雜草致病菌株GD-0221的分離、鑒定與除草潛力

李 祥，朱海霞

(青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

近年來(lái)，世界各國(guó)大力提倡“綠色農(nóng)藥”，在眾多的新型農(nóng)藥中，生物源農(nóng)藥以其在自然環(huán)境中自身易降解、無(wú)公害的優(yōu)勢(shì)已成為綠色農(nóng)藥的首選之一。將植物病原菌或其產(chǎn)生的次生代謝物制成微生物除草劑應(yīng)用于田間，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)防治田間雜草最具潛力的方式。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前已有40多個(gè)屬80多個(gè)種的病原真菌被開(kāi)發(fā)成了微生物源除草劑。最早美國(guó)利用棕桐疫霉開(kāi)發(fā)出的Devine制劑來(lái)防除柑橘園莫倫藤()；加拿大利用梨孢霉屬病原菌開(kāi)發(fā)出的制劑對(duì)狗尾草7 d后防效達(dá)87%；澳大利亞引進(jìn)的無(wú)眠單胞銹菌()能夠有效防治桉葉藤()；美國(guó)登記的Dr. Bioseoge可用于防治油莎草()，其對(duì)油莎草幼芽抑制率可達(dá)66%，對(duì)其生長(zhǎng)抑制率可達(dá)40%左右。國(guó)內(nèi)最早開(kāi)發(fā)出的生防除草劑“魯保一號(hào)”對(duì)菟絲子有很好的防效。強(qiáng)勝等開(kāi)發(fā)研制出的生物除草劑“殺草毒素AAC-Toxin”對(duì)雜草的防效2 d內(nèi)達(dá)100%。鏈格孢菌(spp.)產(chǎn)生的次生代謝物已成為開(kāi)發(fā)生物源除草劑的重要菌種。朱海霞等研究發(fā)現(xiàn)，極細(xì)鏈格孢菌HZ-1可作為防除闊葉雜草的生防潛力菌。利用植物病原菌或其次生代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)生物源除草劑，是新型生物源農(nóng)藥開(kāi)發(fā)的主要方向。

青海省的氣候特點(diǎn)與生態(tài)條件決定了生物多樣性的特殊性，該地區(qū)在孕育了豐富雜草的同時(shí)，也隱藏著大量的雜草病原微生物。近年來(lái)，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室一直致力于雜草生防資源的廣泛深入研究，以期挖掘出更多可供選擇的生防材料用于發(fā)展高效、安全的生物除草劑。本研究以患病甘草根部分離獲得的菌株GD-0221為研究對(duì)象，測(cè)定該菌株對(duì)5種田間常見(jiàn)闊葉雜草離體和盆栽致病性，以及對(duì)5種青海主栽作物青稞()、小麥()、油菜()、蠶豆()和豌豆()的安全性，并利用形態(tài)學(xué)和進(jìn)化樹(shù)明確其分類地位，為該菌株的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

甘草根部病樣采自青海省西寧市貴德縣河西鎮(zhèn)本科村(36°03′43″ N，101°43′56″ E)農(nóng)家自留地中。甘草病樣癥狀表現(xiàn)為植株完全枯死，葉色呈褐色，莖桿干枯萎蔫，根部變成黃褐色，根部出現(xiàn)壞死，部分出現(xiàn)腐爛。

1.2 菌株的分離與純化

參照方中達(dá)的方法進(jìn)行菌株分離。用無(wú)菌水將病樣根部泥土沖洗干凈，在無(wú)菌操作臺(tái)中先用NaClO溶液(有效氯含量≥0.1%)浸泡葉片3 min，用無(wú)菌水沖洗3次，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡30 s，用無(wú)菌水沖洗3次，置于無(wú)菌操作臺(tái)中晾干。取病健交界處5 mm×5 mm的小塊接于PDA培養(yǎng)基中，每皿接5～8個(gè)病樣小塊，每種接5皿，于恒溫(25 ℃)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后純化菌株。

1.3 菌株鑒定與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將純化的菌株于PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)，定期觀察菌落生長(zhǎng)速度、菌落形態(tài)與色澤變化，光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲、孢子形態(tài)。結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步鑒定。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

菌株基因組DNA的提取與含量測(cè)定、基因ITS區(qū)的PCR擴(kuò)增與測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。其中，ITS通用引物為ITS 1：5′-CCGTGTGTGCGG-3′和ITS 4：5′-TCTCG-CTTATTGTGGC-3′。

