香栓菌抑制NLRP3炎癥小體活化改善過敏性鼻炎①

趙晶晶 包海鷹（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春 130118）

過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是機(jī)體受到過敏原刺激后，臨床表現(xiàn)以鼻部癥狀為主的慢性非感染性炎癥性疾病。AR臨床表現(xiàn)為打噴嚏、流鼻涕、鼻塞、鼻癢等癥狀，可伴有嗅覺減退或消失，并引起鼻息肉、鼻竇炎等多種并發(fā)癥［1-2］。據(jù)統(tǒng)計，AR影響著全球10%～40%的人口。根據(jù)過敏原可分為常年性過敏性鼻炎（perennial allergic rhinitis，PAR）和季節(jié)性過敏性鼻炎（seasonal allergic rhinitis，SAR），而SAR大多是由植物釋放的花粉過敏原導(dǎo)致的［3］。目前，豚草已入侵我國的大部分地區(qū)，豚草花粉成為引起SAR的主要致敏花粉［4］。研究表明，炎癥小體與多種炎癥疾病的發(fā)生有關(guān)［5］。NOD樣受體蛋白結(jié)構(gòu)域3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體是由NLRP3、接頭蛋白凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白（apoptosis associated speck-like protein containing CARD,ASC）和半胱天冬酶1（Caspase-1）組成的、存在于細(xì)胞內(nèi)的一種復(fù)合體，在促進(jìn)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。某些過敏原可誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活，如豚草花粉可誘導(dǎo)人鼻黏膜上皮細(xì)胞中NLRP3炎癥小體活化，增強(qiáng)IL-1β的表達(dá)［6］。

香栓菌（Trametes suaveolensL.Fr.）是一種生長在楊柳樹上的大型藥用真菌［7］。經(jīng)考證，香栓菌為古籍中所記載的“白芝”，《本草綱目》中記載，白芝主治咳逆上氣，宜肺氣，通利口鼻，強(qiáng)志意，勇悍，安魄［8］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，香栓菌具有抗過敏性哮喘的作用，能顯著降低小鼠體內(nèi)IL-1β、IL-6水平，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答起到治療過敏性哮喘的作用［9］。古籍中記載具有宜肺氣、通利口鼻之功效的香栓菌對AR的作用尚未闡明，本研究通過采用豚草花粉構(gòu)建SAR小鼠模型，研究香栓菌不同提取物對SAR小鼠是否能通過抑制NLRP3炎癥小體活化，起到對SAR的防治作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF級6周齡雌性C57BL/6J小鼠90只，體質(zhì)量（20±2）g，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水進(jìn)食［由北京華阜康生物科技有限公司提供，許可證編號：SCXK（京）2019-0008］。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑香栓菌Trametes suaveolens子實(shí)體采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校園柳樹，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌工程中心圖力古爾教授鑒定；豚草花粉采于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)包海鷹教授鑒定；氯雷他定片（青島雙鯨藥業(yè)股份有限公司，批號：H20040498）；RIPA裂解液（武漢Servicebio公司，貨號：G2002）；BCA蛋白定量檢測試劑盒（武漢Servicebio公司，G2026）；β-actin（GB12001）、Caspase-1（GB11383）、IL-18（10663-1-ap）、IL-1β（A11369）抗體（武漢Servicebio公司）。

1.2 方法

1.2.1 不同提取物的制備香栓菌子實(shí)體晾干后粉碎，取1 kg香栓菌粉末加入4 000 ml石油醚，回流提取3次，每次8 h，濾液濃縮真空干燥即得香栓菌石油醚提取物。將藥渣揮干，繼續(xù)加入4 000 ml蒸餾水回流提取3次，每次2 h，濾液濃縮干燥即得香栓菌水提物。香栓菌水提物加入適量蒸餾水超聲溶解，加入無水乙醇調(diào)至醇濃度為85%，4℃靜置過夜，4 000 r/min離心10 min，沉淀用無水乙醇、丙酮洗滌2次，離心，干燥即得香栓菌粗多糖。

1.2.2 豚草花粉變應(yīng)原的制備豚草花粉5 g，混于50 ml PBS中，4℃振蕩提取12 h，混懸液1 500 r/min離心10 min，取上清，采用BCA法測定蛋白含量，調(diào)整蛋白終濃度為8 mg/ml，備用［10］。

