Notch2在子癇前期患者胎盤(pán)中的表達(dá)及其對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響

馮 祥 譚艷玲 許夢(mèng)梵 熊呈鳳 朱弘宇 葉 紅 李 華

(1. 三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 產(chǎn)科， 湖北 宜昌 443003; 2. 三峽大學(xué) 人民醫(yī)院[宜昌市第一人民醫(yī)院] 骨科， 湖北 宜昌 443000)

子癇前期(preeclampsia，PE)為妊娠期特有并發(fā)癥，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前研究表明，PE的發(fā)病與胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移能力降低進(jìn)而導(dǎo)致胎盤(pán)淺著床及子宮螺旋動(dòng)脈重塑不良有著重要聯(lián)系[1-3]，但有關(guān)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、遷移功能的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。研究表明，Notch2信號(hào)通路在胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞上廣泛表達(dá)，與滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、分化、遷移等多個(gè)過(guò)程相關(guān)，可能對(duì)胎盤(pán)的功能產(chǎn)生重要影響[4-7]。本研究擬探討Notch2對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響，及其與PE發(fā)病產(chǎn)生的聯(lián)系，為闡明PE的發(fā)病機(jī)制和尋找可能的臨床解決方案提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 組織實(shí)驗(yàn)

1.1.1 胎盤(pán)組織的收集

孕早期絨毛標(biāo)本：2020年7月～2020年8月在我院要求行人工流產(chǎn)的孕6～8周的患者，無(wú)不良孕產(chǎn)史和家族史，選取活胚胎絨毛5例。胎盤(pán)：選取2020年1月～2020年10月在我院產(chǎn)科分娩的孕晚期正常產(chǎn)婦胎盤(pán)10例，PE患者胎盤(pán)6例。標(biāo)本收集后用無(wú)菌生理鹽水漂洗，并立即用4%的甲醛液固定待用。PE的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)謝幸教授主編的第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》。所有研究對(duì)象均為單胎，既往無(wú)腎臟疾病、心臟病、高血壓、甲狀腺功能亢進(jìn)、糖尿病及導(dǎo)致血管病變和缺氧改變的其它合并癥，且孕期無(wú)急、慢性感染性疾病。該研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均知情并同意。

1.1.2 免疫組化

將蠟塊包埋后的絨毛及胎盤(pán)組織切片，進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。具體操作步驟按照辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)(凱基生物)進(jìn)行。CK7一抗?jié)舛葹?∶300，Notch2一抗?jié)舛?∶250(下同)。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1 主要試劑

RIPM1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco)、多克隆兔抗cytokeratin7(CK7)抗體(Abcam)、Notch2多克隆抗體(Cell Signal Technology)、MTT試劑盒(博奧拓達(dá))、基質(zhì)膠(BD Matrigel)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR8/SVneo購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心，用含10%胎牛血清的RIPM1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：Control組細(xì)胞無(wú)任何干預(yù)；空白慢病毒載體作為陰性對(duì)照組(Notch2 Negative Control， Notch2-NC)；Notch2 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染為Notch2 siRNA實(shí)驗(yàn)組。

1.2.3 免疫熒光染色法

HTR8/SVneo株處理后經(jīng)過(guò)爬片，在4℃條件下用4%多聚甲醛固定10 min；PBS漂洗3次，常溫下山羊血清封閉1.5 h；滴入濃度為1∶250的兔抗人Notch2多克隆一抗抗體，4℃孵育48 h；PBS漂洗3次，用濃度為1∶50的異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的二抗37℃避光孵育2 h；碘化丙啶(propidium iodide，PI)熒光染核1.5 min；PBS漂洗封片。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況及位置。

