褪黑素預處理對桃耐澇性的調控效應

古咸彬，陸玲鴻，宋根華，肖金平，張慧琴

(浙江省農業(yè)科學院 園藝研究所，浙江 杭州 310021)

水分是影響作物生長發(fā)育、產量、品質形成的主要因素，土壤水分過多導致根系受澇漬脅迫，水分缺乏導致植株受干旱影響。桃(L. Batsch)是我國第四大果品，味美多汁，營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛。桃根系淺，需水量大，但怕澇害。澇害導致土壤溶氧量下降，根系供氧困難，造成生理障礙，影響生長發(fā)育和果實品質。我國南方雨量充沛，桃生長期降雨次數多、強度大，尤其近年來極端天氣頻繁出現，雨量分布極不均勻，經常發(fā)生大面積、不同程度的澇害，造成桃產業(yè)嚴重的經濟損失。目前，澇害已成為我國南方桃產區(qū)產業(yè)發(fā)展的主要制約因素。為應對澇害脅迫，培育耐澇砧木是較為有效的策略，但果樹育種周期較長，抗逆性評價較為復雜，育種難度較大。植物澇害響應機制的研究結果表明，抗氧化酶活性強度、活性氧清除能力、滲透調節(jié)物質含量、內源激素水平等直接影響植物耐澇性。因此，通過外源物質改善相關耐澇指標，可作為應對澇害的應急策略。外源物質如細胞分裂素(6-BA)、尿素、γ-氨基丁酸(GABA)、茉莉酸甲酯、NO、Ca等可通過提高保護酶活性、保護光合系統等提高植物耐澇性。

褪黑素(melatonin，MT)是一種多功能的植物生長調節(jié)劑，參與調控植物的發(fā)育階段，包括種子萌發(fā)、器官發(fā)育、光合作用、葉片衰老、品質形成等。褪黑素由色氨酸經4步酶促反應生成，包括色氨酸脫羧酶(tryptophan decarboxylase，TDC)、色胺-5-羥化酶(tryptamine 5-hydroxylase，T5H)、5-羥色胺--乙?；D移酶(serotonin-acetyltransferase，SNAT)、-乙酰基-5-羥色胺-甲基轉移酶(-acetylserotonin methyltransferase，ASMT)，、5、、基因分別編碼以上蛋白質，調控褪黑素的合成。此外，褪黑素通過緩解氧化脅迫、抑制滲透脅迫、促進抗氧化酶活性等調控植物應對鹽害、干旱、高溫、低溫、重金屬等脅迫，并參與非生物脅迫相關的干旱應答元件結合蛋白(dehydration responsive element binding protein，DREB)、熱休克轉錄因子(heat shock transcription factor，HSF)、脫落酸(abscisic acid，ABA)等調控途徑影響植物抗逆性。褪黑素能調節(jié)植物耐澇性。Zheng等發(fā)現，褪黑素通過維持有氧呼吸、保持光合作用和減少氧化損傷緩解澇漬對蘋果種苗的損傷。葉面噴施100 μmol·L褪黑素能緩解淹水脅迫對高粱幼苗光合作用和抗氧化代謝的影響。澇害過程中，褪黑素能提高桃抗氧化酶活性，并有效減少植株膜脂過氧化反應，但存在一定劑量效應，200 μmol·L效果最佳。利用褪黑素提高植物抗逆性在生產中具有重要的應用潛力。

桃抗逆性種質的選育進展緩慢，環(huán)境脅迫具有偶發(fā)性和多發(fā)性，探索外源物質提高桃抗逆性的研究尤為重要。目前，關于褪黑素調節(jié)桃耐澇性的研究較少，褪黑素在桃抗逆性方面的應用尚缺少理論依據。因此，本研究以桃幼苗為試驗材料，以前期試驗篩選出的適宜濃度200 μmol·L褪黑素對材料進行預處理和淹水處理，結合轉錄組測序，研究外源褪黑素對提高桃耐澇性的調控機制，旨在明確褪黑素預處理緩解澇害脅迫的作用效應，以期充實褪黑素的生理功能，促進其在農業(yè)或相關領域的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

