沉默miR-8063促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞獲得多藥耐藥性及機(jī)制研究①

袁 濤 王 林 陳正權(quán) 文坤明（遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，遵義 563003）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界第三大惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第二大原因［1］。以化療為主的綜合治療是復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的主要治療手段。隨著化療方案逐漸完善，越來越多化療藥物在臨床上被廣泛使用，而化療過程中對(duì)這些化療藥物產(chǎn)生的多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）成為化療失敗的主要原因之一［2］。因此，深入研究產(chǎn)生耐藥性的潛在機(jī)制并尋求針對(duì)性治療靶點(diǎn)，對(duì)提高CRC生存率及改善預(yù)后具有重要意義。本課題組前期研究已證實(shí)Oct4B1作為一種癌基因能夠促進(jìn)CRC細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性［3］。為研究Oct4B1調(diào)控CRC耐藥性的分子機(jī)制，課題組采用miRNA芯片篩選出與Oct4B1表達(dá)趨勢(shì)相反的miRNA，并從中找到表達(dá)差異最為顯著的miR-8063，推測(cè)miR-8063可能作為一種抑癌基因在調(diào)節(jié)CRC耐藥性中發(fā)揮重要作用。本研究采用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾（RNAi）技術(shù)在CRC細(xì)胞SW480、HT29中沉默miRNA-8063基因，觀察沉默miRNA-8063是否能夠促進(jìn)CRC細(xì)胞獲得MDR，并探討其分子機(jī)制是否與激活WNT/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料人結(jié)CRC細(xì)胞系SW480、HT29購自上海中科院細(xì)胞庫；沉默miR-8063慢病毒載體（miR-8063-inhibitor-GFP-PURO）及陰性對(duì)照病毒（NCGFP-PURO）委托上海漢恒生物科技有限公司構(gòu)建；培養(yǎng)SW480細(xì)胞的L-15培養(yǎng)基、培養(yǎng)HT29細(xì)胞的5A培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS）購自美國HyClone公司；2.5%胰酶、細(xì)胞全蛋白提取試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；RT-qPCR試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；CCK-8試劑購自美國MedChemexpress（MCE）公司；奧沙利鉑（OXA）和5-氟尿嘧啶（5-FU）購自美國Sigma公司；兔抗人P-gp、ABCG2、WNT3A、WNT5A、β-catenin一抗購自美國Proteintech公司；鼠抗人GAPDH和β-tubulin一抗和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔/鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染SW480、HT29細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染沉默miR-8063基因的慢病毒（miR-8063-inhibitor-GFP-PURO）和陰性對(duì)照病毒（NC-GFP-PURO）。沉默miR-8063基因慢病毒序列為：5"-UUCGGGGCUGAGGACUAAAACU-3"。轉(zhuǎn)染前1 d將兩種細(xì)胞用0.25%胰酶消化并按1×105個(gè)/孔接種于24孔板；采用陰性對(duì)照病毒確定各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件，確定MOI值，根據(jù)MOI值計(jì)算每孔所需病毒量，病毒體積=（MOI×細(xì)胞數(shù)目）/病毒滴度，病毒滴度=2×108TU/ml，2.5μl/孔加入Polybrene（2 mg/ml），最后加入對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基補(bǔ)充體積至500μl/孔，48 h后更換新鮮培養(yǎng)基，72 h后倒置顯微鏡下觀察熒光并拍照，收集細(xì)胞，RT-qPCR鑒定轉(zhuǎn)染病毒后miR-8063基因的沉默效果。

