基于線粒體Cytb基因和D-loop區(qū)的野生與養(yǎng)殖小黃魚群體遺傳多樣性

郭丹丹，劉 峰，牛寶龍，樓 寶

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水生生物研究所，浙江 杭州 310021)

小黃魚()屬鱸形目(Perciformes)石首魚科(Sciaenidae)黃魚屬()，在我國主要分布于渤海、東海與黃海，其作為我國“四大海產(chǎn)”(大黃魚、小黃魚、帶魚、烏賊)之一，是我國近海重要的經(jīng)濟(jì)魚類。由于持續(xù)的高捕撈強(qiáng)度，自20世紀(jì)80年代以來小黃魚種群趨于小型化、早熟和低齡化，種質(zhì)資源面臨衰退。在2016年，小黃魚被列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》。當(dāng)前，開展人工繁殖和優(yōu)良品種選育是減少小黃魚野生資源被過度開發(fā)、破壞，并實(shí)現(xiàn)小黃魚資源可持續(xù)利用的有效途徑。2016年，樓寶等成功突破了小黃魚全人工繁育關(guān)鍵技術(shù)，目前已實(shí)現(xiàn)了百萬級小黃魚苗種規(guī)?；庇?/p>

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)具有母系遺傳、幾乎不發(fā)生重組、進(jìn)化速度快與種內(nèi)多態(tài)性高等特點(diǎn)，是研究種屬間群體遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系的理想對象。小黃魚mtDNA包括13個(gè)編碼蛋白基因(7個(gè)NADH脫氫酶亞基：1、2、3、4、4、5、6；3個(gè)細(xì)胞色素氧化酶亞基：1、2、3；2個(gè)ATP酶亞基：6、8；1個(gè)細(xì)胞色素b基因：)和1個(gè)D-loop控制區(qū)。不同區(qū)域的進(jìn)化速度不同，基因進(jìn)化速度適中，適合用于種間和種內(nèi)群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析；D-loop控制區(qū)處于非編碼區(qū)，進(jìn)化速度最快，適用于親緣關(guān)系較近群體間(如種內(nèi))的分析。程磊等利用線粒體D-loop區(qū)和基因?qū)V西全州、融水、環(huán)江三地禾花鯉的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析；鄭文娟等利用線粒體D-loop區(qū)分析了舟山海域帶魚種群的遺傳結(jié)構(gòu)；何震晗等基于線粒體D-loop區(qū)序列對8個(gè)地理群體黃鰭棘鯛的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析；陳浩等基于線粒體基因和D-loop區(qū)序列分析了3條水系董氏須鰍的遺傳多樣性與種群結(jié)構(gòu)。不同學(xué)者分別利用線粒體基因或D-loop區(qū)序列對我國不同海域野生小黃魚的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，但目前關(guān)于舟山嵊泗海域和象山三門口海域小黃魚野生群體多樣性，以及小黃魚野生和養(yǎng)殖群體遺傳多樣性比較的研究尚未報(bào)道。因此，本研究基于線粒體基因和D-loop區(qū)序列，對舟山嵊泗海域(SS)、象山三門口海域(SMK)2個(gè)野生群體和1個(gè)養(yǎng)殖群體(YZ)進(jìn)行了遺傳分化與多樣性分析，一方面可以豐富我國小黃魚群體遺傳多樣性基礎(chǔ)資料，另一方面為小黃魚種質(zhì)資源保護(hù)、利用與遺傳育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與DNA提取

象山三門口海域小黃魚野生群體(SMK)樣本采集于浙江省寧波市象山一橋水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，舟山嵊泗海域野生群體(SS)和養(yǎng)殖群體(YZ)樣本采集于浙江省寧波市象山港灣水產(chǎn)苗種有限公司，每個(gè)群體各取30尾。剪取新鮮樣本的鰭條組織，并以無水乙醇固定、保存。采用酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，經(jīng)RNase處理后，分別用超微量紫外-可見光分光光度計(jì)(Therom Fisher Scientific，NanoDropOne)和瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的濃度與質(zhì)量，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴(kuò)增與測序