以桃(L. Batsch)實生苗為試驗材料，于2020年9月在浙江省農業(yè)科學院園藝研究所進行。桃種子浸泡后去除種皮，置于濕潤濾紙上催芽，有真葉發(fā)生時將其種植于經高壓滅菌后的基質中，基質為泥炭、蛭石和珍珠巖以體積比9∶3∶1混合。于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期為16 h光照/8 h黑暗，溫度為光照25 ℃/黑暗20 ℃，相對濕度70%～80%，光照強度為10 000 lx。

用少量無水乙醇溶解褪黑素粉末(Sigma，分析純)，再用純水定容至200 μmol·L。

1.2 處理

苗長至八葉一心時，選擇長勢一致的植株分為2組，分別施加0和200 μmol·L褪黑素進行預培養(yǎng)。將溶液分別澆灌到各組基質中，盆底有溶液流出為止，每天澆灌1次，預培養(yǎng)5 d。預培養(yǎng)結束后進行淹水處理，水面保持高于基質2～3 cm，正常肥水管理作為對照。預培養(yǎng)與淹水處理均在培養(yǎng)箱中進行，環(huán)境條件與苗期培養(yǎng)相同。處理24 h后，洗凈植株，取嫩葉和根，用液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱中。以上4組處理分別標記為CK(正常澆水)、W24(淹水處理24 h)、MT(200 μmol·L褪黑素預處理后正常澆水)、MT_W24(200 μmol·L褪黑素預處理后淹水處理24 h)。每個處理各6株植株，試驗重復3次。

1.3 生理指標測定

使用SPAD-502便攜式葉綠素測定儀測定相對葉綠素含量，選擇植株頂端完全展開的3片葉子進行測定。

測定葉片相對含水量時將葉片分為2份，首先稱量葉片鮮重，然后將其中1份烘干至恒重，稱量干重，將另1份浸泡在蒸餾水中，當質量不變時稱量葉片的飽和鮮重，相對含水量(%)=(鮮重-干重)/(飽和鮮重-干重)×100。

采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定根系活力，以鮮重計算。

測定葉片相對電導率時將葉片置于裝有10 mL ddHO的玻璃管中，室溫下搖晃12 h，利用DDSJ-308A電導率儀測定水溶液的初始電導率()，將玻璃管置于沸水中水浴20 min，冷卻到室溫后，再次測定水溶液的電導率()，相對電導率(%)=(/)×100。

1.4 RNA提取與cDNA文庫構建與測序

桃根系總RNA的提取利用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN，北京)。1%瓊脂糖凝膠檢測RNA完整性，并利用BioDrop超微量核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度，檢測合格的各樣品RNA送往深圳華大基因進行cDNA文庫構建和測序工作。

1.5 數據處理與基因表達量分析

序列已提交至NCBI數據庫SRA BioProject (PRJNA782223)，對測序得到的原始數據進行去冗余處理，得到有效序列(clean reads)，使用比對軟件 SOAPaligner/soap2將clean reads比對到桃參考基因組(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias=Org_Ppersica)。利用唯一比對的reads數目和比對上參考序列的總reads數目計算基因表達量?；虮磉_量的計算使用FPKM (fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)法，然后將2個樣品的基因表達量進行卡方檢驗。通過多重假設檢驗對值進行校正，校正后取≤0.01并且樣品間FPKM比值(Foldchange)≥1的基因為差異表達基因(differential expression genes， DEGs)。

基于差異基因的功能注釋，對所有差異表達基因進行GO (gene ontology)功能顯著性富集分析。將所有的DEGs比對到GO數據庫中(http：//www.geneontology.org/)，將它們區(qū)分為：Molecular Function、Cellular Component、Biological Process。使用R軟件中的phyper函數進行富集分析，對-value進行FDR校正，通常-value≤0.05的功能視為顯著富集。通過GO數據庫對差異基因進行分類，可確定相關基因參與的生物學進程與相關功能。