1.2.2 miR-8063基因沉默效果檢測(cè)轉(zhuǎn)染72 h后，采用RT-qPCR檢測(cè)兩組細(xì)胞miR-8063相對(duì)表達(dá)（以U6為內(nèi)參，具體步驟見1.2.4），引物由大連寶生物有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)5-FU和OXA對(duì)細(xì)胞增殖的影響SW480和HT29細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，以每孔1×104個(gè)/100μl接種于96孔板培養(yǎng)24 h，加入0、2、4、8、16、32、64、128μg/ml梯度濃度的5-FU和OXA，室溫作用72 h，10μl/孔加入CCK-8溶液，37℃孵育3 h，酶標(biāo)儀讀取每孔450 nm處吸光度（OD）值，計(jì)算出藥物作用72 h時(shí)半數(shù)抑制濃度（IC50）。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞按照上述方法接種于96孔板，加入5-FU和OXA（根據(jù)上述計(jì)算出的IC50加入），設(shè)置24 h、48 h和72 h 3個(gè)檢測(cè)點(diǎn)，檢測(cè)前3 h 10μl/孔加入CCK-8溶液在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處OD值，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，細(xì)胞增殖抑制率（%）=（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)耐藥基因P-gp、ABCG2 mRNA表達(dá)按照說明書采用Trizol試劑提取總RNA，酶標(biāo)儀測(cè)量其濃度。取0.8μg總RNA按照PrimeScript RT reagent Kit試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR Green染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，總反應(yīng)體積為20μl。反應(yīng)條件：95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃15 s，60℃60 s，90℃15 s。每次檢測(cè)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以GAPDH為 內(nèi) 參，2-ΔΔCt法確定目的基因mRNA表達(dá)（引物序列見表1）。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)收集細(xì)胞，按照蛋白提取試劑盒明書和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒步驟提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度；取待測(cè)樣品中40μg總蛋白，根據(jù)目的蛋白分子量在相應(yīng)濃度的凝膠上分離目的蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，將膜與對(duì)應(yīng)一抗稀釋液（1∶2 000）4℃孵育過夜，第2天用1×TBST洗滌3次，加入對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記羊抗兔/鼠IgG二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，1×TBST洗 滌 膜3次，將 膜 置 于ECL發(fā)光 液2 min，X射線膠片曝光顯現(xiàn)蛋白條帶，掃描，Quantity-One軟件分析，目的蛋白相對(duì)表達(dá)=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0及GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖。數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染SW480、HT29細(xì)胞效果SW480、HT29細(xì)胞分別感染miR-8063-inhibitor-GFP-PURO和NC-GFP-PURO，轉(zhuǎn)染72 h后熒光倒置相差顯微鏡下可見綠色熒光（圖1），表明病毒轉(zhuǎn)染成功。

2.2 RT-qPCR檢測(cè)兩組細(xì)胞miR-8063表達(dá)RTqPCR結(jié)果顯示，SW480-sh-NC和SW480-sh-miR-8063兩組細(xì)胞miR-8063表達(dá)分別為1.05±0.06和0.40±0.03；而HT29-sh-NC和HT29-sh-miR-8063兩組miR-8063表達(dá)分別為1.04±0.08和0.23±0.03，與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組miR-8063表達(dá)顯著降低（P＜0.01，圖2）。表明miR-8063在SW480和HT29中被成功沉默。

2.3 CCK-8法檢測(cè)兩組細(xì)胞對(duì)化療藥物5-FU和OXA的敏感性GraphPad Prism 5.0軟件計(jì)算出5-FU和OXA兩種化療藥物對(duì)SW480細(xì)胞72 h的IC50分別為52.09和16.20μg/ml，兩種藥物對(duì)HT29細(xì)胞72 h的IC50分別為57.59和22.63μg/ml（圖3）。24 h、48 h、72 h時(shí)5-FU對(duì)SW480-sh-NC、SW480-shmiR-8063、HT29-sh-NC、HT29-sh-miR-8063細(xì)胞的增殖抑制率分別為（15.86±1.15）%、（13.73±1.53）%、（13.54±0.88）%、（11.23±1.12）%；（29.52±1.79）%、（18.71±2.43）%、（23.44±2.73）%、（15.94±2.06）%；（71.93±5.22）%、（41.53±3.67）%、（50.38±3.91）%、（32.16±2.58）%。OXA在24 h、48 h、72 h對(duì)上述細(xì)胞的增殖抑制率分別為（11.24±1.77）%、（10.24±1.03）%、（10.75±0.98）%、（7.54±1.52）%；（26.49±3.54）%、（14.87±2.66）%、（27.58±2.32）%、（11.04±3.14）%；（80.76±4.02）%、（54.66±3.21）%、（64.38±3.31）%、（42.48±2.69）%。提示沉默miR-8063后SW480和HT29細(xì)胞對(duì)5-FU和OXA兩種化療藥物的敏感性均隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)而降低，相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組48 h和72 h的增殖抑制率顯著降低（P＜0.01，圖4），表明48 h和72 h兩時(shí)間段實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對(duì)5-FU和OXA均產(chǎn)生了耐藥性，提示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞獲得MDR。

