基于響應面法的乳酸菌發(fā)酵藜麥秸稈工藝條件優(yōu)化

呂 敬，吳治勇，郭曉農，馮玉蘭，盧建雄，柴薇薇

(西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

藜麥(Willd.)是藜科藜屬植物，由于其原產自南美洲安第斯山脈，故又稱南美藜。藜麥是印加土著居民日常生活的傳統(tǒng)糧食，其栽培歷史和食用歷史據今已有5 000～7 000年之久。藜麥的氨基酸比例較接近聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織(FAO)提出的理想比例，蛋白質含量達到12%～23%。相比其他谷類糧食，藜麥的膳食纖維含量豐富，并富含多種礦物質、維生素等。目前，我國山西、吉林、河北、青海、甘肅等多個省份的藜麥種植面積已經達到一定規(guī)模，據統(tǒng)計，2019年甘肅省的藜麥種植面積已達60 km。

甘肅省地處黃土高原、青藏高原和內蒙古高原的交匯地帶，境內高寒地區(qū)具有海拔高、晝夜溫差大、環(huán)境質量優(yōu)異、農耕文明悠久等得天獨厚的藜麥種植條件，是發(fā)展藜麥產業(yè)的理想種植地區(qū)。在甘肅高寒山區(qū)發(fā)展藜麥種植業(yè)，在獲得藜麥雜糧的同時，還可將藜麥秸稈收獲后用于牛羊養(yǎng)殖業(yè)，再將牛羊糞便返回農田，形成有機循環(huán)農業(yè)，優(yōu)勢明顯，開發(fā)前景廣闊。

對于藜麥植株而言，整體占比較大的部位就是黎麥秸稈，成熟的藜麥秸稈高達2 m左右。目前，絕大部分的藜麥秸稈被焚燒，資源化利用率很低。未來，隨著藜麥種植規(guī)模的擴大，大量的藜麥秸稈有待尋求更有效的途徑進行開發(fā)利用。其實，藜麥秸稈的營養(yǎng)特性賦予了其獨特的飼用優(yōu)勢。藜麥秸稈中的纖維素、蛋白質、脂肪含量接近玉米秸稈，而木質素含量卻明顯低于玉米秸稈，這些特性顯著降低了藜麥秸稈用作飼料時木質素對動物胃蛋白酶、胰蛋白酶的酶解抗性，使其具有柔軟蓬松的性質，適口性更好，既有利于動物的主動采食，又有利于動物的消化吸收，較其他秸稈更加適用于飼料生產。此外，Carlson等研究發(fā)現，藜麥粗糠中的皂苷種類豐富，且對調控瘤胃微生物發(fā)酵、提高氮存留率和抑制瘤胃甲烷(CH)產量有益，可用作動物綠色飼料。因此，將藜麥秸稈進行加工后開發(fā)為飼料，有望成為未來藜麥秸稈開發(fā)利用的主要研究方向和實現藜麥秸稈資源化利用的主要手段。