在生物體內，各基因之間是相互作用的，相互協調以完成相關生物學進程，基于Pathway的分析能有效地幫助理解生物學功能。KEGG數據庫(http：//www.genome.jp/kegg/)包含了大部分的Pathway信息，可用于分析基因主要參與的調控通路。同樣應用超幾何計算檢驗，找出與參考基因組相比在差異表達基因中顯著富集的Pathway。定義-value≤0.05為顯著富集的通路。

1.6 生物信息學分析

利用轉錄因子數據庫PlantTFDB (http：//planttfdb.gao-lab.org/)信息，下載擬南芥和桃相關轉錄因子數據。利用ClusterW在默認設置下對轉錄因子家族成員氨基酸序列進行同源性分析。利用MEGA6.0軟件中的NJ法構建系統進化樹。利用TBtools進行啟動子分析并可視化，以及表達熱圖分析。

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證

通過差異表達基因分析篩選與澇害相關的基因并進行qRT-PCR分析驗證。根據桃基因組數據庫信息(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias=Org_Ppersica)獲取基因CDS序列。利用Beacon Designer 7軟件設計引物，見表1。qRT-PCR采用SuperReal彩色熒光定量預混試劑盒(TIANGEN，北京)，反應體系：2×SuperReal Color PreMix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L)各0.6 μL，cDNA 2 μL (10 ng)，RNase-free ddHO 6.8 μL。

表1 熒光定量PCR引物

在LightCycler 96熒光定量PCR系統(Roche，巴塞爾，瑞士)進行反應，反應條件為：95 ℃，15 min；95 ℃，10 s，60 ℃，32 s，循環(huán)40次。以為內參，采用2-ΔΔC法，以對照組為參考進行歸一化處理，計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 褪黑素對澇害脅迫下桃生理指標的影響

200 μmol·L褪黑素預處理后桃的相對葉綠素含量、相對含水量、相對電導率與根系活力與對照相比無顯著差異(圖1)。預培養(yǎng)后再進行24 h淹水處理，植株的生長受到一定影響，相對葉綠素含量顯著下降，褪黑素預處理植株同樣下降明顯。24 h淹水處理對葉片相對含水量影響不顯著，4組植株的相對含水量幾乎無差別。淹水使葉片和根系受到一定損傷，細胞膜透性增加，相對電導率顯著上升，根系活力顯著下降。褪黑素預處理后再淹水，相對電導率顯著上升，但顯著低于沒有預處理的植株，根系活力也顯著高于沒有預處理的植株，說明褪黑素對葉片細胞膜和根系有保護作用。

利用SPSS Statistics 17.0軟件進行顯著性差異分析，One-way ANOVA用于顯著性檢驗，Duncan法進行多重比較。柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。SPSS Statistics 17.0 software was used for significant difference analysis， one-way ANOVA was used for significance test， Duncan method was used for multiple comparison. Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05.圖1 淹水處理后桃生理指標的變化Fig.1 Physiological indexes changes of peach after waterlogging treatment

2.2 差異表達基因統計

淹水處理結束后進行桃根系轉錄組測序分析。褪黑素預處理與對照相比，有495個基因顯著上調表達，93個基因顯著下調表達；直接淹水與對照植株相比，3 428個基因顯著上調表達，3 946個基因下調表達(圖2)，下調表達基因數量明顯多于上調基因數量，說明淹水處理對桃整體機能有抑制作用。褪黑素預處理后進行淹水的植株，3 318個基因上調表達，3 928個基因下調表達，上下調基因數量接近直接淹水組。淹水條件下，褪黑素預處理未對澇害響應基因的數量造成影響。

圖2 組間差異表達基因的統計分析Fig.2 Number statistics of differentially expressed genes in groups

2.3 褪黑素調控的基因分析

差異基因的GO富集分析顯示，褪黑素預處理后最顯著富集的term為“microtubule”微管運動和微管組織變化，說明褪黑素對根系的形態(tài)建成具有一定促進作用；與微管關聯之后是氧化還原活性“oxidoreductase activity”(圖3-A)，這類基因與脅迫應答密切相關。進一步分析氧化還原活性相關的基因，65個差異表達基因中55個基因在褪黑素預處理后顯著上調表達，包括(漆酶)、(鋅指蛋白)、(氧化酶)、(過氧化物酶)等脅迫相關基因(圖3-B)，推測褪黑素激活這些基因的表達，有助于植物的應激反應。

