人參皂苷衍生物AD-1對(duì)CD4+T細(xì)胞亞群的調(diào)控及對(duì)DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠的影響①

薄 琳 李芳芳 陳一方 李佳威 金桂花 金權(quán)鑫 趙余慶 黃學(xué)洙 金 丹

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室，延吉 133002）

機(jī)體受病原體侵襲后，T細(xì)胞被其受體和抗原提呈細(xì)胞信號(hào)激活后可分化為具有不同特征的亞群發(fā)揮功能［1］。根據(jù)識(shí)別抗原不同分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞可分化為Th1、Th2、Th17細(xì)胞、Treg及其他細(xì)胞，在機(jī)體中發(fā)揮不同調(diào)控作用。機(jī)體產(chǎn)生炎癥通常伴隨體內(nèi)CD4+T細(xì)胞亞群失調(diào)，且已有研究證實(shí)患炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）后也會(huì)產(chǎn)生這種情況，可目前其治療藥物一般具有副作用大、致使病情反復(fù)等缺點(diǎn)，而中醫(yī)藥治療已成為新的靶點(diǎn)，因此，尋求可調(diào)控T細(xì)胞分化的中藥及衍生替代物對(duì)IBD治療具有重要意義。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已證實(shí)人參在心血管、內(nèi)分泌等多個(gè)系統(tǒng)中發(fā)揮功效，尤其是在免疫系統(tǒng)中起調(diào)控作用。皂苷類產(chǎn)物在抗炎方面更是功效顯著。RB2在肺損傷小鼠治療中展示出了一定免疫調(diào)節(jié)作用［2］；Rg1也已被證實(shí)可減輕脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥［3］。AD-1是人參漿果提純得到的皂苷衍生物，已被證實(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞A549、H292具有比其他皂苷類更明顯的抑制作用［4］。但AD-1對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用鮮有報(bào)道。因此，本研究旨在探究AD-1是否可調(diào)控CD4+T細(xì)胞亞群分化及其對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠購(gòu)自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，每日保持各12 h的明暗光照循環(huán)，23～25℃、50%～70%相對(duì)濕度飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。

1.1.2 主要試劑與儀器AD-1由沈陽(yáng)藥科大學(xué)趙余慶教授贈(zèng)予。葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）購(gòu)于美國(guó)MP biomedicals公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購(gòu)于中國(guó)天津科密歐公司；APCIL-17抗 體、PerCP-Cy5.5-IL-4和APC-CD69抗 體 購(gòu)于美國(guó)BioLegend公司；PE-CD25抗體、APC-CD4和FITC-CD4抗體及破核劑購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司；PerCP-Cy5.5-IFN-γ和FITC-Foxp3抗 體 購(gòu) 于 美 國(guó)Invitrogen公司；抗鼠CD3ε和CD28抗體、抗鼠IFN-γ和IL-4抗體、人重組TGF-β1和鼠重組IL-2、鼠重組IL-6、鼠重組IL-12p70、鼠重組IL-23購(gòu)于美國(guó)Pepro-Tech公司；刀豆蛋白A（con A）購(gòu)于Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于以色列BI公司；佛波酯/離子霉素混合物（PMA/Ionnmycin）、布雷非德菌素A/莫能霉素混合物（BFA/Monensin）及破膜劑（GAS003）購(gòu)于中國(guó)聯(lián)科生物公司；分選幼稚CD4+T細(xì)胞的試劑和緩沖液購(gòu)于德國(guó)美天旎公司；流式細(xì)胞儀（FACSVerse）購(gòu)于美國(guó)BD；CO2恒溫孵育箱購(gòu)于日本三洋公司。

1.2 方法

1.2.1 幼稚CD4+T細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)采用預(yù)冷溶液并全程在冰上進(jìn)行。乙醚麻醉小鼠，脫頸法處死后剝離脾臟和腸系膜淋巴結(jié)，置于含10 ml RPMI1640培養(yǎng)基的平皿中進(jìn)行研磨制備懸液，過(guò)篩濾去包膜組織，加入1 ml紅細(xì)胞裂解液處理1 min，加入5 ml PBS終止反應(yīng)，離心后重懸、計(jì)數(shù)，將細(xì)胞終濃度調(diào)整至1×108個(gè)/ml。按每107個(gè)細(xì)胞加入10μl抗體混合物（含CD8a、CD11c、CD25等）的比例4℃避光處理5 min，再按每107個(gè)細(xì)胞加入20μl上述生物素抗體混合物的磁珠和含CD44的磁珠與一定量緩沖液充分結(jié)合，同環(huán)境處理10 min，少量緩沖液潤(rùn)柱后將細(xì)胞懸液緩緩注入柱中，收集流出液體，洗滌2次即得到純化的幼稚CD4+T細(xì)胞。