1.2.3 構(gòu)建小鼠SAR模型將小鼠隨機(jī)分為9組：空白組（NC）、模型組（SAR）、氯雷他定組（LT）、水提物高（TSWH 240 mg/kg）、低（TSWL 60 mg/kg）劑量組、石油醚高（TSPEH 24 mg/kg）、低（TSPEL 6 mg/kg）劑 量 組、多 糖 高（TSDH 400 mg/kg）、低（TSDL 100 mg/kg）劑量組，每組10只。將50μl豚草花粉變應(yīng)原和等量弗氏佐劑混合，于第1、8、15天對小鼠進(jìn)行腹腔注射200μl致敏，空白組給予生理鹽水。第21～28天進(jìn)行滴鼻激發(fā)，用0.5%豚草花粉變應(yīng)原生理鹽水滴于小鼠雙側(cè)鼻腔中，每側(cè)10μl。滴鼻前1 h灌胃給予各提取物，空白組和模型組給予生理鹽水。

1.2.4 SAR模型小鼠行為學(xué)評價末次給藥后1 h，采用豚草花粉對小鼠進(jìn)行滴鼻激發(fā)，觀察小鼠15 min內(nèi)撓鼻和打噴嚏的次數(shù)。采用疊加量化法計分法記錄癥狀積分［11］，癥狀積分≥5分者為造模成功，AR癥狀分級評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.2.5 小鼠血清及鼻腔灌洗液中炎癥指標(biāo)的檢測在末次小鼠鼻部行為學(xué)觀察后2 h，通過眼球取血的方式采集小鼠血液，離心取血清；用1 ml注射器吸取0.8 ml生理鹽水注射于小鼠鼻腔中，下方放置1 ml離心管接取鼻腔流出液體，收集小鼠鼻腔灌洗液。根據(jù)ELISA試劑盒說明書分別測定小鼠血清中IgE、IL-1β、IL-18和鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β、IL-18水平。

1.2.6 鼻黏膜組織學(xué)形態(tài)評價分離小鼠鼻部皮膚、肌肉和軟組織，置于4%的多聚甲醛中固定24 h，10%EDTA脫鈣液脫鈣14 d，石蠟包埋，切成4μm厚的切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下分析炎癥細(xì)胞浸潤情況。

1.2.7 Western blot檢測將小鼠鼻黏膜組織在含有完整蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中進(jìn)行裂解，12 000 r/min離心10 min，收集上清。參照試劑盒方法，用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度后上樣。轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂乳的TBST封閉2 h。然后將膜與NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18和β-actin一抗（1∶1 000稀釋）在4℃下孵育過夜，隨后與山羊抗兔IgG二抗（1∶3 000稀釋度）在室溫下孵育1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影。

表1 小鼠行為學(xué)癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Norm of behavioral symptom score in mice

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析利用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，血清及鼻腔灌洗液中炎癥細(xì)胞因子采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評價于末次給藥后1 h，采用豚草花粉對小鼠進(jìn)行滴鼻激發(fā)，觀察小鼠撓鼻和打噴嚏的次數(shù)?？瞻捉M小鼠無打噴嚏，偶爾出現(xiàn)撓鼻行為；與空白組相比，模型組出現(xiàn)打噴嚏，劇烈撓鼻的行為，行為學(xué)評分顯著高于空白組（P＜0.05）；與模型組相比，各提取物高劑量組小鼠癥狀評分均顯著低于模型組（P＜0.05）。其中TSPEH組行為學(xué)評分最低，與氟雷他定組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 香栓菌對小鼠血清中IgE、IL-1β、IL-18及鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β、IL-18水平的影響與空白組相比，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-18及IgE水平均顯著升高（P＜0.05），鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-18及IL-6水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，各提取物高劑量均能顯著降低小鼠血清和鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-18和IL-6水平（P＜0.05），TSWH和TSDH均能降低小鼠血清中IgE水平（P＜0.05）。見表2、表3。

2.3 香栓菌提取物對SAR小鼠鼻黏膜組織病理學(xué)的影響HE染色結(jié)果表明，空白組基本無炎癥細(xì)胞浸潤，模型組出現(xiàn)較為嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組相比，各提取物高劑量組及氟雷他定組病理學(xué)癥狀減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少，其中TSPEH組效果最為明顯；提取物低劑量組對小鼠鼻黏膜病理癥狀改善不明顯。見圖2。