A，GO富集分析；B，差異基因的表達熱圖。A， GO enrichment analysis； B， Heat map of differential gene expression.圖3 褪黑素誘導富集的GO通路Fig.3 Enrichment of the GO items induced by melatonin

2.4 共同差異表達基因富集分類分析

淹水處理后，0和200 μmol·L褪黑素預處理的兩組樣品共同差異表達的7 156個基因(圖4-A)在-value<0.05的前提下，富集到多個GOterm中。圖4-B所示為富集氣泡圖，從3個維度展示富集程度，默認以value最小的前20個GO Term。最顯著富集的GO term為分子功能分類中的“DNA-binding transcription factor activity”，該途徑多為轉錄因子，通過結合目的基因啟動子區(qū)域的特定順式作用元件從而調控基因的表達，參與植物生長發(fā)育、響應環(huán)境脅迫等多個方面。該term中含有109個差異表達基因，其中90個基因顯著上調表達(圖4-C)，說明轉錄因子積極響應澇害脅迫，大部分為正向調控。其余富集的GO term包含分子功能分類中的泛素蛋白轉移酶活性“ubiquitin-protein transferase activity”與轉錄調控活性“transcription regulator activity”，較顯著的細胞組分分類為內質網“endoplasmic reticulum”和內膜系統“endomembrane system”。

A，組間比較Venn圖；B，GO富集分析；C，差異基因的表達熱圖。A， Venn diagram between groups； B， GO enrichment analysis； C， Heat map of different expression gene.圖4 共同差異表達基因的GO富集分析與表達熱圖分析Fig.4 GO enrich and expression analysis of common differentially expressed genes

上述顯著富集的轉錄因子涉及14個家族，其中，AP2/ERF家族差異基因最多，達34個(表2)。AP2/ERF家族參與非生物脅迫如干旱、高溫、低溫、鹽害等的應答調控，該家族在桃受澇害脅迫后差異表達基因最多，推測該家族與澇害應答有關。

表2 GO顯著富集通路中差異表達的轉錄因子

AP2/ERF家族根據保守域的數量和結合元件類型分為5個亞族：AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist，差異基因分別有3、29、1、1、0個，進一步說明AP2/ERF家族的ERF亞家族在澇害應答中具有重要作用。桃和擬南芥ERF家族進化樹分析如圖5，對比擬南芥，桃ERF家族分為11個組，各組的差異表達基因比例差異明顯，其中第Ⅶ組全部差異表達，第Ⅸ組差異表達的數量最多(表3)。圖6為AP2/ERF家族34個差異基因的FPKM值，直接反應基因在各樣品中的表達水平，部分基因雖然在組間差異倍數較高，但有可能實際表達水平較低。由圖6可知，Prupe.8G264900在正常條件下表達水平較低，植株澇害處理后該基因顯著上調表達；該基因屬于ERF Ⅶ家族，結合前人關于ERFⅦ在澇害與低氧脅迫中的調控功能，預測Prupe.8G264900為桃澇害應答關鍵基因。

圖5 桃和擬南芥ERF家族進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of ERF family in peach and Arabidopsis thaliana

表3 桃ERF轉錄因子家族成員差異表達基因分布

圖6 差異表達的ERF成員的FPKM統計Fig.6 FPKM number of different expressed ERF family members

2.5 共同差異表達基因富集通路分析

-value≤0.05定義為差異基因顯著富集的Pathway。KEGG富集氣泡圖如圖7-A。糖酵解途徑差異最顯著，該途徑是低氧條件下為機體提供能量的主要途徑。該途徑中45個基因差異表達，涉及糖酵解途徑關鍵酶，如乙醇脫氫酶(ADH)、丙酮酸脫羧酶(PDC)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙酮酸激酶(PK)等。相對表達水平如圖7-B所示，大部分編碼關鍵酶的基因上調表達明顯，這些酶活性的高低直接反映機體抵抗低氧脅迫的能力。

