外源褪黑素對低溫弱光脅迫下辣椒葉綠素?zé)晒夂涂寡趸到y(tǒng)的影響

丁東霞，李能慧，李 靜，唐超男，王 成，牛天航，楊 滟，楊海濤，頡建明

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

光照和溫度是植物生長發(fā)育的兩個(gè)重要環(huán)境因子，對植物的分布和生長發(fā)育調(diào)控起重要作用。辣椒原產(chǎn)南美洲，喜溫喜光，是我國設(shè)施栽培的主要蔬菜之一。然而，西北地區(qū)冬春季節(jié)的日光溫室栽培中低溫經(jīng)常伴隨弱光出現(xiàn)，低溫弱光是反季節(jié)辣椒的生產(chǎn)限制關(guān)鍵因子，嚴(yán)重影響辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)。研究表明，低溫弱光導(dǎo)致辣椒葉片葉綠素和凈光合速率的降低，丙二醛(MDA)含量顯著增加和細(xì)胞膜透性增大。近年來，中國設(shè)施蔬菜規(guī)模穩(wěn)定的遞增，2018年設(shè)施總面積為189.42萬hm。因此，提高設(shè)施辣椒對低溫弱光脅迫的抗性成為辣椒早春栽培亟待解決的問題。

褪黑素(melatonin，MT)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種激素，最早發(fā)現(xiàn)于松果體內(nèi)，其化學(xué)名為-乙酰基-5甲氧基色胺。褪黑素被認(rèn)為是一種生長調(diào)節(jié)劑，參與調(diào)控植物的多個(gè)生物過程，包括種子萌發(fā)、根系生長、開花、衰老等。除此之外，褪黑素還具有維護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、清除活性氧、提高植物抗性的功能，參與一系列生物和非生物脅迫，如干旱脅迫、高溫脅迫、冷害脅迫、鹽脅迫、病害等。有研究表明，外源噴施一定濃度的褪黑素可以有效緩解低溫弱光對茄子幼苗的脅迫傷害，提高可溶性糖和脯氨酸含量，降低茄子幼苗葉片中電解質(zhì)滲透率和MDA含量，有效減輕低溫弱光對細(xì)胞膜的破壞性，提高茄子的抗逆性；黃陳玨等研究表明，當(dāng)外源褪黑素濃度范圍為50～100 μmol·L時(shí)可以提升越冬茬櫻桃番茄果實(shí)品質(zhì)；100 μmol·L的外源褪黑素預(yù)處理可以增強(qiáng)油菜幼苗對低溫的適應(yīng)性；緩解低溫脅迫對玉米幼苗的傷害。除此之外，外源褪黑素在煙草、甜瓜、牡丹和月季等作物中的作用也有研究。但迄今為止，基于外源褪黑素作用的辣椒低溫弱光的生理機(jī)制研究較少。本研究以辣椒幼苗為材料，主要研究不同濃度褪黑素促進(jìn)辣椒幼苗耐低溫弱光脅迫的作用機(jī)制，并篩選出緩解效果最佳的褪黑素濃度，為冬春季節(jié)設(shè)施辣椒栽培管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

本試驗(yàn)在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科樓園藝學(xué)院人工氣候箱(RDN-400E-4，浙江寧波)進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

供試?yán)苯窞殡]椒10號(甘肅地區(qū)主栽品種)，購自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；褪黑素(≥98%)購自Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將籽粒飽滿的隴椒10號辣椒種子消毒后，置于28 ℃恒溫黑暗條件下催芽，待種子露白后播種在裝有基質(zhì)(草炭∶蛭石∶珍珠巖體積比3∶1∶1)的塑料營養(yǎng)缽中(9 cm×9 cm)，每個(gè)營養(yǎng)缽2粒種子，正常溫光管理(28 ℃/18 ℃，300 μmol·m·s)。待幼苗長至5～6片真葉時(shí)，選擇長勢一致的植株進(jìn)行褪黑素溶液處理。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置6個(gè)不同濃度的褪黑素溶液，分別為0(T1)、50(T2)、100(T3)、150(T4)、200(T5)和250(T6)μmol·L，其中T1以等量蒸餾水替代，所有處理中均加入0.1%吐溫；采用葉面噴施的方法，葉片正反面均勻噴施至水滴欲滴為止，于每晚8點(diǎn)進(jìn)行葉面噴施，連續(xù)處理4 d。之后，轉(zhuǎn)入人工氣候箱進(jìn)行低溫弱光處理(溫度為15 ℃/5 ℃，光照為100 μmol·m·s)，7 d后進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

