-CD47/PD-L1 pathway by regulating m6A modification

圖6 FTO表達與免疫細胞浸潤的關(guān)系Fig.6 Relationship between FTO expression and immune cell infiltration

3 討論

本研究表明，F(xiàn)TO在胃癌中高表達，且FTO高表達與更差的DFS、PFS、OS相關(guān)，說明FTO可促進胃癌發(fā)生發(fā)展。FTO表達與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系表明，F(xiàn)TO表達與T分期相關(guān)，無論是在TCGA數(shù)據(jù)庫中還是本研究隊列中，F(xiàn)TO表達與N分期相關(guān)性的P均＞0.05，但非常接近0.05（分別為0.051 7和0.063 9），說明FTO表達和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能相關(guān)。另外，本研究隊列中FTO表達與脈管侵襲相關(guān)，也表明FTO表達可能與轉(zhuǎn)移有關(guān)。

GSEA表 明，c-MYC是FTO的 潛 在 調(diào) 節(jié) 靶 標(biāo)。本研究表明，F(xiàn)TO可通過m6A的方式調(diào)節(jié)c-MYC表達。研究表明，c-MYC可通過結(jié)合腫瘤細胞中的CD47/PD-L1啟動子區(qū)促進其表達，進而調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境和抗腫瘤反應(yīng)［33］。本研究表明，F(xiàn)TO可通過c-MYC調(diào)節(jié)CD47/PD-L1表達，進而調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境。

腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，腫瘤中浸潤的免疫細胞與腫瘤細胞作用直接決定腫瘤發(fā)生發(fā)展及各種治療措施（尤其是免疫治療）的療效。因此，研究腫瘤細胞對腫瘤免疫微環(huán)境的影響對進一步研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制和開發(fā)新的治療靶點具有重要意義。本研究通過CIBERSORTx算法進一步驗證FTO與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系，結(jié)果表明，F(xiàn)TO表達與多種免疫細胞浸潤相關(guān)，表明FTO通過調(diào)節(jié)c-MYC/CD47/PD-L1表達調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境。

綜上，本研究表明FTO在胃癌中表達升高且與更差的DFS、PFS、OS、T分期、脈管侵襲等相關(guān)。FTO通過其RNA去甲基化酶功能調(diào)節(jié)c-MYC/CD47/PD-L1表達，進而調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境。因此，F(xiàn)TO具有成為篩查診斷、判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物及新的候選靶點研發(fā)胃癌治療藥物的潛在價值。