根據(jù)小黃魚線粒體基因組信息(GenBank序列號NC_013754.1)獲取基因和D-loop區(qū)序列，利用Primer premier 5軟件分別設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；驍U(kuò)增引物為：Cytb-F，5′-GATGAAACTTTGGCTCCCT-3′；Cytb-R，5′-GATGAAAGGGTGTTCTACTGG-3′。D-loop區(qū)擴(kuò)增引物為：D-loop-F，5′-CCATATCAATGATATCTAAGTACATAGG-3′；D-loop-R，5′-TTCCTGATCAGAAACTTAGGTGAC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系均為20 μL，其中包括10 μL 2×PCR mix(HieffDNA Polymerase、dNTP混合物、MgCl等)、8 μL DEPC HO、1 μL DNA模板、0.5 μL上游引物和0.5 μL下游引物。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56.5 ℃()或55.5 ℃(D-loop)退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，12 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用ABI 3730測序儀進(jìn)行雙向測序(北京擎科生物科技有限公司)。

1.3 序列處理與數(shù)據(jù)分析

利用BioEdit 7.0軟件對序列進(jìn)行校對，確保序列的準(zhǔn)確性。用Clustal X 1.83軟件進(jìn)行多序列比對后，截取同源序列。用MEGA 5.05軟件進(jìn)行核苷酸組成分析、遺傳距離的計(jì)算，并用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建單倍型間的系統(tǒng)發(fā)育樹。用DnaSP 5.0 軟件進(jìn)行單倍型和遺傳多樣性分析，統(tǒng)計(jì)多態(tài)位點(diǎn)數(shù)()、單倍型數(shù)()、單倍型多樣性()、核苷酸多樣性()、平均核苷酸差異數(shù)()、Tajima’s和Fu and Li's等參數(shù)。利用Arlequin 3.5軟件進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)、核苷酸錯配分析與群體間遺傳分化指數(shù)(-statistics，F(xiàn)st)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿基組成

經(jīng)引物擴(kuò)增、測序與序列比對，分別獲得了3個(gè)小黃魚群體共90個(gè)樣本的基因和D-loop區(qū)部分同源序列。結(jié)果顯示：基因同源序列長度為841 bp，其中T、C、A、G 4種堿基所占平均比值分別為26.9%、34.8%、23.3%和15%，A+T含量(50.2%)與C+G含量(49.8%)相似；D-loop區(qū)序列經(jīng)比對后，獲得的同源序列長度為629～635 bp，分析發(fā)現(xiàn)D-loop區(qū)序列比基因更具堿基偏倚性，序列中T、C、A、G 4種堿基所占平均比值分別為28.7%、24.9%、30.2%和16.2%，A+T含量(58.9%)遠(yuǎn)高于C+G含量(41.1%)，這與其他魚類D-loop區(qū)序列堿基組成相似。

2.2 遺傳多樣性

基于基因，3個(gè)小黃魚群體共確認(rèn)74個(gè)多態(tài)位點(diǎn)()，62種單倍型()，整體單倍型多樣性()、核苷酸多樣性()和平均核苷酸差異數(shù)()分別為0.980、0.005 07和4.258。養(yǎng)殖和野生群體相比，YZ群體多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(=22)、單倍型數(shù)(=12)、單倍型多樣性(=0.857)、核苷酸多樣性(=0.004 29)和平均核苷酸差異數(shù)(=3.600)略低于SS群體(=40，=26，=0.984，=0.004 85，=4.078)和SMK群體(=42，=27，=0.993，=0.005 53，=4.646)。2個(gè)野生群體相比，SMK群體的多態(tài)性位點(diǎn)、單倍型數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數(shù)高于SS群體(表1、表2)。