近年來，有關藜麥秸稈的研究日益增多。陳光等對藜麥全植株的綜合利用和開發(fā)前景進行了綜述，認為藜麥全株皆有利用價值，均能產生一定的經濟效益。張慧玲研究了不同處理下汽爆發(fā)酵對藜麥秸稈成分組成、纖維結構和風味的影響。魏玉明等研究了不同添加劑對藜麥秸稈青貯后綜合品質的影響。此外，還有研究表明，益生菌能夠有效提高黃貯秸稈的營養(yǎng)價值。例如：利用裂褶菌、酵母菌作為發(fā)酵微生物，可以提高玉米秸稈黃貯發(fā)酵的品質；經過纖維素酶、木聚糖酶和黃孢原毛平革菌混合發(fā)酵后，黃貯玉米秸稈的纖維素含量顯著降低。黃貯飼料全年均可生產，通過乳酸菌對黃貯玉米秸稈進行發(fā)酵，既可改善其飼喂價值，又能同時解決北方地區(qū)農作物收獲期與青貯飼料生產時間相悖的問題。由此推測，如能利用微生物對大量藜麥秸稈進行發(fā)酵處理，有望提高藜麥秸稈的利用效率。然而，有關藜麥秸稈的微生物發(fā)酵條件在本研究檢索范圍內還鮮見報道。為此，本研究特以乳酸菌為發(fā)酵微生物，基于Box-Behnken設計原理優(yōu)化藜麥秸稈的發(fā)酵工藝，并測定不同條件下發(fā)酵后藜麥秸稈的粗蛋白質含量，以期為開發(fā)藜麥秸稈黃貯飼料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥秸稈取自甘肅省蘭州市榆中縣夏官營鎮(zhèn)。秸稈收獲后，放置風干至黃貯，在無菌操作臺上將其切碎為小段，每段長度為2 cm。同時，測定其含水量和粗蛋白質含量。

發(fā)酵所用菌種為市售壯樂美牌乳酸桿菌(粉劑)。

主要儀器包括：海能K9840型自動凱式定氮儀，山東海能科學儀器有限公司；鴻奕101-2A型電熱鼓風干燥箱，山東屹盛重工科技有限公司；PH-010型烘干培養(yǎng)兩用箱，上海一恒科學儀器有限公司；拜杰QH-1688型真空包裝機，浙江德清拜杰廚衛(wèi)科技有限公司；比朗BILON-DFY-400C型小型粉碎機，上海比朗儀器制造有限公司。

1.2 單因素試驗設計

1.2.1 秸稈發(fā)酵時間對藜麥秸稈感官品質和粗蛋白質含量的影響

在避光真空密閉的條件下，控制秸稈含水量為60%、乳酸菌添加量為10 mg·kg、發(fā)酵溫度為30 ℃，分別設定發(fā)酵時間為5、10、15、20、25、30 d。發(fā)酵完畢后，進行感官品質評定，并取樣2 g測定粗蛋白質含量。

1.2.2 乳酸菌添加量對藜麥秸稈感官品質和粗蛋白質含量的影響

在避光真空密閉的條件下，控制發(fā)酵時間為25 d、發(fā)酵溫度為30 ℃、秸稈含水量為60%，分別設定乳酸菌添加量為2、4、6、8、10、12 mg·kg。發(fā)酵完畢后，進行感官品質評定，并取樣2 g測定粗蛋白質含量。

1.2.3 秸稈含水量對藜麥秸稈感官品質和粗蛋白質含量的影響

在避光真空密閉的條件下，控制發(fā)酵時間為25 d、發(fā)酵溫度為30℃、乳酸菌添加量為10 mg·kg，分別設定秸稈含水量為20%、30%、40%、50%、60%、70%。發(fā)酵完畢后，進行感官品質評定，并取樣2 g測定粗蛋白質含量。

1.3 響應面法優(yōu)化試驗設計

根據Box-Behnken設計原理，在單因素試驗的基礎上，選取對藜麥秸稈黃貯飼料粗蛋白質含量有顯著影響的發(fā)酵時間、乳酸菌添加量、秸稈含水量3個因素作為自變量，以發(fā)酵后黃貯飼料的粗蛋白質含量為響應值，進行3因素3水平的響應面分析試驗，優(yōu)化藜麥秸稈發(fā)酵工藝。

1.4 指標測定

1.4.1 藜麥秸稈發(fā)酵飼料感官評定

當藜麥秸稈發(fā)酵完成后，開啟黃貯袋，根據《青貯飼料質量評定標準(試行)》，從氣味、色澤、質地、pH值4方面進行感官評定。按照其分值，分別評為優(yōu)良、良好、一般和劣質。