利用Chromas軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列修正，通過(guò)NCBI Blast檢索與GD-0221序列同源性高的DNA序列，利用MEGA 7.0軟件近鄰歸群法(Neighbor-Joining， N-J)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株的分類地位。

1.4 離體葉片致病性測(cè)定

將純化后的菌株利用離體葉片試驗(yàn)進(jìn)行篩選，在無(wú)菌操作臺(tái)將純化培養(yǎng)所得的菌株平板用打孔器(Φ=8 mm)打菌餅，將雜草密花香薷()、藜()、冬葵()、酸模葉蓼()、萹蓄()葉片放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿(Φ=90 mm)中，用無(wú)菌水將濾紙浸濕提供濕潤(rùn)環(huán)境，再將菌餅放在葉片上面，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，以未接菌的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，7 d后觀察病斑面積，病斑面積=1/4×長(zhǎng)×寬×3.14。調(diào)查發(fā)病程度，參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)，葉片無(wú)任何病斑；1級(jí)，葉片上有病斑產(chǎn)生；2級(jí)，病斑擴(kuò)展至1/3～2/3葉片；3級(jí)，2/3以上的葉片壞死；4級(jí)，葉片全部枯死變色。

1.5 盆栽雜草致病性測(cè)定

1.5.1 發(fā)酵液制備

將菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，用Φ=8 mm的打孔器在菌落邊緣處取菌塊，接種到PDB培養(yǎng)液(每瓶250 mL)，每瓶接4～8塊，在25 ℃、180 r·min搖床振蕩培養(yǎng)5～7 d。將發(fā)酵液用無(wú)菌3層紗布過(guò)濾后，用無(wú)菌水將孢子濃度稀釋成(1.0×10～1.0×10)CFU·mL備用。

1.5.2 雜草移栽

將青海省農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)田生長(zhǎng)的4～5葉期健康雜草密花香薷()、藜()、冬葵()、酸模葉蓼()、萹蓄()苗移栽于花盆(盆底直徑Φ=15 cm)中，溫室[(25±1)℃]內(nèi)培養(yǎng)1周，待其生長(zhǎng)正常后備用。

1.5.3 發(fā)酵液接種

將發(fā)酵液裝入300 mL無(wú)菌噴壺中，加入1～2滴黏附劑吐溫80，用噴霧接種法在健康雜草植株上接種，接種量控制在每盆25～30 mL，連續(xù)接種3次。以接種無(wú)菌水的健康植株作為對(duì)照。接菌后的雜草植株用厚度0.06 mm塑料薄膜保濕培養(yǎng)12 h，置于溫室[(25±1)℃]培養(yǎng)。每處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.5.4 發(fā)病率計(jì)算

觀察接種雜草的發(fā)病情況，7 d后調(diào)查雜草發(fā)病程度，計(jì)算發(fā)病率。調(diào)查發(fā)病程度，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)同1.4節(jié)。

病情指數(shù)(%)

1.6 作物安全性測(cè)定

將青海省5大主栽作物青稞(lg)、小麥()、油菜()、蠶豆()和豌豆()種子在培養(yǎng)皿(Φ=90 mm)中催芽后分別種植于花盆中，溫室[(25±1)℃]內(nèi)培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)至4～5葉期。以每盆25～30 mL的接種量進(jìn)行噴霧接種，連續(xù)接種3次。以接種無(wú)菌水的健康植株作為對(duì)照。接菌后的植株用厚度0.06 mm塑料薄膜保濕培養(yǎng)12 h，置于溫室[(25±1)℃]培養(yǎng)。每處理設(shè)置3次重復(fù)。觀察植株發(fā)病情況。

1.7 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2010和DPS 9.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定

GD-0221菌株在PDA培養(yǎng)基上呈白色絨毛狀，后期背面呈粉色，營(yíng)養(yǎng)菌絲體發(fā)達(dá)，邊緣整齊；在顯微鏡下觀察，GD-0221菌株的小型分生孢子散生于菌絲間，孢子形態(tài)呈卵圓型或腎型，透明狀無(wú)隔膜；其孢子梗中間有明顯隔膜，孢子梗間呈銳角或直角分布(圖1)。