2.4 RT-qPCR檢測(cè)兩組細(xì)胞中耐藥基因P-gp、ABCG2 mRNA表達(dá)RT-qPCR結(jié)果顯示，SW480-sh-NC、SW480-sh-miR-8063、HT29-sh-NC和HT29-sh-miR-8063細(xì)胞P-gp mRNA表達(dá)分別為1.05±0.05、1.81±0.05、1.02±0.11和2.50±0.09；ABCG2 mRNA在上述四組細(xì)胞相對(duì)表達(dá)分別為0.98±0.06、1.58±0.06、0.98±0.04和2.01±0.07。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中p-gp mRNA表達(dá)分別提高1.8倍和2.5倍；ABCG2 mRNA表達(dá)則分別提高1.6倍和2.0倍（P＜0.01，圖5）。

圖2 RT-qPCR檢測(cè)miR-8063表達(dá)Fig.2 Expression of miR-8063 detected by RT-qPCR

圖3 不同藥物濃度作用于SW480、HT29細(xì)胞的增殖抑制率（72 h）Fig.3 Cytotoxic effects of different drug concentration on SW480 and HT29 cells（72 h）

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)（24 h、48 h、72 h）5-FU和OXA在兩組細(xì)胞中的增殖抑制率Fig.4 Cell proliferation inhibition rates of 5-FU and OXA at different time points（24 h，48 h and 72 h）in experimental group and control group

圖5 RT-qPCR檢測(cè)P-gp和ABCG2 mRNA表達(dá)Fig.5 mRNA levels of P-gp and ABCG2 detected by RTqPCR

2.5 Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞耐藥基因P-gp、ABCG2蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，SW480-sh-NC、SW480-sh-miR-8063、HT29-sh-NC和HT29-sh-miR-8063細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)分別為0.29±0.04、0.53±0.05、0.33±0.05和0.55±0.04；ABCG2蛋白上述四組細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)分別為0.20±0.06、0.69±0.03、0.26±0.05和0.71±0.04。實(shí)驗(yàn)組P-gp和ABCG2蛋白相對(duì)表達(dá)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01，圖6）。

2.6 Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，SW480-sh-NC、SW480-sh-miR-8063、HT29-sh-NC和HT29-sh-miR-8063組細(xì)胞WNT3A表達(dá)分別為0.08±0.01、0.18±0.01、0.12±0.02和0.23±0.03；WNT5A在以上四組細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)分別為0.13±0.03、0.32±0.03、0.20±0.01和0.39±0.02；β-catenin在以上四組細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量分別為0.14±0.03、0.25±0.02、0.18±0.02和0.31±0.04。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01，圖7）。

圖6 Western blot檢測(cè)P-gp和ABCG2蛋白表達(dá)Fig.6 Protein levels of P-gp and ABCG2 detected by Western blot

圖7 Western blot檢測(cè)WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表達(dá)Fig.7 Protein levels of WNT3A，WNT5A，β-catenin detected by Western blot

3 討論

CRC是發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤，對(duì)化療藥物MDR已成為CRC化療成功的主要障礙。MDR的產(chǎn)生是一個(gè)多因素共同參與的復(fù)雜過程，與減少藥物攝取并增強(qiáng)藥物外排、限制腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積、阻斷細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞周期和檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)改變等密切相關(guān)［4］。盡管關(guān)于MDR的研究取得了一定進(jìn)展，但對(duì)惡性腫瘤中MDR產(chǎn)生的具體分子機(jī)制仍知之甚少，因此，深入研究MDR的機(jī)制、尋求克服MDR的方法、提高化療藥物療效已成為目前腫瘤治療亟待解決的問題。microRNAs是一類長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，通過結(jié)合不完全的3"UTR非翻譯區(qū)靶基因mRNA導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后對(duì)靶基因表達(dá)實(shí)施調(diào)控［5-6］。研究表明，microRNAs異常表達(dá)在多種惡性腫瘤MDR調(diào)控中發(fā)揮重要作用［7-9］。本研究利用前期基因芯片篩選結(jié)果，以CRC細(xì)胞SW480、HT29為研究對(duì)象，采用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)沉默其miR-8063基因，探究是否能夠促進(jìn)SW480、HT29細(xì)胞獲得MDR，及其機(jī)制是否與激活WNT/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。