1.2.2 CD4+T細(xì)胞體外活化和分化分選出的幼稚CD4+T細(xì)胞以1.5×106個(gè)/孔接種于提前12 h包被了抗鼠CD3ε抗體（5μg/ml）的12孔板，加入抗鼠CD28抗體（3μg/ml）37℃、5%CO2孵育3 d。體外實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置為幼稚CD4+T細(xì)胞組、活化的Control組，其余各組加入抗體的同時(shí)給予不同濃度（5、10、20μmol/L）藥物為AD-1給藥組。CD4+T細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)定向分化的不同亞群分別加入對(duì)應(yīng)細(xì)胞因子及抗體37℃、5%CO2孵育5 d。同時(shí)設(shè)置Control組、AD-1給藥組（5、10、20μmol/L）。細(xì)胞向Th1方向誘導(dǎo)分化時(shí)加入重組鼠IL-2（2 ng/ml）、重組鼠IL-12 p70（5 ng/ml），加入抗鼠IL-4抗體（5μg/ml）避免向Th2細(xì)胞分化；細(xì)胞向Th2方向誘導(dǎo)分化時(shí)，加入重組鼠IL-2（2μg/ml）、重組鼠IL-4（10μg/ml）和con A（5μg/ml）；細(xì)胞向Th17方向誘導(dǎo)分化時(shí)加入重組鼠IL-6（20 ng/ml）、重組鼠IL-23（5 ng/ml）、重組人TGF-β1（1 ng/ml），加入抗鼠IFN-γ抗體（5μg/ml）和抗鼠IL-4抗體（5 mg/ml）避免向其他方向分化；細(xì)胞向Treg方向誘導(dǎo)分化時(shí)加入重組人TGF-β1（5 ng/ml）。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠模型構(gòu)建將小鼠隨機(jī)分為Control組、模型組、AD-1組，每組10只。模型組和AD-1組飲用3%DSS 5 d、水14 d，持續(xù)2個(gè)循環(huán)，再次飲用3%DSS 5 d結(jié)束造模，Control組全程飲水。AD-1組灌胃給予10 mg/kg AD-1（0.5%CMC-Na溶解），Control組和模型組灌胃給予相同濃度CMC-Na。

1.2.4 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分對(duì)小鼠進(jìn)行DAI監(jiān)測(cè)，包括體質(zhì)量減輕程度、糞便性狀及便血情況。體質(zhì)量無(wú)減輕為0分，體質(zhì)量下降1%～5%為1分，體質(zhì)量下降5%～10%為2分，體質(zhì)量下降10%～15%為3分；大便正常為0分，大便松軟但成形為1分，大便非常松散為2分，腹瀉為3分；無(wú)出血為0分，糞便潛血為1分，糞便帶血為2分，便血為3分。造模結(jié)束分?jǐn)?shù)總和相加，分析DAI評(píng)分。

1.2.5 HE染色造模結(jié)束后分離結(jié)腸組織，PBS沖洗無(wú)糞便后甲醛浸泡，石蠟包埋制作切片，脫蠟水化后經(jīng)蘇木素和伊紅染色，封片觀察腸道黏膜層情況。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)收集細(xì)胞及制備組織單細(xì)胞懸液，洗滌2次，各樣本管避光加入2.5μl CD69-APC抗體4℃染色40 min，洗滌，加入250μl固定液重懸，上機(jī)檢測(cè)。Th細(xì)胞：收集細(xì)胞洗滌后，4μl/管加入稀釋后的PMA、BFA混合物37℃培養(yǎng)5 h，1次/h搖晃，洗滌，1.25μl/管避光加入FITC-CD4抗體4℃染色40 min，破膜劑處理15 min。每管加入1.25μl APC-IL-17抗體、1.25μl PerCP-Cy5.5-IFN-γ和1.25μl PE-IL-4抗體4°C避光染色40 min，清洗，固定液重懸，上機(jī)處理。Treg：收集細(xì)胞并洗滌2次，加入0.625μl APC-CD4和0.625μl PE-CD25抗體4℃避光染色40 min，破核劑處理4 min，PBS清洗，加入0.625μl FITC-Foxp3抗體4℃避光染色40 min，清洗，固定液重懸，上機(jī)處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 7.0軟件作圖并分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD-1對(duì)體外培養(yǎng)CD4+T細(xì)胞活化的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，Control組和AD-1組CD69活化指數(shù)與幼稚CD4+T細(xì)胞組相比提高（P＜0.01），且各組變化相對(duì)平穩(wěn)，隨著AD-1給藥濃度變化并未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活化受影響（圖1）。