葉綠素含量測定參照李靜的方法；葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定參照胡琳莉的方法，并做稍微調(diào)整，使用調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上駜xIMAGIN-PAM(Heinz WaItz， Germany)進(jìn)行測定。每處理隨機(jī)選擇3株重復(fù)，經(jīng)過30 min暗適應(yīng)之后，剪下第3片完全展開的功能葉，平展在熒光儀的測定臺上，并用細(xì)線固定好。熒光儀檢測參數(shù)設(shè)定為測量光光照強(qiáng)度0.1 μmol·m·s，光化光強(qiáng)度81 μmol·m·s，飽和脈沖光照強(qiáng)度2 700 μmol·m·s，脈沖光時(shí)間0.8 s，每20 s打一次飽和脈沖光，總共打15次，在AOI type中采用Polyon方式，沿著邊緣手動選擇全葉作為AOI，讀取最后一次飽和脈沖光所測得的光適應(yīng)下熒光參數(shù)值進(jìn)行分析。

1.4.2 生理生化指標(biāo)測定

可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法；丙二醛(MDA)含量的測定采用代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用氮藍(lán)四唑法；細(xì)胞膜相對透性均參照高俊鳳的方法測定；過氧化氫酶(CAT)活性測定采用過氧化氫法；超氧陰離子含量測定使用蘇州科明銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的超氧陰離子測定試劑盒。

1.4.3 葉片的氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)染色

辣椒葉片NBT染色參照夏凌君的方法。取不同褪黑素濃度處理后的辣椒幼苗葉片，分別置于150 mL廣口三角瓶中，量取50 mL NBT染液(0.5 mg·mL，用pH 7.8的PBS溶解)加入其中，抽真空30 min；然后25 ℃暗置孵育6 h；最后倒出染液，加入脫色液(乳酸∶甘油∶無水乙醇體積比為1∶1∶3)沸水浴5～6 min分鐘，直至葉片中綠色完全褪去為止。用掃描儀掃描染色葉片并觀察。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與作圖；試驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差分析使用SPSS 20.0軟件采用Duncan’s進(jìn)行顯著性分析(<0.05)；使用Photoshop CS6軟件進(jìn)行圖片處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度褪黑素處理對低溫弱光脅迫下辣椒葉片光合色素含量的影響

如圖1所示，與T1相比，噴施不同濃度的褪黑素均明顯增加葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量，且隨著濃度的增加表現(xiàn)出先增加后下降的趨勢。當(dāng)褪黑素濃度為100 μmol·L時(shí)(T3)，辣椒幼苗葉片的葉綠素a、b和總含量均顯著高于對照T1，分別增加了26.09%、24.55%、25.72%，其他處理間則沒有顯著差異，而類胡蘿卜素含量則在T2(50 μmol·L)處理時(shí)較T1顯著升高，其他處理較T1無顯著差異。

不同處理間沒有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。The bars without the same letters showed the significant difference (P<0.05). The same as below.圖1 不同濃度褪黑素處理對低溫弱光脅迫下辣椒葉片光合色素含量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of melatonin on photosynthetic pigment content in pepper leaves under low temperature and low light stress

2.2 不同濃度褪黑素處理對低溫弱光脅迫下辣椒葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

圖2為不同褪黑素濃度處理后葉片PSⅡ最大光化學(xué)效率(/)的熒光成像圖。低溫弱光脅迫明顯降低了/，但對葉脈影響較??；葉片噴施褪黑素后，隨著褪黑素濃度增加傷害程度有所下降，但濃度大于200 μmol·L后，緩解效果有所下降。同時(shí)，由表1可知，噴施不同濃度褪黑素均顯著增加了葉片的/，其中濃度在100 μmol·L(T3)時(shí)顯著提高了辣椒葉片/，較T1增加了11.20%。T4、T5和T6則分別增加了9.83%、5.99%和6.20%。說明當(dāng)褪黑素濃度較高時(shí)，對/下降的緩解作用減弱。