1.4.2 藜麥秸稈粗蛋白質含量測定

精確稱取2 g樣品(準確至0.000 1 g)，將樣品磨碎至粉末狀，置于消化管中，加硫酸銅0.8 g、無水硫酸鉀12 g，混合均勻，加入濃硫酸40 mL和碎瓷片1～2片，放置在電熱爐上加熱，待內容物全部炭化、停止冒泡后，加大火力，至變?yōu)橥该魃钏{色溶液，繼續(xù)加熱2 h，取下，放置至冷卻。使用自動凱式定氮儀測定粗蛋白質含量。

1.5 數據處理

每組試驗做3次平行，結果取平均值。采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析。采用Design-Expert 10.0軟件進行響應面設計與結果分析。采用Sigma plot 14.0軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 藜麥秸稈的營養(yǎng)成分分析

發(fā)酵之前，經測定，試驗用的藜麥秸稈的粗蛋白質含量為6.36%。查閱相關文獻可知，藜麥秸稈中還含有較為豐富的纖維素(33.88%)、半纖維素(20.32%)和木質素(18.18%)，以及一定的粗脂肪(2.52%)。與玉米秸稈粗蛋白質含量6.14%、粗脂肪含量1.97%、半纖維素含量17.38%、木質素含量27.81%、纖維素含量32.28%相比，藜麥秸稈的粗蛋白質、粗脂肪、纖維素、半纖維素含量均更高，而木質素含量更低，推測其更適于反芻動物的消化和吸收。

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵后藜麥秸稈感官品質和粗蛋白質含量的影響

當發(fā)酵時間≤15 d時，發(fā)酵后的藜麥秸稈的pH值均高于4，說明發(fā)酵時間尚短，乳酸菌還不能充分地氧化代謝，秸稈的感官品質難以得到很好的改善(表1)。當發(fā)酵時間為20～30 d時，感官評定等級最高，樣品變得松散軟糯，質地得到改善。

表1 不同發(fā)酵時間下發(fā)酵后藜麥秸稈的感官評定結果

隨發(fā)酵時間延長，發(fā)酵后的藜麥秸稈的粗蛋白質含量呈現先升后降的趨勢(圖1)。當發(fā)酵時間為20～30 d時，發(fā)酵后藜麥秸稈的粗蛋白質含量較為穩(wěn)定。當發(fā)酵時間為25 d時，發(fā)酵后藜麥秸稈的粗蛋白質含量顯著(<0.05)高于未發(fā)酵的秸稈。

圖1 發(fā)酵時間對秸稈粗蛋白含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on crude protein content of straw

結合單因素試驗結果，在Box-Behnken中心組試驗設計中，將發(fā)酵時間設定為20～30 d。

2.2.2 乳酸菌添加量對發(fā)酵后藜麥秸稈感官品質和粗蛋白質含量的影響

當乳酸菌添加量為10～12 mg·kg時，發(fā)酵后的藜麥秸稈的pH值均在4.0以下，氣味為甘酸味，秸稈脈絡清晰且松散軟糯，色澤明亮鮮黃，感官評定等級最高，均為優(yōu)良(表2)。

表2 不同乳酸菌添加量下發(fā)酵后藜麥秸稈的感官評定結果

發(fā)酵后藜麥秸稈的粗蛋白質含量隨著乳酸菌添加量的增加而增加(圖2)。當乳酸菌添加量為2～4 mg·kg時，發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量較低。這可能是由于乳酸菌添加量過少，發(fā)酵效果較弱。當乳酸菌添加量為8～12 mg·kg時，發(fā)酵后的藜麥秸稈的粗蛋白質含量較未發(fā)酵秸稈明顯增加，其中，當乳酸菌添加量為12 mg·kg時，發(fā)酵后的藜麥秸稈的粗蛋白質含量最高。

圖2 乳酸菌添加量對秸稈粗蛋白含量的影響Fig.2 Effect of addition amount of lactic acid bacteria on crude protein content of straw