A，KEGG富集氣泡圖；B，糖酵解途徑與合成酶基因的表達熱圖；C，ERF靶基因預測。A， KEGG enrichment analysis； B， Expression heat map of glycolysis pathway genes； C， ERF target gene prediction.圖7 KEGG富集分析及ERF靶基因預測Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis and ERF transcription factor target gene prediction

KEGG富集分析表明，糖酵解途徑在澇害應答中有重要作用，這條途徑中的關鍵酶受誘導表達。GO富集分析表明，ERF轉錄因子能響應澇害，推測ERF與糖酵解途徑存在調控關系。結合桃基因組數據，提取糖酵解途徑45個差異表達基因ATG上游2 000 bp序列進行啟動子分析，通過PLANTCARE預測，發(fā)現6個差異基因啟動子區(qū)含有能被ERF識別的順式作用元件HRPE和GCC-box，元件可視化結果如圖7-C。表明(磷酸果糖激酶)、(果糖-6-磷酸-1-磷酸轉移酶)、(醛縮酶)、(磷酸甘油醛脫氫酶)、(乙醇脫氫酶)可能是ERF的靶基因。

2.6 熒光定量表達驗證

為驗證轉錄組數據的可靠性和有效性，同時檢測相關基因對澇害的響應，利用qRT-PCR檢測了8個基因的表達水平(圖8)，包括Prupe.8G018100(1)、Prupe.1G234000()、Prupe.3G236200(41)、Prupe.1G305900()、Prupe.6G230600(7)、Prupe.8G264900(071)、Prupe.2G258200(15)和Prupe.2G272300(1)轉錄因子和功能基因。經褪黑素預處理后，所檢測的基因均上調表達，澇害處理同樣能提高相關基因的表達量，褪黑素預處理后再經澇害脅迫，大部分基因的表達量進一步升高，僅Prupe.2G258200 (15)和Prupe.2G272300(1)沒有持續(xù)升高，但仍保持高水平表達，由此表明，相關基因與逆境相關，褪黑素對其具有誘導作用，在逆境發(fā)生后能強化應激能力，說明褪黑素對植株的耐受性獲得有一定促進作用。將轉錄組測序的FPKM值與熒光定量結果進行比較分析，2種方法同為檢測基因表達水平，計算方法有所不同，但2種方法的表達趨勢基本一致，驗證了轉錄組數據的可靠性。

圖8 差異表達基因的熒光定量表達驗證Fig.8 qRT-PCR validation of relative expression levels of differential expressed genes

2.7 褪黑素介導澇害響應的調控網絡

圖9為褪黑素參與的澇害響應調控網絡，澇害發(fā)生后會產生低氧信號，通過轉錄因子與功能基因的相互作用，誘導相關基因的表達，從而抵御和適應逆境。褪黑素作為外源物質對植物耐受性獲得具有一定促進作用，包括調控LAC、SRG、POD等相關的氧化反應酶活性，從而促進逆境響應和適應性。此外，褪黑素與低氧信號調控途徑是否有關聯，或在某個調控節(jié)點有關聯有待進一步研究。

圖9 桃響應澇害調控網絡圖Fig.9 Hypothesized regulatory mechanism for melatonin in the waterlogging response pathway

3 討論

隨著全球氣候變暖，洪澇災害時有發(fā)生，澇害已成為植物最常面對和危害最嚴重的非生物脅迫。植物在長久的生長過程中進化出了一套復雜的系統來感知和應對澇害脅迫。對相關響應機制的研究有助于對植物相關調控機理的理解，有助于培育具有抗逆性的作物品種。

褪黑素作為新型植物生長調節(jié)劑，它在調控植物抗逆性方面表現出優(yōu)良效果。0.25 mol·L鹽脅迫下，100 nmol·L外源褪黑素通過增強SOD活性，減緩膜質過氧化，提高了砧木葡萄5BB對NaCl的抵抗力。用100 μmol·L褪黑素對水稻進行浸種能提高幼苗在淹水脅迫下相關農藝性狀與抗氧化酶活性，從而提高水稻存活率。本研究用200 μmol·L褪黑素對桃苗進行預處理再進行淹水脅迫，植株狀態(tài)明顯優(yōu)于直接淹水的植株，膜脂過氧化程度較輕，根系活力得以維持。相關生理結果表明，褪黑素適用于提高桃耐澇性。