A，GD-0221菌株正面形態(tài)；B，GD-0221菌株背面形態(tài)；C和D，GD-0221的分生孢子形態(tài)；E，GD-0221孢子梗形態(tài)。A， Positive morphology of GD-0221 strain； B， Back morphology of strain GD-0221； C and D， Conidia morphology of GD-0221； E， GD-0221 spore stalk morphology.圖1 GD-0221菌株形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of GD-0221 strain

2.1.2 分子水平鑒定與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果顯示，GD-0221菌株的ITS序列長(zhǎng)度為504 bp(GenBank序列號(hào)ON600532)。將其在NBCI內(nèi)進(jìn)行BLAST比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)該菌株與isolate F1的序列相似度達(dá)93%，選擇為外群，獲取與其不同相似度的10株菌株，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，GD-0221相較于其他幾種菌，與isolate F1的親緣關(guān)系較近(圖2)。結(jié)合顯微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)特征，確定菌株GD-0221為尖孢鐮刀菌()。

圖2 基于GD-0221菌株5.8S-ITS rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on 5.8S-ITS rDNA gene sequence of GD-0221 strain

2.2 離體葉片致病性測(cè)定

由圖3和表1可知，接種7 d后，該菌株對(duì)5種闊葉雜草離體葉片均表現(xiàn)出不同程度的致病性。該菌株可以使密花香薷葉片產(chǎn)生病斑，葉片周圍長(zhǎng)出白色菌絲，葉片呈黑色枯死狀。藜葉片接有菌餅的周圍產(chǎn)生病斑，葉片局部黃化，且長(zhǎng)有白色菌絲。冬葵葉片接有菌餅的周圍先出現(xiàn)病斑，之后黃化，最終變?yōu)楹稚?，表面有大量菌絲。酸模葉蓼葉片接種菌餅后，先是出現(xiàn)病斑，逐漸擴(kuò)大，最終使葉片完全枯死為褐色，葉片背部產(chǎn)生白色菌絲。萹蓄葉片接種菌餅后，葉片背部先產(chǎn)生病斑，之后逐漸擴(kuò)展至整個(gè)葉片，葉片呈現(xiàn)褐色枯死狀，背部產(chǎn)生大量白色菌絲。離體葉片致病力整體表現(xiàn)為冬葵>酸模葉蓼>密花香薷>萹蓄>藜。

A，密花香薷；B，藜；C，冬葵；D，酸模葉蓼；E，萹蓄。圖4同。A， Elsholtzia densa； B， Chenopodium album； C， Malva verticillata； D， Polygonum lapathifolium； E， Polygonum aviculare. The same as in figure 4.圖3 GD-0221菌株對(duì)5種闊葉雜草離體葉片致病性(接種7 d)Fig.3 Pathogenicity of strain GD-0221 to isolated leaves of five broadleaf weeds (7 days after inoculation)

表1 菌株GD-0221對(duì)離體雜草的致病力比較(接種7 d)

2.3 盆栽雜草致病性測(cè)定

接種7 d后，5種雜草的發(fā)病率為20.00%～85.67%，5種雜草的病情指數(shù)為13.75%～81.25%。致病效果由高到低表現(xiàn)為密花香薷>萹蓄>藜>酸模葉蓼>冬葵。接種14 d后，5種雜草的發(fā)病率為33.33%～100.00%，病情指數(shù)為27.50%～100.00%。GD-0221菌株除了對(duì)冬葵表現(xiàn)輕微致病性以外，對(duì)密花香薷、藜、酸模葉蓼、萹蓄均表現(xiàn)出強(qiáng)致病性。密花香薷和萹蓄的發(fā)病率分別為100.00%和98.33%，冬葵發(fā)病率最低，為33.33%，密花香薷和萹蓄的病情指數(shù)分別為100.00%和95.00%，冬葵的病情指數(shù)為27.50%(表2)。接種14 d后5種闊葉雜草的致病效果見(jiàn)圖4，密花香薷葉片上呈現(xiàn)出大量病斑，

表2 菌株GD-0221對(duì)5種雜草的發(fā)病率與發(fā)病指數(shù)

圖4 GD-0221菌株對(duì)5種闊葉雜草的致病性(接種14 d)Fig.4 Pathogenicity of strain GD-0221 to five broadleaf weeds (14 days after inoculation)