5-FU和OXA是目前轉(zhuǎn)移性CRC一線化療方案的常用藥物［10］。本研究中，實(shí)驗(yàn)組在48 h和72 h的增殖抑制率較對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），表明48 h和72 h兩個(gè)時(shí)間段實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對(duì)5-FU和OXA均產(chǎn)生了耐藥，提示沉默miR-8063基因促進(jìn)SW480、HT29細(xì)胞獲得了MDR。研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞獲得MDR與細(xì)胞膜表面ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATPbinding cassette transporter，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改變密切相關(guān)，其中P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族成員G2（ATP binding cassette transporter，subfamily G member 2，ABCG2）在MDR中起關(guān)鍵作用［11-13］。這些蛋白能夠依賴ATP產(chǎn)生的能量將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物反泵出細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，從而保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞毒性藥物損傷［14］。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組P-gp mRNA相對(duì)表達(dá)分別提高了1.8倍和2.5倍，ABCG2 mRNA相對(duì)表達(dá)則分別提高了1.6倍和2.0倍（P＜0.01）。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組P-gp和ABCG2蛋白表達(dá)也較對(duì)照組顯著增高（P＜0.01），提示沉默miR-8063基因后細(xì)胞獲得MDR，與其增強(qiáng)耐藥基因P-gp和ABCG2表達(dá)有關(guān)。

WNT/β-catenin信號(hào)通路（也稱為經(jīng)典WNT通路）是由WNT家族分泌蛋白、包膜受體Frizzled家族、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（low density lipoprotein receptor-related protein，LRP）家族、Disheveled蛋白、糖原合成激酶3β（GSK-3β）、腺瘤性息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）蛋白、支架蛋白（Axin）、酪蛋白激酶（CK1）、β-catenin及TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等構(gòu)成［15］。當(dāng)WNT/β-catenin信號(hào)通路被激活時(shí)，WNT分泌蛋白與Frizzled受體和LRP5/6蛋白結(jié)合，活化Disheveled蛋白，從而使β-catenin降解復(fù)合體向質(zhì)膜募集，導(dǎo)致β-catenin不能被磷酸化并在細(xì)胞質(zhì)中積累，進(jìn)而易位至細(xì)胞核結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族從而誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄［16］。大量研究已證實(shí)WNT/β-catenin信號(hào)通路異常激活與包括CRC在內(nèi)多種惡性腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、MDR等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)［17-21］。據(jù)報(bào)道WNT/β-catenin信號(hào)通路在約80%CRC患者中發(fā)生突變，提示其作為CRC治療靶點(diǎn)具有巨大潛力［22］。

microRNAs通過調(diào)節(jié)WNT/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)在腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌作用：JIANG等［23］研究發(fā)現(xiàn)miR-30-5p抑制CRC CSCs干性和耐藥性，其機(jī)制為通過靶向泛素特異性肽酶22（Ubiquitin-specific peptidase 22，USP22）并通過WNT/β-catenin信號(hào) 通路實(shí)現(xiàn)的。YOU等［24］研究 發(fā) 現(xiàn)miR-766-3p在肝細(xì)胞癌（HCC）組織中表達(dá)下調(diào)，且miR-766-3p低表達(dá)與HCC TNM分期、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后顯著相關(guān)，過表達(dá)miR-766-3p促進(jìn)了HCC增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制與miR-766-3p靶向WNT3A并抑制其表達(dá)有關(guān)。LI等［25］研究也證實(shí)miR-26a-5p可通過靶向WNT5A抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。本研究通過Western blot檢測(cè)了兩組細(xì)胞WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著升高（P＜0.01），提示沉默miR-8063基因?qū)е铝薟NT/β-catenin信號(hào)通路激活，從而促進(jìn)SW480、HT29細(xì)胞獲得MDR。

綜上，本研究顯示沉默miR-8063基因可促進(jìn)CRC細(xì)胞耐藥基因P-gp、ABCG2表達(dá)，使CRC細(xì)胞SW480和HT29獲得MDR，其分子機(jī)制可能與激活WNT/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，為miR-8063在臨床上用于CRC分子靶向治療提供了依據(jù)。但本研究?jī)H在體外細(xì)胞水平證實(shí)miR-8063對(duì)CRC細(xì)胞MDR的影響，體內(nèi)功能驗(yàn)證及MDR和WNT/β-catenin信號(hào)通路的具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。