圖2 不同濃度褪黑素對低溫弱光脅迫下辣椒葉片F(xiàn)v/Fm的影響Fig.2 Effects of different concentrations of melatonin on Fv/Fm of pepper leaves under low temperature and low light stress

由表1可知，低溫弱光脅迫下外源噴施褪黑素處理時(shí)辣椒葉片的(Ⅱ)、和隨著褪黑素濃度的增加表現(xiàn)出先增加后降低的變化趨勢。而()、和則表現(xiàn)出相反趨勢。其中T3處理的(Ⅱ)、和最大，且均與T1有顯著性差異，分別增加了43.79%、36.99%和33.88%；而和除了與T4處理之間無顯著性差異，與其他各處理均存在顯著增加；(Ⅱ)則與所有處理相比均顯著增加。非光化學(xué)猝滅的量子產(chǎn)量(())、非光化學(xué)猝滅系數(shù)()和非光化學(xué)猝滅()在T3處理時(shí)均最小，與T1相比分別顯著降低了24.62%、32.74%和14.06%。其中的T3處理與其余各處理均有顯著差異，而()和除了與T4無差異外，與其余處理均有顯著差異。說明100 μmol·L的褪黑素濃度對辣椒低溫弱光造成的傷害緩解效果最好。

表1 不同濃度褪黑素對辣椒低溫弱光脅迫下葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.3 不同濃度褪黑素對辣椒低溫弱光條件下可溶性糖、MDA和葉片相對電導(dǎo)率含量的影響

圖3-A為低溫弱光下，不同濃度褪黑素處理對可溶性糖的影響，當(dāng)褪黑素的濃度逐漸增大時(shí)，可溶性糖含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在T3處理時(shí)達(dá)到最大，較T1處理增加了52.88%，其他4個(gè)處理分別增加了19.21%、39.07%、8.75%和19.91%。在外源褪黑素處理下，辣椒幼苗MDA的含量較T1處理含量明顯下降(圖3-B)，隨著褪黑素濃度的增加MDA含量先降低后增加，在T3處理時(shí)顯著低于其他處理。與T1處理相比，各處理分別降低了20.49%、22.50%、18.18%、14.82%和2.54%。由此說明，褪黑素能降低低溫弱光脅迫下辣椒葉片的MDA含量，T3處理時(shí)效果最好。

圖3 不同濃度褪黑素處理對辣椒低溫弱光條件下可溶性糖、MDA含量和相對電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of melatonin on soluble sugar， MDA content and electrical conductivity of pepper under low temperature and low light conditions

圖3-C為不同濃度褪黑素處理對電導(dǎo)率的影響，在低溫弱光脅迫下，低濃度的褪黑素處理有效降低了低溫弱光脅迫下辣椒葉片的相對電導(dǎo)率，高濃度褪黑素(>150 μmol·L)處理增加了相對電導(dǎo)率。隨處理濃度的增加，相對電導(dǎo)率呈先降低后升高再降低的趨勢，其中T3處理時(shí)相對電導(dǎo)率較對照組顯著下降，較T1處理降低了17.54%；T4、T5和T6處理較T1處理分別增加了8.94%、19.56%和3.02%。

2.4 不同濃度褪黑素處理對低溫弱光脅迫下辣椒葉片超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性和超氧陰離子含量的影響

圖4-A為低溫弱光下，不同褪黑素濃度對SOD活性的影響，當(dāng)褪黑素的濃度逐漸增大時(shí)，辣椒SOD活性呈先升高后降低再升高的趨勢。T3和T6處理與T1有顯著差異，低溫弱光脅迫處理下SOD活性最低，為18.76 U·g；T3處理時(shí)的辣椒幼苗SOD活性達(dá)到最高，較T1增加了66.31%。 T6處理SOD活性增加次于T3處理，與T1相比增加了60.21%，可能是因?yàn)椋邼舛?250 μmol·L)的褪黑素對辣椒造成了脅迫，激發(fā)了體內(nèi)SOD的生成。T1與T2、T4和T5處理之間沒有差異。如圖4-B所示，CAT活性隨著褪黑素濃度的增大呈逐漸增大的趨勢，T3、T4、T5和T6與T1相比都顯著增加，分別增加56.65%、69.81%、70.20%和83.95%，但是T3與T4、T5和T6處理之間沒有差異。由圖4-C可知，外源噴施褪黑素能夠明顯降低超氧陰離子的含量，且隨著濃度的增加表現(xiàn)為先下降后升高的趨勢，其中T3處理時(shí)超氧陰離子含量最低為52.76 nmol·g，較T1處理顯著下降了48.40%。T3處理除了與T2處理無顯著差異外，與其他處理均存在顯著差異。