1.2.4 慢病毒載體構(gòu)建與細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)染

干擾慢病毒由上海吉瑪公司包裝。Notch2小干擾RNA序列(5’-GCAGGTAGCTCAGACCATTCT-3’)克隆入慢病毒載體產(chǎn)生Notch2 siRNA慢病毒。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化重懸后，接種于6孔板，生長(zhǎng)過(guò)夜；按照病毒滴度加入稀釋后的慢病毒載體液?？瞻茁《据d體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照組Notch2-NC，Notch2 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組?；旌暇鶆蚝蠓胖门囵B(yǎng)箱培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)Notch2 mRNA下調(diào)效果，挑選最佳孵育時(shí)間的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2.5 MTT實(shí)驗(yàn)

用含10%胎牛血清培養(yǎng)液配置單細(xì)胞懸液，以每孔1×104細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200 μL。Notch2-NC對(duì)照組和Notch2 siRNA實(shí)驗(yàn)組按照病毒滴度加入Notch2空白慢病毒和干擾慢病毒，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h；每孔加200 μL MTT溶液(0.5 mg/mL，PBS配制)，37℃孵育4 h，小心吸出孔內(nèi)上清，每孔加入200 μL DMSO，振蕩混勻10 min，使結(jié)晶物融解充分。酶標(biāo)儀上選取560 nm波長(zhǎng)，測(cè)定OD值，分析計(jì)算結(jié)果。

1.2.6 Real time PCR檢測(cè)Notch2 mRNA的表達(dá)

PCR引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成，Notch2上游引物：5’-CCTTCCACTGTGAGTGTC-TGA-3’，下游引物：5’-AGGTAGCATCATTCTGGCAGG-3’。GAPDH上游引物；5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’[8]。根據(jù)總RNA提取試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)提取HTR8/SVneo細(xì)胞的總RNA，取1 μg mRNA樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按PCR試劑盒說(shuō)明步驟加入反應(yīng)體系，使用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)總體系為20 μL，內(nèi)參為GAPDH，檢測(cè)Notch2 mRNA水平。PCR循環(huán)為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s， 60℃退火20 s，72℃延伸15 s，45個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt法統(tǒng)計(jì)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)

(1)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將病毒載體感染的細(xì)胞用胰酶消化，上室中加入200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞懸液(1.5×105個(gè)細(xì)胞)，在Transwell下室加入600～800 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。置培養(yǎng)箱孵育24 h，小心取出Transwell小室，去除上室液體，用濕棉棒輕柔擦去上室內(nèi)底部濾膜表面的細(xì)胞，濾膜外表面的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)有效細(xì)胞，用多聚甲醛固定10 min，甲醇通透10 min，PBS液洗滌3次，結(jié)晶紫染色3～5 min。隨機(jī)選擇10個(gè)視野，細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。

(2)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

基質(zhì)膠在4℃過(guò)夜融化，基質(zhì)膠與提前預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基按1∶5比例稀釋混勻，冰上操作。在Transwell小室底部中央垂直均勻加入稀釋好的基質(zhì)膠60 μL，37℃孵育40 min，固化成膠狀后待用；再加入50 μL無(wú)血清培養(yǎng)基孵育30 min使基膜水化。其余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Notch2在絨毛和胎盤(pán)組織的表達(dá)

通過(guò)免疫組化檢測(cè)Notch2蛋白在孕早期絨毛、孕晚期正常胎盤(pán)和PE胎盤(pán)上的表達(dá)情況。早期絨毛組化切片觀察到了絨毛上滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲進(jìn)入到母體蛻膜層的過(guò)程(圖1A)，與Zhao等[9]研究中滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲遷移到蛻膜過(guò)程的示意圖相同(圖1B)。