3個(gè)小黃魚群體D-loop區(qū)序列具有66個(gè)多態(tài)位點(diǎn)()，65種單倍型()，整體單倍型多樣性()、核苷酸多樣性()和平均核苷酸差異數(shù)()分別為0.978、0.011 52和7.073。YZ群體多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(=27)、單倍型數(shù)(=10)、單倍型多樣性(=0.805)、核苷酸多樣性(=0.009 64)和平均核苷酸差異數(shù)(=5.984)同樣略低于SS群體(=44，=27，=0.993，=0.011 74，=7.301)和SMK群體(=50，=30，=1.000，=0.012 67，=7.832)。2個(gè)野生群體相比，SMK群體的多態(tài)性位點(diǎn)、單倍型數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣性與平均核苷酸差異數(shù)高于SS群體(表1、表2)。分析結(jié)果表明，3個(gè)群體均屬于高單倍型多樣性(>0.5)；此外，YZ群體遺傳多樣性略低于野生群體(SS和SMK)，SMK群體遺傳多樣性最高，SS群體次之。

表1 三個(gè)小黃魚群體mtDNA Cytb基因和D-loop區(qū)序列遺傳多樣性參數(shù)

表2 Cytb基因和D-loop區(qū)單倍型的群體分布

2.3 中性檢驗(yàn)

中性檢驗(yàn)結(jié)果表明，基于基因和D-loop區(qū)序列，SS、SMK和YZ群體的Tajima’s值和Fu and Li's值均為負(fù)數(shù)，其中，SS和SMK群體基因中性檢驗(yàn)的Tajima’s值和Fu and Li's值顯著(<0.05)偏離中性(表1)；此外，在核苷酸錯配分析中，基于序列SS群體呈單峰類型，SMK和YZ群體呈現(xiàn)多峰，而基于D-loop區(qū)序列3個(gè)群體都呈現(xiàn)多峰(圖1)。這說明SS和SMK群體有可能經(jīng)歷過群體擴(kuò)張。

A，SS群體Cytb序列；B，SMK群體Cytb序列；C，YZ群體Cytb序列；D，SS群體D-loop區(qū)序列；E，SMK群體D-loop區(qū)序列；F，YZ群體D-loop區(qū)序列。A， Cytb sequence of SS； B， Cytb sequence of SMK； C， Cytb sequence of YZ； D， D-loop sequence of SS； E， D-loop sequence of SMK； F， D-loop sequence of YZ.圖1 Cytb基因和D-loop區(qū)序列核苷酸錯配分析Fig.1 Nucleotide mismatch analysis of Cytb and D-loop

表3 遺傳分化與遺傳距離

2.4 遺傳分化

基于基因序列，SS、SMK和YZ群體內(nèi)遺傳距離差異較小，分別為0.005、0.006和0.004；群體間遺傳距離(SS和SMK、SS和YZ、SMK和YZ)均為0.005。SS和SMK、SS和YZ、SMK和YZ群體間的遺傳分化指數(shù)分別為0.012 11、0.063 39、0.078 78(表3)。AMOVA分析結(jié)果顯示，群體間變異占整個(gè)變異的5.13%，群體內(nèi)變異占94.87%(表4)?；贒-loop區(qū)序列，SS群體內(nèi)遺傳距離為0.011，SMK群體內(nèi)的遺傳距離為0.013，YZ群體內(nèi)遺傳距離為0.010。群體間遺傳距離(SS和SMK、SS和YZ、SMK和YZ)均為0.012，比基因分析獲得的遺傳距離要遠(yuǎn)。SS和SMK、SS和YZ、SMK和YZ群體間的遺傳分化指數(shù)分別為-0.002 30、0.081 04、0.050 51(表3)。群體間變異占整個(gè)變異的4.26%，群體內(nèi)變異占整個(gè)變異的95.74%(表4)。由此可見，3個(gè)小黃魚群體的遺傳變異幾乎全部來源于群體內(nèi)。