結合單因素試驗結果，在Box-Behnken中心組試驗設計中，將乳酸菌添加量設定為8～12 mg·kg。

2.2.3 秸稈含水量對發(fā)酵后藜麥秸稈感官品質和粗蛋白質含量的影響

當秸稈含水量為50%～60%時，發(fā)酵后的藜麥秸稈的感官評定等級最高，均為優(yōu)良(表3)。對比發(fā)現，秸稈含水量過高或過低均會使發(fā)酵秸稈的感官評定結果變差。當秸稈含水量≥70%時，會引起秸稈酸敗，氣味酸臭刺鼻，秸稈質地黏連結塊；當秸稈含水量<40%時，乳酸菌不能很好地氧化代謝，秸稈品質難以得到充分改善，pH值過高，顏色為暗黃色，質地略硬，感官評定等級一般。

表3 不同秸稈含水量下發(fā)酵后藜麥秸稈的感官評定結果

當秸稈含水量低于50%時，發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量較低(圖3)。這可能是由于秸稈含水量過低，營養(yǎng)物質大量損耗造成的。當秸稈含水量為50%～70%時，發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量較為穩(wěn)定。當秸稈含水量為60%時，發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量最高。

圖3 秸稈含水量對秸稈粗蛋白質含量的影響Fig.3 Effect of water content of straw on crude protein content of straw

結合單因素試驗結果，在Box-Behnken中心組試驗設計中，將秸稈含水量設定為50%～70%。

2.3 響應面設計結果與分析

為進一步研究各因素之間的交互作用，利用Design-Expert 10.0軟件，以發(fā)酵時間()、乳酸菌添加量()、秸稈含水量()為自變量，以發(fā)酵后的藜麥秸稈的粗蛋白質含量為響應值()，進行3因素3水平的響應面設計(表4)，開展試驗(表5)，并進行相應的數據分析。

表4 響應面試驗的因素及其水平

表5 響應面試驗方案與結果

經多元回歸分析，得到如下擬合方程：

=6.646+6.625×10+0.410+0.141-1.175×10-0155-1.750×10-0388-1.705×10-0.463。

對擬合的回歸方程進行方差分析，結果顯示，模型通過<0.05水平的顯著性檢驗，說明該模型具有統(tǒng)計學意義。基于值判斷，各因素對發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量的影響從大到小依次為>>，即乳酸菌添加量>秸稈含水量>發(fā)酵時間。擬合的回歸方程的決定系數()為0.991 9，校正決定系數為0.981 5，說明其與真實數據的擬合程度良好，具有實踐指導意義，可以用該擬合方程來指導藜麥秸稈發(fā)酵工藝優(yōu)化。

發(fā)酵時間和乳酸菌添加量的交互作用對發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量的影響呈拱形曲面分布，縱向跨度較大，且等高線呈現橢圓形(圖4)，表明二者的交互作用對發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量影響顯著。當發(fā)酵時間一定時，隨著乳酸菌添加量的增加，發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量呈遞增趨勢；當乳酸菌添加量一定時，隨著發(fā)酵時間延長，發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量呈現先增加后減小的趨勢。相較而言，乳酸菌添加量方向的曲面出現較大幅度的波動，表明相較于發(fā)酵時間，乳酸菌添加量對發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量的影響更大。

圖4 發(fā)酵時間(A)和乳酸菌添加量(B)的交互作用對發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量的影響Fig.4 Effect of interaction between fermentation time (A) and addition amount of lactic acid bacteria (B) on crude protein content of fermented straw

發(fā)酵時間和秸稈含水量的交互作用對發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量的影響呈拋物曲面分布(圖5)，發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量隨發(fā)酵時間和秸稈含水量的增加均呈現先增后減變化。在這二者的交互作用中，秸稈含水量對粗蛋白質含量的影響相較于發(fā)酵時間更大。