注： A：免疫組化檢測(cè)Notch2蛋白(棕色)在孕早期絨毛的滋養(yǎng)細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞上都有表達(dá)，但在滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)水平較高，同時(shí)功能細(xì)胞(EVT、CC、CT、ST)上也有Notch2蛋白的表達(dá)；B：Zhao等[9]研究中孕早期絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲到蛻膜層示意圖，早期絨毛錨定附著在母體蛻膜(MD)上，滋養(yǎng)細(xì)胞(CT)增殖形成細(xì)胞柱(CC)，粘附在母體蛻膜(轉(zhuǎn)化的子宮內(nèi)膜)上，絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(EVTs)侵入母體蛻膜和肌層；C：正常胎盤(pán)組織上的Notch2表達(dá)，可見(jiàn)Notch2在胎盤(pán)的滋養(yǎng)細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞上均有表達(dá)，但主要在滋養(yǎng)細(xì)胞上表達(dá)；D：PE胎盤(pán)上Notch2蛋白的表達(dá)，其表達(dá)水平低于正常組胎盤(pán)；E：未加一抗的胎盤(pán)組織為空白對(duì)照組；F：CK7標(biāo)記的胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞位置。CT：滋養(yǎng)細(xì)胞；EVT：絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞；CC：細(xì)胞柱；MD：母體蛻膜；ST：合胞體滋養(yǎng)層；VS：絨毛基質(zhì)；IVS：絨毛間隙；ET：血管內(nèi)滋養(yǎng)層細(xì)胞

免疫組化結(jié)果顯示，Notch2蛋白在孕早期絨毛、孕晚期正常和PE胎盤(pán)上都有表達(dá)，表達(dá)位置主要在滋養(yǎng)細(xì)胞上(圖1)。通過(guò)分析Notch2蛋白免疫組化結(jié)果的吸光度來(lái)評(píng)估其表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在孕早期絨毛上Notch2蛋白相對(duì)表達(dá)量與孕晚期正常胎盤(pán)組織表達(dá)量相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PE組的Notch2蛋白相對(duì)表達(dá)量與孕早期絨毛及正常組相比明顯下調(diào)(均P<0.05，圖2)。

注：與PE組相比，*P<0.001

2.2 Notch2蛋白在滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR8/SVneo的表達(dá)

細(xì)胞免疫熒光結(jié)果提示，Notch2蛋白在HTR8/SVneo細(xì)胞有豐富的表達(dá)(圖3)，表達(dá)的主要位置為胞膜。

注：Notch2蛋白在HTR8/SVneo細(xì)胞上均有表達(dá)，F(xiàn)ITC染色綠色熒光為目標(biāo)蛋白，PI紅色熒光為細(xì)胞核

2.3 Notch2 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

Notch2 siRNA轉(zhuǎn)染HTR8/SVneo細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，與Notch2-NC組相比，Notch2 mRNA的表達(dá)水平均明顯下調(diào)(均P<0.001，圖4A)。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，Notch2 siRNA組的HTR8/SVneo細(xì)胞生存率與Control組或Notch2-NC組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05，圖4B)。Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，Notch2 siRNA轉(zhuǎn)染組HTR8/SVneo細(xì)胞的侵襲和遷移能力與Notch2-NC組相比均呈下降趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)意義(均P<0.001，圖5)。

注：A：Notch2 siRNA轉(zhuǎn)染HTR8/SVneo細(xì)胞后Notch2 mRNA表達(dá)水平；與Notch2-NC組相比，*P<0.001； B：Notch2 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)HTR8/SVneo細(xì)胞生存率的影響

注：A：具有代表性的細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)圖像； B：細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中HTR8/SVneo細(xì)胞的個(gè)數(shù)定量后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果； C：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中HTR8/SVneo細(xì)胞的個(gè)數(shù)定量后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。與Notch2-NC組相比，*P<0.001