圖1 小鼠行為學(xué)評分對比Fig.1 Comparison of behavioral score in mice

2.4 香栓菌提取物對小鼠鼻黏膜組織中NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β蛋白表達(dá)的影響與空白組相比，模型組鼻黏膜組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的表達(dá)水平均升高（P＜0.05），與模型組相比，TSPE高劑量組中NLRP3、IL-18、IL-1β、Caspase-1蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05）。見圖3。

表2 香栓菌提取物對血清中細(xì)胞因子水平的影響（±s，n=10，ng/L）Tab.2 Effect of Trametes Suaveolens fruiting body extract on cytokine of serum（±s，n=10，ng/L）

表2 香栓菌提取物對血清中細(xì)胞因子水平的影響（±s，n=10，ng/L）Tab.2 Effect of Trametes Suaveolens fruiting body extract on cytokine of serum（±s，n=10，ng/L）

Note：1）P＜0.05 vs NC group；2）P＜0.05 vs SAR group.

Groups NC SAR LT TSDL TSDH TSWL TSWH TSPEL TSPEH IL-1β 66.37±1.66 113.32±1.761）97.52±1.342）90.18±1.412）80.18±1.682）113.60±3.90 92.72±2.772）101.64±0.18 72.87±2.572）IL-18 110.47±3.95 184.70±7.191）92.06±0.552）160.52±0.96 147.42±0.842）153.86±2.89 109.24±4.072）141.70±5.40 129.73±4.432）IgE 6.17±0.12 10.29±0.281）8.69±0.272）11.21±0.24 8.66±0.122）10.92±0.16 8.75±0.212）11.52±0.08 9.40±0.16

表3 香栓菌提取物對鼻腔灌洗液中細(xì)胞因子水平的影響（±s，n=10，ng/L）Tab.3 Effect of Trametes Suaveolens fruiting body extract on cytokine of nasal lavage fluid（±s，n=10，ng/L）

表3 香栓菌提取物對鼻腔灌洗液中細(xì)胞因子水平的影響（±s，n=10，ng/L）Tab.3 Effect of Trametes Suaveolens fruiting body extract on cytokine of nasal lavage fluid（±s，n=10，ng/L）

Note：1）P＜0.05，2）P＜0.01 vs NC group；3）P＜0.05，4）P＜0.01 vs SAR group.

Groups NC SAR LT TSDL TSDH TSWL TSWH TSPEL TSPEH IL-1β 81.14±17.22 153.35±22.551）112.73±8.823）108.85±9.743）106.37±11.293）125.17±16.673）121.74±14.093）126.23±21.253）121.97±19.313）IL-18 56.31±8.33 107.79±12.082）71.06±6.923）95.36±10.28 75.09±10.923）85.22±10.303）77.37±5.543）92.40±10.18 77.22±9.163）IL-6 56.24±8.24 92.97±10.851）68.25±12.013）75.90±13.913）74.72±12.244）81.94±11.36 71.03±14.253）87.93±12.02 68.46±3.913）

圖2 香栓菌提取物對小鼠鼻黏膜病理組織學(xué)的影響（×200）Fig.2 Effects of Trametes suaveolens fruiting body extract on nasal mucosa hyphological changes of mice（×200）

圖3 香栓菌提取物對各組小鼠鼻黏膜組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Trametes suaveolens fruiting body extract on NLRP3，Caspase-1，IL-1βand IL-18 expressions in nasal mucosa tissue of mice

3 討論

目前，AR在全球具有較高的發(fā)病率，而且較難治愈，其中SAR的發(fā)病率也在逐年增高，目前臨床有效的治療方法一般為鼻內(nèi)滴注皮質(zhì)類固醇或組胺類藥物［12］，然而，在有效減輕SAR癥狀的同時，也會產(chǎn)生一系列的副作用，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降等，同時使機(jī)體產(chǎn)生一定的耐藥性。SAR多發(fā)生于7月中旬至10月上旬，主要由植物所釋放的花粉過敏原所導(dǎo)致，其中豚草花粉為引起我國東北地區(qū)SAR的過敏原之一。當(dāng)人體吸入豚草花粉后，會出現(xiàn)鼻癢、流鼻涕、打噴嚏等癥狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［13］。因此，尋找具有良好預(yù)防和治療作用且副作用小的天然藥物受到廣泛關(guān)注。