圖5 發(fā)酵時間(A)和秸稈含水量(C)的交互作用對發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量的影響Fig.5 Effect of interaction between fermentation time (A) and water content of straw (C) on crude protein content of fermented straw

秸稈含水量和乳酸菌添加量的交互作用對粗蛋白質含量的影響呈拱形曲面分布(圖6)。二者中，乳酸菌添加量是更為敏感的影響因子，引起曲面波動較大。

圖6 乳酸菌添加量(B)和秸稈含水量(C)的交互作用對發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量的影響Fig.6 Effect of interaction between addition amount of lactic acid bacteria (B) and water content of straw (C) on crude protein content of fermented straw

以發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量最大為優(yōu)化目標，利用Design-Expert 10.0軟件求取全局最優(yōu)解，結果表明，最優(yōu)工藝為發(fā)酵時間24.594 d，乳酸菌添加量11.775 mg·kg，秸稈含水量59.813%。在此條件下，預測的發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量為6.873%。

根據軟件預測結果，結合實際工藝設置的可行性，將發(fā)酵工藝調整為發(fā)酵時間24.5 d，乳酸菌添加量12 mg·kg，秸稈含水量60%。在此條件下進行3次驗證試驗，測得發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量為(6.93±0.05)%，與預測結果接近，表明本研究所采用的方法有效且可行。

3 討論

3.1 不同發(fā)酵條件對藜麥秸稈感官品質和pH值的影響

相關研究表明，飼草表面附著的乳酸菌在很多條件下難以很好地啟動發(fā)酵進程，需要通過外源添加乳酸菌來加速發(fā)酵過程，降低pH值，并抑制不良微生物的繁殖。乳酸菌利用植物中的可溶性碳水化合物作為底物，產生乳酸，降低發(fā)酵飼料的pH值。本研究利用乳酸菌對藜麥秸稈進行發(fā)酵后，未產生腐敗的跡象，且秸稈脈絡清晰，顏色為亮黃色，質地松散軟糯，酸味適中，pH值在3.5～5.0。這說明，適當地使用乳酸菌可以在很大程度上保證發(fā)酵的成功。一般來說，乳酸菌能快速降低秸稈pH值，增加有機酸含量，且以使秸稈pH值降到4.2以下為最佳。根據本研究結果，當發(fā)酵時間為20～30 d、乳酸菌添加量為10～12 mg·kg、秸稈含水量為50%～60%時，發(fā)酵秸稈的pH值可以保持在4.0及以下，感官評定等級較高。

3.2 發(fā)酵時間對發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量的影響

本研究中，當藜麥秸稈的發(fā)酵時間為20～30 d時，發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量較為穩(wěn)定，且較發(fā)酵前略有增加。根據代素貞等的研究，添加乳酸菌可減少蛋白質的損失，同時可產生菌體蛋白。添加微生物菌劑能有效縮短發(fā)酵時間，增加秸稈堆體內的微生物數量，促進發(fā)酵進程。發(fā)酵時間過短時，乳酸菌利用秸稈的干物質進行代謝繁殖，但產生的菌體蛋白還未累積，可能受此影響，本試驗5～15 d內發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量并未顯著提高。發(fā)酵時間過長也不利于提高秸稈品質。這是因為，適宜的可溶性碳水化合物是黃貯發(fā)酵的前提，隨著發(fā)酵時間延長，pH值降低，以及可溶性碳水化合物的減少都將抑制乳酸菌的生長繁殖。這可能是導致發(fā)酵30 d的藜麥秸稈粗蛋白質含量略低于發(fā)酵25 d時的原因之一。