圖4 不同濃度褪黑素對辣椒低溫弱光脅迫下SOD、CAT活性和超氧陰離子含量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of melatonin on SOD， CAT activity and superoxide anion content of pepper under low temperature and low light stress

圖5為低溫弱光下，不同濃度褪黑素處理對辣椒葉片超氧陰離子的影響，能夠明顯觀察到與T1處理相比，外源噴施褪黑素后葉片顏色明顯變淺，且隨著褪黑素濃度的增大顏色表現(xiàn)為先變淺后有所加深，在T3處理的葉片染色最淺。

圖5 不同濃度褪黑素處理對低溫弱光脅迫下辣椒超氧陰離子的含量Fig.5 Contents of superoxide anions in pepper under low temperature and low light stress treated with different melatonin concentrations

由此可見，在褪黑素濃度為100 μmol·L時(shí)，SOD、CAT活性達(dá)到最高，超氧陰離子含量最低，對辣椒低溫弱光脅迫的緩解作用最好。

3 討論

低溫弱光脅迫對植物的生長發(fā)育有明顯的抑制作用，前人研究表明，低溫弱光脅迫下辣椒的生長發(fā)育水平明顯低于正常水平，其葉片中葉綠素含量明顯下降，進(jìn)而導(dǎo)致葉片失綠和光合能力下降。常靜等對低溫弱光脅迫下辣椒的研究發(fā)現(xiàn)，在低溫弱光或低溫處理時(shí)葉綠素含量都降低且隨著脅迫處理時(shí)間的延長越明顯。高青海等研究表明，低溫弱光脅迫下外源200 μmol·L的褪黑素處理時(shí)，黃瓜葉片葉綠素含量比對照處理的黃瓜幼苗顯著提高13.3%。與前人研究相同，本試驗(yàn)結(jié)果表明，葉片噴施100 μmol·L的褪黑素對低溫弱光的脅迫有緩解作用，可以抑制葉綠素分解，增強(qiáng)低溫弱光脅迫辣椒幼苗光合色素的穩(wěn)定性。

葉綠素吸收的光能主要通過光化學(xué)反應(yīng)、葉綠素?zé)晒獍l(fā)射和熱耗散3種途徑來消耗。李靜研究表明，在低溫弱光脅迫下，辣椒幼苗會發(fā)生光抑制現(xiàn)象，/、(Ⅱ)會明顯下降，()和()會明顯增加。/也是衡量PSⅡ光抑制的重要指標(biāo)，則反映植物以熱形式耗散、不能用于光合電子傳遞的多余光能，是非輻射能量耗散誘發(fā)的熒光猝滅，(Ⅱ)的降低將會影響ATP、NADPH等同化力的形成，造成光合電子傳遞速率的下降，是反映PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學(xué)反應(yīng)電子傳遞的份額，也在一定程度上反映了PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度。本研究結(jié)果表明，100 μmol·L的褪黑素處理能顯著提高低溫弱光下辣椒用于光合作用的能量(Ⅱ)、/、以及，降低、()和，減弱脅迫造成的光抑制程度，用于光化學(xué)反應(yīng)的電子增加，以熱或其他方式耗散的光能減少，與汪正香研究的外源褪黑素對低溫脅迫下嫁接西瓜幼苗生長生理的影響結(jié)果一致，與唐懿等研究結(jié)果也一致，可能是噴施適宜濃度褪黑素之后能最大程度將光能用于光合作用，平衡光能分配，減輕光抑制程度，使葉片吸收的光能被用來碳固定的能量增加，但是低濃度的褪黑素對辣椒葉片光抑制現(xiàn)象緩解不明顯，高濃度的褪黑素(>150 μmol·L)反而也會加重光抑制程度，也與之前的研究結(jié)果一致，即對于同一植物不同濃度的褪黑素可以緩解植物遭受的脅迫傷害，也可能會加速脅迫的傷害。