葉面噴施褪黑素和灌根處理能增加大豆的株高、葉面積和生物量，促進根系生長，增加根體積和表面積。蛋白組學研究發(fā)現，褪黑素抑制大豆根系木質化程度，減緩細胞降解，擴大細胞間隙從而緩解淹水脅迫對大豆種苗的傷害。本研究中，在苗期對桃植株進行褪黑素預處理和淹水處理，結合轉錄組測序技術，獲得了大量差異表達基因，如編碼LAC(漆酶)、SRG(鋅指蛋白)、ACO(ACC氧化酶)、POD(過氧化物酶)等蛋白的基因。褪黑素預處理后，桃根系微管形態(tài)建成與氧化還原反應等相關基因差異表達，強化根系，提高了植株抵抗能力，尤其是應對淹水導致的低氧環(huán)境。

轉錄因子能特異結合基因啟動子區(qū)的順式作用元件，進而激活或抑制靶基因的轉錄，參與植物生長發(fā)育、脅迫應答等過程。研究表明，AP2/ERF、MYB、bHLH等轉錄因子與澇害相關。ERF是AP2/ERF家族的5個亞家族之一，與澇害脅迫最為緊密，通過GCC-box或HRPE元件調控一系列逆境基因表達，從而提高植物抗低氧能力。Wei等發(fā)現，小麥.1在耐澇和敏感品種中表現出差異的表達模式，組成型表達表明.1具有耐澇功能。獼猴桃2.3屬于ERFⅦ組，該基因通過調控糖酵解途徑關鍵酶基因和的表達水平增強轉基因煙草的耐澇性。桃植株經受澇害后，共同差異表達基因在GO term“DNA-binding transcription factor activity”顯著富集，該分類全部為轉錄因子，大部分為上調表達，其中AP2/ERF成員最多(34/108)，包含29個ERF亞族成員(29/34)，進一步說明ERF轉錄因子在澇害響應中的特殊地位。結合擬南芥ERF家族進化樹分析，將桃ERF家族分為11個組，其中第Ⅶ組成員Prupe.8G264900的FPKM表達量最高，其可能為桃響應澇害的關鍵基因。

澇害發(fā)生后，糖酵解途徑和乙醇代謝途徑是植物主要的能量來源，PDC、ADH、LDH被認為是澇害相關的關鍵酶。Wei等發(fā)現，芝麻遭遇澇害后，澇敏感品種中LDH活性顯著增加，表明乳酸在敏感品種中積累較多。在耐澇品種中主要表現為PDC活性和ADH活性的增加，該途徑主要產生乙醇。KEGG富集分析用于差異表達基因的功能注釋，能進一步了解差異表達的基因的相關功能和作用通路。受澇害脅迫后，桃差異表達的基因集中于糖酵解途徑“glycolysis and gluconeogenesis”，該途徑中上述ADH和PDC，以及ALD、PFK的編碼基因大量上調表達，表明這些差異基因與桃響應澇害相關。與耐澇芝麻代謝途徑類似，桃的乙醇代謝途徑更為活躍。結合ERF轉錄因子與啟動子的結合特性，以及糖酵解途徑差異基因的啟動子區(qū)域分析，預測到、、、、是ERF家族的靶基因。、等基因上調表達促進機體糖酵解產生ATP，為桃提供能量抵御低氧環(huán)境。

綜上所述，根系淹水對桃植株造成澇漬脅迫，低氧環(huán)境抑制根系呼吸，根系活力下降，機體內部氧化產物過量生成，植物通過應激反應，啟動相關基因的表達，包括轉錄因子與功能蛋白。本研究發(fā)現，ERF轉錄因子家族成員迅速響應低氧脅迫，積極上調表達，最顯著的是Ⅶ組的Prupe.8G264900，通過HRPE和GCC-box元件的結合作用，調控下游糖酵解途徑關鍵酶基因的表達，協同完成澇害應答和適應性反應。褪黑素是否參與ERF響應澇害的調控網絡有待進一步研究。