3.3 乳酸菌添加量對發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量的影響

乳酸菌屬革蘭氏陽性菌，厭氧呼吸，不形成孢子，具有耐酸和附生的特性。大多數乳酸菌最適于代謝繁殖的溫度為30 ℃。為此，本研究也將乳酸菌發(fā)酵藜麥秸稈的溫度設定為30 ℃。在發(fā)酵過程中，藜麥秸稈的水溶性碳水化合物和干物質可以為乳酸菌的生長提供營養(yǎng)物質，從而促進乳酸菌的增殖。此外，發(fā)酵時適當地添加乳酸菌也可以起到抑制有害微生物生長活性、提高秸稈營養(yǎng)成分和改善秸稈纖維結構的作用，且可以有效降低秸稈發(fā)酵中營養(yǎng)成分的損失，提高發(fā)酵品質。本研究結果顯示，發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量隨著乳酸菌添加量的增加而增加，說明添加乳酸菌可改善發(fā)酵過程中的微生態(tài)系統(tǒng)，使益生菌成為主要優(yōu)勢菌群，產生營養(yǎng)物質，為其他微生物發(fā)酵提供充足底物，快速增加有機酸的種類和含量，降低體系pH值和氨態(tài)氮含量，進而提高黃貯秸稈的發(fā)酵品質。本研究結果與向玉米秸稈黃貯和玉米秸稈青貯中添加乳酸菌的研究相似，適量添加乳酸菌均提高了秸稈表面乳酸菌的數量，使其能夠利用秸稈中的可溶性糖，迅速降低pH值，增加粗蛋白質含量，從而有效提高發(fā)酵品質。

3.4 秸稈含水量對發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量的影響

前人研究表明，用乳酸菌發(fā)酵玉米黃貯秸稈時，將水分控制在60%時，發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量最高，酸性洗滌纖維含量最低，玉米秸稈黃貯的發(fā)酵品質最好。本研究同樣發(fā)現，當秸稈含水量為60%時，發(fā)酵后的藜麥秸稈感官等級最佳，且粗蛋白質含量最高。這與玉米黃貯秸稈發(fā)酵結果基本吻合，也進一步驗證了該秸稈含水量條件下進行發(fā)酵的可行性。原料含水量易影響乳酸菌的代謝繁殖活性，進而影響黃貯秸稈的營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質。在本研究中，當秸稈含水量低于50%時，發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量較低，其原因可能是秸稈含水量過低時乳酸菌活性較弱。而且，秸稈含水量低時，不易壓實，也容易致使其他微生物成為優(yōu)勢菌，從而造成霉敗。當秸稈含水量升高到70%后，發(fā)酵后的藜麥秸稈粗蛋白質含量降低。這可能是由于含水量過高導致秸稈營養(yǎng)物質滲出，從而引起營養(yǎng)成分損失。此外，高含水量環(huán)境還不利于乳酸菌的生長，會導致乳酸發(fā)酵不足，生成一些不穩(wěn)定的產物，使得乳酸含量較低，pH值下降較慢。另外，含水量過低時，乳酸菌活性差，發(fā)酵效果甚微，發(fā)酵感不明顯。綜合前人研究和本試驗結果，秸稈含水量過高或過低都不利于黃貯秸稈發(fā)酵，以秸稈含水量保持在60%左右最佳。在此條件下，既可使可溶性碳水化合物等養(yǎng)分濃縮，有利于乳酸菌發(fā)酵，又能保證乳酸菌代謝繁殖活性，提高黃貯秸稈品質。

3.5 響應面法在藜麥秸稈發(fā)酵工藝優(yōu)化中的作用

響應面法通過多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，并對受多個變量影響的響應值進行建模和分析，可用于尋求最優(yōu)工藝參數。該方法在畜禽日糧營養(yǎng)分析、固態(tài)發(fā)酵飼料等方面均已得到一定的應用。本研究使用響應面法對藜麥秸稈黃貯發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，相較于正交試驗來說，試驗組少，對試驗的各個水平可快速分析，并能夠獲得連續(xù)的預測模型。經響應面法優(yōu)化的藜麥秸稈乳酸菌發(fā)酵工藝，可以為后續(xù)藜麥秸稈發(fā)酵飼料的研發(fā)奠定一定的工藝基礎。