2.2 AD-1對(duì)體外CD4+T細(xì)胞亞群分化的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與Control組相比，定向分化Th1細(xì)胞后，AD-1組明顯抑制Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)（P＜0.01，圖2A）；定向分化Th2細(xì)胞后，AD-1組明顯促進(jìn)Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-4表達(dá)（P＜0.01，圖2B）；定向分化Th17細(xì)胞后，AD-1組明顯抑制Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-17A表達(dá)（P＜0.01，圖2C）；定向分化Treg后，AD-1組明顯促進(jìn)Treg表面標(biāo)志物CD25和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)（P＜0.01，圖2D）。

2.3 AD-1對(duì)DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠的抗炎作用模型組及AD-1組小鼠在3%DSS干預(yù)的第4天體質(zhì)量變化率達(dá)到峰值，模型組小鼠增長(zhǎng)率始終低于Control組（P＜0.01，P＜0.05，圖3A）；與模型組相比，隨著給藥天數(shù)增加，AD-1組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率逐漸上升（P＜0.01，P＜0.05，圖3A）。與Control組相比，模型組DAI評(píng)分在前兩個(gè)飲用DSS的階段均顯著提高（P＜0.01，P＜0.05），與模型組相比，AD-1組小鼠DAI評(píng)分下降（P＜0.01，P＜0.05，圖3B）。模型組小鼠結(jié)腸相對(duì)變短，AD-1組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度有所恢復(fù)（P＜0.01，P＜0.01，圖3C、D）。HE染色結(jié)果顯示，Control組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)良好，杯狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，模型組小鼠結(jié)腸黏膜受損，杯狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)缺失，黏膜層伴隨較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩遭破壞，AD-1組小鼠結(jié)腸黏膜情況得到明顯改善，杯狀細(xì)胞恢復(fù)良好，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況減輕（圖3E）。

圖1 AD-1對(duì)活化的CD4+T細(xì)胞CD69表達(dá)的影響Fig.1 Effect of AD-1 on expression of CD69 in activation of CD4+T cells

圖2 AD-1對(duì)體外CD4+T細(xì)胞亞群分化的影響Fig.2 Effect of AD-1 on differentiation of CD4+T cells subsets in vitro

2.4 AD-1對(duì)DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞亞群的調(diào)控流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠脾臟單細(xì)胞懸液發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，模型組小鼠Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ和Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-17A表達(dá)顯著增加（P＜0.01，P＜0.05，圖4A、C），Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-4和Treg表面標(biāo)志物CD25和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖4B、D）。與模型組相比，AD-1組小鼠Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ和Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-17A表達(dá)顯著降低（P＜0.01，P＜0.05，圖4A、C），Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-4和Treg表面標(biāo)志物CD25和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)顯著增加（P＜0.05，圖4B、D）。

圖3 AD-1對(duì)DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠的抗炎作用Fig.3 Anti-inflammatory effect of AD-1 on experimental colitis mice induced by DSS

圖4 AD-1對(duì)DSS誘導(dǎo)的慢性IBD小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞亞群的調(diào)控Fig.4 AD-1 regulation of CD4+T cell subsets in spleen of experimental colitis mice induced by DSS

圖5 AD-1對(duì)DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠MLN中CD4+T細(xì)胞亞群的調(diào)控Fig.5 AD-1 regulation of CD4+T cells subsets in MLN of experimental colitis mice induced by DSS