香栓菌為古籍中所記載的“白芝”，歸肺經(jīng)，具有咳逆上氣，宜肺氣，通利口鼻等功效。同時前期對香栓菌的藥理活性研究發(fā)現(xiàn)，香栓菌可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答，阻止B細(xì)胞的分化和T細(xì)胞的活化增殖，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而起到治療過敏性哮喘的作用［9］。本研究采用豚草花粉對小鼠進(jìn)行全身致敏及局部激發(fā)構(gòu)建SAR模型，結(jié)果顯示，SAR組在滴鼻激發(fā)后出現(xiàn)SAR癥狀，如撓鼻、打噴嚏、流鼻涕等癥狀，并隨著激發(fā)次數(shù)增多而癥狀加重，行為學(xué)評分＞5分，空白組偶有撓鼻現(xiàn)象，表明SAR模型構(gòu)建成功。香栓菌各提取物組給藥后，小鼠SAR癥狀明顯減輕，行為學(xué)評分顯著低于SAR組，表明香栓菌提取物可有效減輕小鼠SAR癥狀。

研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在AR的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，NLRP3炎癥小體由NLRP3、Caspase-1、ASC組合而成［14］。通常NLRP3處于自身抑制狀態(tài)，當(dāng)感知細(xì)胞內(nèi)的病原微生物和代謝物時，便會激活Caspase-1，活化后的Caspase-1可促進(jìn)Pro-IL-1β和Pro-IL-18加工成具有活性的IL-1β和IL-18釋放至細(xì)胞外發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［15］。YANG等［16］在OVA誘導(dǎo)的AR小鼠模型中，NLRP3炎癥小體活化可促進(jìn)其下游炎癥因子IL-18及IL-1β的分泌，敲除NLRP3和抑制Caspase-1可有效緩解AR炎癥反應(yīng)，抑制上皮細(xì)胞發(fā)生焦亡，保護(hù)小鼠鼻黏膜結(jié)構(gòu)的完整性。同時，IL-18、IL-1β具有促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞生成的作用［17］。本研究結(jié)果顯示，SAR組小鼠鼻黏膜組織中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)顯著升高，其下游炎癥因子IL-18、IL-1β蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，提示NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了豚草花粉誘導(dǎo)的SAR小鼠發(fā)病進(jìn)程。香栓菌石油醚提取物及水提物組中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白表達(dá)均顯著低于模型組，表明香栓菌提取物抑制NLRP3炎癥小體活化，從而阻止炎癥反應(yīng)發(fā)生。香栓菌水提物及石油醚提取物均能降低小鼠血清及鼻腔灌洗液中IL-1β、IL-18炎癥因子水平，提示IL-18、IL-1β局部及全身均有升高可能與調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞從骨髓募集至鼻腔有關(guān)。IgE在致敏性疾病中的作用尤為重要，TSWH和TSDH均能降低小鼠血清中IgE水平，表明IgE參與了SAR發(fā)病進(jìn)程［18］。NLRP3炎癥小體的活化可促進(jìn)IL-6的釋放并加重炎癥反應(yīng)［19］。香栓菌各提取物均能降低NALF中IL-6水平，表明香栓菌提取物參與了抑制NLRP3的活化。HE病理切片結(jié)果顯示，香栓菌石油醚高劑量組炎癥細(xì)胞浸潤減少，鼻黏膜組織相對完整，表明香栓菌石油醚提取物可減輕局部炎癥反應(yīng)。

綜上所述，香栓菌石油醚提取物可有效改善豚草花粉誘導(dǎo)SAR小鼠癥狀，本文體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NLRP3炎癥小體參與了SAR炎癥反應(yīng)進(jìn)程，其機(jī)制可能為通過抑制NLRP3炎癥小體的活化，減少與NLRP3炎癥小體下游相關(guān)的炎癥因子IL-18、IL-1β的釋放，減輕了小鼠鼻黏膜組織中嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤情況，從而減輕小鼠SAR炎癥反應(yīng)。