表4 分子方差分析(AMOVA)

2.5 單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹

對角線以下數(shù)值為群體間遺傳距離，對角線上數(shù)值為群體內(nèi)遺傳距離，對角線以上數(shù)值為遺傳分化指數(shù)。

利用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)，分別基于基因和D-loop區(qū)單倍型序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2、圖3)。結(jié)果顯示，SS、SMK和YZ群體均未表現(xiàn)出明顯的地理聚集，3個(gè)群體間互有交叉。在基因的62個(gè)單倍型中，SS和SMK群體共享2個(gè)單倍型(Hap1和Hap13)，SMK和YZ群體共享1個(gè)單倍型Hap41；其中，Hap13、Hap53和Hap56為優(yōu)勢單倍型，24個(gè)為SS群體獨(dú)有單倍型(Hap2-Hap12，Hap14-Hap26)，24個(gè)為SMK群體獨(dú)有單倍型(Hap27-Hap40，Hap42-Hap51)，11個(gè)為YZ群體獨(dú)有單倍型(Hap52-Hap62)。在D-loop的55個(gè)單倍型中，SS和SMK群體共享1個(gè)單倍型(Hap4)，Hap57和Hap60為優(yōu)勢單倍型，25個(gè)為SS群體獨(dú)有單倍型(Hap1-Hap3，Hap5-Hap26)，29個(gè)為SMK群體獨(dú)有單倍型(Hap27-Hap55)，10個(gè)為YZ群體獨(dú)有單倍型(Hap56-Hap65)。

圖2 基于Cytb基因單倍型序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on haplotype sequences of Cytb gene

圖3 基于D-loop區(qū)單倍型序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on haplotype sequences of D-loop region

3 討論

本研究通過PCR擴(kuò)增分別獲得了3個(gè)小黃魚群體的基因和D-loop區(qū)部分同源序列?；蛲葱蛄兄蠺、C、A、G所占平均比值分別為26.9%、34.8%、23.3%和15%，A+T含量(50.2%)與C+G含量(49.8%)相似，這與吳仁協(xié)等的研究結(jié)果一致。在鄭文娟等對舟山附近海域小黃魚群體遺傳多樣性的結(jié)果分析中，存在AT堿基遠(yuǎn)高于CG堿基的現(xiàn)象。同樣地，本研究中D-loop區(qū)序列中T、C、A、G所占平均比值分別為28.7%、24.9%、30.2%和16.2%，其A+T含量(58.9%)遠(yuǎn)高于C+G含量(41.1%)，表現(xiàn)出明顯的AT堿基偏倚性，這符合動物線粒體基因組的共性。

遺傳結(jié)構(gòu)的差異存在于物種間與物種內(nèi)個(gè)體間，反映了物種的遺傳多樣性，是評判物種對環(huán)境適應(yīng)能力與能否長期存在的依據(jù)。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量群體遺傳多樣性的重要指標(biāo)，單倍型多樣性以0.5為臨界值，核苷酸多樣性以0.005為臨界值，數(shù)值越大代表群體的遺傳多樣性越高。在本研究中，基因序列的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.980(>0.5)和0.005 07(>0.005)，D-loop區(qū)序列的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.978(>0.5)和0.011 52(>0.005)，表明3個(gè)小黃魚群體總的遺傳多樣性較高，種質(zhì)資源較豐富。本文基于D-loop區(qū)分析得到3個(gè)小黃魚群體均具有高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性，基于基因分析得到SMK群體屬于高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性，但SS和YZ群體屬于高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性，這一結(jié)論與黃昊的分析結(jié)果不符，這可能是由于實(shí)驗(yàn)中所用小黃魚分別采集于不同的地理區(qū)域?qū)е碌?。另外，D-loop區(qū)序列與基因的單倍型多樣性相似，但D-loop區(qū)序列的核苷酸多樣性遠(yuǎn)高于基因序列，此現(xiàn)象可能與D-loop控制區(qū)處于非編碼區(qū)，受到的選擇壓力較小，變異速率較快有關(guān)，這說明mtDNA D-loop區(qū)作為反映小黃魚群體間遺傳多樣性的敏感度高于基因?；诨蚝虳-loop區(qū)序列分析結(jié)果顯示，YZ群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性略低于SS群體和SMK群體；2個(gè)野生群體相比，SMK群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性高于SS群體。這表明野生群體小黃魚多樣性略高于養(yǎng)殖群體，SMK群體遺傳多樣性最高，SS群體次之。