2.5 AD-1對(duì)DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠MLN中CD4+T細(xì)胞亞群的調(diào)控流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠MLN制備的單細(xì)胞懸液發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，模型組小鼠Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ和Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-17A表達(dá)顯著增加（P＜0.01，圖5A、C），Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-4和Treg表面標(biāo)志物CD25和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)顯著降低（P＜0.01，圖5B、D）。與模型組相比，AD-1組小鼠Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ和Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-17A表達(dá)顯著降低（P＜0.01，圖5A、C），Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-4和Treg表面標(biāo)志物CD25和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)顯著增加（P＜0.01，P＜0.05，圖5B、D）。

3 討論

T細(xì)胞經(jīng)雙重信號(hào)刺激活化，第一信號(hào)通過(guò)CD3與T細(xì)胞受體結(jié)合生成復(fù)合體，使T細(xì)胞活化作用增強(qiáng)；第二信號(hào)通過(guò)CD28與抗原提呈細(xì)胞的配體結(jié)合，產(chǎn)生復(fù)合物活化T細(xì)胞。CD69是具有兩個(gè)差異糖基化亞基（28～32 kD）的二硫鍵連接的同型二聚體蛋白，其表達(dá)在細(xì)胞被刺激后迅速出現(xiàn)于質(zhì)膜表面，是其廣泛作用于激活的淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞標(biāo)志物的基礎(chǔ)［5］。本研究將分選后的小鼠幼稚CD4+T細(xì)胞在體外使用抗體刺激活化3 d，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CD69表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多，證實(shí)細(xì)胞被活化，同時(shí)在不同濃度AD-1處理下，CD69表達(dá)無(wú)顯著變化，提示AD-1未參與CD4+T細(xì)胞活化階段。Th1細(xì)胞亞群的分化特點(diǎn)為轉(zhuǎn)錄因子T-bet表達(dá)及IFN-γ分泌［6］。信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子4（signal transducer and activator of transcription 4，STAT4）激活I(lǐng)L-12信號(hào)，促使細(xì)胞向Th1方向分化，主要參與細(xì)胞免疫，其產(chǎn)生的IFN-γ和腫瘤壞死因子α干擾細(xì)胞內(nèi)寄生的病原體入侵并發(fā)揮免疫調(diào)控作用［7］。Th2細(xì)胞主要通過(guò)刺激B細(xì)胞參與體液免疫，分泌IL-4、IL-5和IL-13，其激活由STAT6信號(hào)驅(qū)動(dòng)IL-4誘導(dǎo)GATA3表達(dá)［8-9］。轉(zhuǎn)錄因子GATA-3同時(shí)也調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞分化。Th17細(xì)胞參與多種炎癥和自身免疫性疾病發(fā)生和發(fā)展，主要分泌IL-17等［10］。IL-6通過(guò)STAT3誘導(dǎo)RORγt表達(dá)，從而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL-17和IL-22產(chǎn)生，募集粒細(xì)胞并在感染部位促發(fā)炎癥［11］。穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的Treg通過(guò)抑制其他T細(xì)胞和調(diào)節(jié)其所處環(huán)境的免疫細(xì)胞抑制炎癥反應(yīng)［12］。本實(shí)驗(yàn)分選出小鼠幼稚CD4+T細(xì)胞后，活化同時(shí)加入不同刺激因子向不同方向分化細(xì)胞，同時(shí)給予不同濃度AD-1處理，結(jié)果顯示，隨著濃度改變，IFN-γ和IL-17A表達(dá)顯著下調(diào)，抑制Th1和Th17細(xì)胞體外分化，同時(shí)上調(diào)IL-4和Foxp3表達(dá)，直接促進(jìn)Th2細(xì)胞和Treg分化，提示AD-1對(duì)CD4+T細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用。