滲透調(diào)節(jié)作用是植物響應(yīng)逆境脅迫的生理機(jī)制，許多植物的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是可溶性糖，并且對細(xì)胞膜與原生質(zhì)膠體起著穩(wěn)固的作用，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的無機(jī)離子濃度比較高時(shí)會起到一種保護(hù)作用?？扇苄蕴亲鳛闈B透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量增加可以提高植物的抗逆性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，適宜濃度褪黑素處理促進(jìn)了低溫弱光脅迫下辣椒幼苗中可溶性糖積累，說明其積累是辣椒幼苗響應(yīng)低溫弱光脅迫的應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)辣椒幼苗的耐低溫弱光性，這與趙小紅等研究結(jié)果相似，即隨著褪黑素濃度增加，可溶性糖呈現(xiàn)出先增加再降低的趨勢。試驗(yàn)中以100 μmol·L的褪黑素濃度處理效果最好。

在逆境脅迫下植物體內(nèi)將會產(chǎn)生大量活性氧，造成膜系統(tǒng)的氧化損傷。當(dāng)細(xì)胞膜遭到破壞時(shí)，會引起電解質(zhì)滲漏，細(xì)胞滲透性增強(qiáng)，本試驗(yàn)與趙小紅等研究外源褪黑素對低溫脅迫下黃瓜幼苗抗冷性的影響結(jié)果一致，即低濃度的褪黑素會保護(hù)膜系統(tǒng)完整，降低葉片相對電導(dǎo)率，高濃度褪黑素反而會增加葉片相對電導(dǎo)率。張嘉雯等研究表明，外源褪黑素(100 μmol·L)能顯著降低低溫脅迫下煙草體內(nèi)超氧陰離子和MDA含量，減輕對細(xì)胞膜的傷害，這與本研究結(jié)果一致，即適宜濃度的褪黑素能降低脅迫對植物的傷害，但過高的褪黑素濃度反而會使其含量相對增加，這也與吳雪霞等在低溫脅迫下茄子幼苗上的研究結(jié)果一致?？赡苁且?yàn)檫^高濃度的褪黑素反而對植物造成了一定的脅迫作用，抑制植物生長發(fā)育。褪黑素是目前已知的抗氧化作用最強(qiáng)的內(nèi)源性自由基清除劑，它可以改善細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，降低活性氧(ROS)水平。不僅能清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，而且能清除細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上的ROS，這與常見的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)不同。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在低溫弱光脅迫下，葉面噴施一定濃度的褪黑素辣椒幼苗體內(nèi)SOD活性表現(xiàn)為先升高后降低再升高的趨勢，外源施加褪黑素則使CAT活性逐漸升高，這與張嘉雯等研究外源褪黑素對低溫(8 ℃)脅迫下煙草幼苗的影響不同，可能是由于作物與脅迫方式不同，因此，一定濃度范圍內(nèi)的褪黑素可以提高低溫弱光脅迫下辣椒SOD和CAT活性。適宜濃度的褪黑素不僅可以直接作用于自由基，還可以通過提高抗氧化酶的活性來提高植物的抗逆性，這可能是褪黑素提高辣椒耐低溫弱光脅迫的主要機(jī)制之一。

4 結(jié)論

綜上，外源褪黑素能有效增強(qiáng)辣椒在低溫弱光逆境下幼苗的葉綠素含量，增大植株光能捕獲和轉(zhuǎn)化效率，有效緩解了低溫弱光條件對辣椒光合作用的破壞，并通過提高SOD和CAT活性，清除植株體內(nèi)超氧陰離子，促進(jìn)可溶性糖的積累，降低了MDA含量，有效緩解了低溫弱光條件對辣椒的膜脂過氧化作用，保護(hù)了質(zhì)膜的完整性，減少電解質(zhì)的外滲，從而緩解了低溫弱光脅迫對辣椒的抑制和傷害，且褪黑素濃度為100 μmol·L時(shí)效果較好。