植株干枯萎蔫；藜植株葉片有卷曲，大量枯萎，葉緣癥狀加重；冬葵植株葉片葉緣部位出現(xiàn)卷曲和干枯；酸模葉蓼葉片上產(chǎn)生大量斑點(diǎn)，且葉緣部位萎蔫枯死；萹蓄植株葉片病斑蔓延至全部葉片，植株全部萎蔫。

2.4 作物安全性

接種GD-0221菌株發(fā)酵液7 d后，青稞、小麥表現(xiàn)安全，油菜、蠶豆和豌豆表現(xiàn)不安全(圖5)，說(shuō)明該菌株對(duì)2種禾本科作物表現(xiàn)安全。豌豆雖未表現(xiàn)出癥狀，但植株生長(zhǎng)緩慢。接種油菜3 d后，葉片上出現(xiàn)少量病斑，7 d后，葉片表現(xiàn)為枯死狀，植株矮化。蠶豆表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢，葉片卷曲，接種3 d后，植株葉片上產(chǎn)生病斑，7 d后病斑擴(kuò)展至整個(gè)植株，病斑平均面積達(dá)0.5 cm。

A，青稞；B，小麥；C，豌豆；D，油菜；E，蠶豆。A， Hordeum vulgare； B， Triticum aestivum； C， Pisum sativum； D， Brassica campestris； E， Vicia faba.圖5 GD-0221菌株對(duì)5種主栽作物安全性Fig.5 Safety of strain GD-0221 on five main crops

3 結(jié)論與討論

鐮刀菌屬()是一類寄生在植物體或土壤的絲狀真菌，包含多種植物致病真菌。據(jù)報(bào)道，目前用于雜草防除的植物病原真菌主要來(lái)自于鐮刀菌屬()、鏈格孢菌屬()等。木賊鐮刀菌除了使某些中藥材、觀賞植物等感病，還對(duì)惡性雜草具有很強(qiáng)的防治效果，具有除草潛力?？琢顣缘葟牧挟?dāng)()中分離出的鐮刀菌可有效防治寄生在向日葵中的列當(dāng)，具有開(kāi)發(fā)成生物源除草劑的潛力。Oleskevich等從自然感病的懸鉤子屬植株上分離出來(lái)的鐮刀菌有很好的除草效果。

尖孢鐮刀菌應(yīng)用比較廣泛。在醫(yī)療領(lǐng)域，Wang等從牛樟樹(shù)內(nèi)生真菌尖孢鐮刀菌中分離到的beauvericin具有很好的抗癌活性；Cui等從銀杏內(nèi)生真菌尖孢鐮刀菌中分離得到的ginkgolide B是血小板活化因子拮抗劑，可用于治療缺血性腦中風(fēng)的痰瘀阻絡(luò)證。在植物病害領(lǐng)域，尖孢鐮刀菌作為鐮刀菌屬中具有強(qiáng)致病力的菌株，主要通過(guò)分泌致病毒素來(lái)侵染植物，直接穿透植物根和維管束組織，引起多種植物的枯萎病和根腐病。在雜草防除方面，張?zhí)N等篩選出的尖孢鐮刀菌MF06，其乙酸乙酯萃取物對(duì)反枝莧根的生長(zhǎng)有較好的抑制活性；張鍵等利用從列當(dāng)上分離的尖孢鐮刀菌防控列當(dāng)對(duì)向日葵的寄生。本研究從自然感病的甘草根部分離得到尖孢鐮刀菌GD-0221，對(duì)闊葉雜草密花香薷、藜、冬葵、酸模葉蓼、萹蓄均具有致病性，說(shuō)明尖孢鐮刀菌可用于更廣泛雜草類群的防除，具有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

本研究分離得到的菌株GD-0221對(duì)青海省常見(jiàn)的5種農(nóng)田闊葉雜草具有廣譜的除草效果，對(duì)禾本科作物表現(xiàn)安全，對(duì)闊葉作物表現(xiàn)不安全。因此，GD-0221具有開(kāi)發(fā)為禾本科作物田防除闊葉雜草的潛力。生物除草劑開(kāi)發(fā)過(guò)程中最關(guān)鍵的兩大因素是致病力和安全性。本研究從致病性、作物安全性及其分類地位等方面做了基礎(chǔ)研究，下一步將對(duì)該菌株的劑型、田間藥效、除草機(jī)理等進(jìn)行系統(tǒng)研究，為將該菌開(kāi)發(fā)成為禾本科作物田微生物除草劑提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。