過(guò)去IBD在歐美地區(qū)患病人數(shù)較多，近年由于生活方式和飲食習(xí)慣改變亞洲地區(qū)等發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。針對(duì)IBD的藥物治療均有明顯弊端，如副作用大、效果不顯著等，近年中草藥應(yīng)用日益增多，因其毒副作用小、具有多靶點(diǎn)的特點(diǎn)逐漸被重視。人參皂苷已被發(fā)現(xiàn)對(duì)炎癥的治療效果明顯［13］。皂苷類產(chǎn)物Rd刺激大鼠內(nèi)源性干細(xì)胞增殖，通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性腸道干細(xì)胞發(fā)揮藥理作用改善大鼠IBD［14］。AD-1作為人參皂苷衍生物，被發(fā)現(xiàn)對(duì)肺癌細(xì)胞具有遠(yuǎn)超其他皂苷類產(chǎn)物的抗癌特性，但其對(duì)機(jī)體炎癥的改善作用仍未見報(bào)道。為探究AD-1是否可治療IBD、起抗炎作用，本研究建立DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠模型，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定造模期間AD-1為隔天給藥方式，濃度為10 mg/kg，溶于0.5%CMC-Na更易于灌胃。隨著給藥天數(shù)增多，AD-1組小鼠體質(zhì)量變化呈上升趨勢(shì)，結(jié)腸長(zhǎng)度縮短情況較模型組有所改善，DAI評(píng)分也逐漸降低，HE染色結(jié)果提示AD-1組小鼠黏膜層杯狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)大部分恢復(fù)完整性，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，證實(shí)AD-1改善了DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)。

HEGAZY等［15］發(fā)現(xiàn)IBD會(huì)導(dǎo)致IFN-γ和IL-17等促炎因子過(guò)量產(chǎn)生，Treg比例下調(diào)，致使CD4+T細(xì)胞發(fā)生紊亂。CD4+T細(xì)胞占據(jù)免疫調(diào)節(jié)的主導(dǎo)地位，一旦細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡，可能會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞過(guò)度增殖或調(diào)節(jié)細(xì)胞功能下降，最終導(dǎo)致腸道損傷，加重炎癥發(fā)生發(fā)展［16］。Th1/Th2細(xì)胞維持穩(wěn)定占據(jù)免疫調(diào)控核心，二者狀態(tài)一旦失衡可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)，改善Th1/Th2紊亂狀態(tài)被視為治療免疫系統(tǒng)疾病的新思路［17］。小鼠哮喘模型中，槐杞黃有效逆轉(zhuǎn)了Th1/Th2細(xì)胞失衡狀態(tài)，抑制哮喘發(fā)展［18］。柴胡通過(guò)對(duì)大鼠乳腺炎癥中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4紊亂的調(diào)節(jié)恢復(fù)兩種細(xì)胞平衡，改善乳腺炎癥程度［19］。Th17細(xì)胞和Treg分化和功能存在相關(guān)性。一旦打破這種平衡就會(huì)發(fā)生包括IBD在內(nèi)的多種自身免疫性疾病。研究表明，與正常受試者相比，Th17細(xì)胞浸潤(rùn)了IBD患者腸黏膜，且效應(yīng)細(xì)胞因子IL-17與正常受試者相比增加［20］。與Th17細(xì)胞相比，Treg不僅可抑制自身免疫性疾病發(fā)生，還可控制腸道炎癥。實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎模型中，外周血中Treg減少，并通過(guò)增加IL-10和TGF-β分泌明顯改善小鼠腹瀉癥狀［21-22］。這些因子可抑制腸道炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)并將其放大，從而改善腸炎臨床癥狀。課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)AD-1可在體外調(diào)控CD4+T細(xì)胞分化，因此本研究通過(guò)體內(nèi)給藥方式探究AD-1是否可改善實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠紊亂的CD4+T細(xì)胞亞群，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟和MLN中CD4+T細(xì)胞相應(yīng)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)AD-1可明顯改善實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)CD4+T細(xì)胞紊亂，抑制Th1和Th17細(xì)胞的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17A分泌，下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子T-bet和RORγt表達(dá)，促進(jìn)Th2細(xì)胞和Treg細(xì)胞因子IL-4和IL-10分泌，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子GATA3和Foxp3表達(dá)，證實(shí)人參皂苷AD-1在體內(nèi)可改善小鼠炎癥程度同時(shí)對(duì)體內(nèi)CD4+T細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，具有一定免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上，AD-1在體外直接參與調(diào)控CD4+T細(xì)胞分化，對(duì)細(xì)胞直接進(jìn)行免疫調(diào)控，初步證實(shí)AD-1通過(guò)調(diào)控CD4+T細(xì)胞亞群改善DSS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。提示AD-1有望成為IBD的治療藥物，在治療應(yīng)用前景中具有獨(dú)特發(fā)展空間，值得進(jìn)一步開發(fā)。