遺傳距離和遺傳分化指數(shù)用來衡量群體間的分化程度。本研究中，根據(jù)基因序列分析獲得的群體間遺傳距離(SS和SMK、SS和YZ、SMK和YZ)均為0.005，根據(jù)D-loop區(qū)序列獲得的群體間遺傳距離(SS和SMK、SS和YZ、SMK和YZ)均為0.012。在群體內(nèi)遺傳距離方面，基于D-loop分析的SS、SMK和YZ群體內(nèi)遺傳距離(0.011、0.013和0.010)比基因分析的遺傳距離(0.005、0.006和0.004)要遠(yuǎn)，可能是由于進(jìn)化速度不同從而導(dǎo)致二者變異的不均一性。從遺傳分化指數(shù)來看，遺傳分化指數(shù)為0～0.05表示群體間存在極小分化，遺傳分化指數(shù)為0.05～0.15表示群體間存在中度分化，遺傳分化指數(shù)為0.15～0.25表示群體間存在較高的遺傳分化?；诨蚝虳-loop區(qū)序列，SS和SMK群體間的遺傳分化指數(shù)小于0.05，表明2個(gè)野生群體間的分化程度極小，這與此前其他不同地理區(qū)域小黃魚野生群體的研究結(jié)果一致；而SS和YZ、SMK和YZ群體間的遺傳分化指數(shù)介于0.05～0.15，表明養(yǎng)殖群體與野生群體間存在中度分化。AMOVA分析結(jié)果表明，群體內(nèi)個(gè)體的變異是遺傳變異的主要來源。由基因和D-loop區(qū)單倍型構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，3個(gè)群體間互有交叉，并未表現(xiàn)出明顯的地理聚集，說明3個(gè)群體間的分化尚不明顯。從種群歷史動態(tài)來看，SS和SMK群體基因中性檢驗(yàn)的Tajima’s值和Fu and Li's值均為負(fù)值且顯著偏離了中性選擇，此外，SS群體核苷酸錯配分析呈單峰趨勢，表明SS和SMK群體有可能經(jīng)歷過群體擴(kuò)張。

綜上所述，本研究中野生群體間的遺傳分化程度較低，經(jīng)過長期的馴化，養(yǎng)殖群體與野生群體間出現(xiàn)了中度分化。3個(gè)小黃魚群體均表現(xiàn)出高單倍型多樣性，但與野生群體相比，養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性略低。單倍型多樣性和核苷酸多樣性較高的種群被認(rèn)為可能是由一個(gè)大而穩(wěn)定的種群經(jīng)過長時(shí)間演化而來或由兩個(gè)不同系群的種群二次接觸所形成，而單倍型多樣性和核苷酸多樣性較低的種群可能發(fā)生了瓶頸效應(yīng)，我們推測養(yǎng)殖群體遺傳多樣性較低可能是由于近期發(fā)生了瓶頸效應(yīng)。因此，在育種過程中應(yīng)適時(shí)補(bǔ)充不同群體作為后備親魚，以防止近親繁殖與瓶頸效應(yīng)，保持繁育群體的遺傳多樣性。本研究結(jié)果不僅豐富了我國小黃魚野生群體遺傳多樣性基礎(chǔ)資料，而且對小黃魚野生資源的保護(hù)與合理利用，尤其對小黃魚的遺傳育種提供了參考依據(jù)。