3 討論

PE是妊娠期特有并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅孕產(chǎn)婦及胎兒的生命安全，已經(jīng)成為孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒疾病率和死亡率升高的主要原因之一，但是其病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。臨床資料顯示，隨著胎盤(pán)的娩出，PE的臨床癥狀可迅速消失，可見(jiàn)胎盤(pán)在PE的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[10-11]。目前研究表明，在妊娠階段，胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞作為一種特殊的細(xì)胞，其侵入母體的子宮蛻膜層和肌層，重塑子宮螺旋動(dòng)脈，是胎盤(pán)形成和發(fā)揮功能的重要結(jié)構(gòu)。胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲遷移能力不足可導(dǎo)致螺旋動(dòng)脈重塑不足和胎盤(pán)植入過(guò)淺，進(jìn)而產(chǎn)生多種妊娠期并發(fā)癥，如PE、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、胎兒宮內(nèi)缺氧等[12-13]，但至今有關(guān)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲遷移功能的調(diào)控機(jī)制尚不清。

Notch信號(hào)通路廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中，在進(jìn)化上高度保守，對(duì)細(xì)胞、組織和器官的分化、發(fā)育及凋亡等生物過(guò)程的調(diào)控至關(guān)重要。哺乳動(dòng)物Notch信號(hào)通路有4個(gè)受體(Notch1-4)和5個(gè)配體(Jag1、2和Dll1、3、4)[14-15]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，Notch信號(hào)通路也廣泛存在于哺乳動(dòng)物胚胎和胎盤(pán)中，可能對(duì)胚胎和胎盤(pán)發(fā)育起著重要的調(diào)控作用。目前對(duì)Notch信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物胚胎和胎盤(pán)中的具體作用研究有限。前期研究提示，Notch2蛋白與小鼠滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移有關(guān)[16]。同時(shí)有研究證據(jù)顯示，Notch2蛋白在人類胎盤(pán)上也有表達(dá)[6,17]，但是對(duì)于人類滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲遷移能力的影響尚不明確。

孕早期絨毛主要由具有侵襲和遷移能力的滋養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)成。本結(jié)果顯示，Notch2蛋白在人類早期絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞上有很高的表達(dá)水平，提示Notch2有可能與孕早期滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲遷移功能有關(guān)。孕晚期胎盤(pán)組織的滋養(yǎng)細(xì)胞也維持著一定水平的侵襲遷移性，我們?cè)谠型砥谡ＬケP(pán)組織上也檢測(cè)到了較高水平的Notch2蛋白表達(dá)，表達(dá)部位主要是滋養(yǎng)細(xì)胞。而在PE患者的胎盤(pán)上，Notch2表達(dá)水平低于正常胎盤(pán)組織。且既往研究也顯示，在PE患者的胎盤(pán)組織中Notch2 mRNA的表達(dá)水平也明顯降低[6,8]，這一結(jié)果提示Notch2表達(dá)降低與PE發(fā)病可能有相關(guān)性。但是在Notch2蛋白對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響上，前期研究結(jié)果不盡相同[7,18-19]。本研究結(jié)果顯示，Notch2表達(dá)下調(diào)后，HTR8/SVneo細(xì)胞的侵襲和遷移功能均明顯下降。趙衛(wèi)秀等[18]研究顯示，Notch2僅對(duì)BeWo細(xì)胞的遷移功能有顯著影響，對(duì)BeWo細(xì)胞的侵襲及JAR細(xì)胞的遷移、侵襲功能均無(wú)影響，這與本研究使用HTR8/SVneo細(xì)胞株得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)論不一致。細(xì)胞株之間基礎(chǔ)Notch蛋白表達(dá)量存在差異、細(xì)胞株之間的侵襲遷移能力存在差異，可能是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致的原因。

本研究也存在一定的局限性，實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞材料為HTR8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞株，而非原代滋養(yǎng)細(xì)胞，其功能變化不能完全代表原代滋養(yǎng)細(xì)胞；再者，沒(méi)有進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論，也未深入探索Notch2對(duì)細(xì)胞株遷移及侵襲影響的分子機(jī)制和信號(hào)通路。

綜上所述，Notch2表達(dá)差異影響滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲功能，其表達(dá)水平下降，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲遷移能力下降，該過(guò)程可能與PE發(fā)病相關(guān)。