miR-138-5p調控SIRT1抑制結腸癌細胞增殖及遷移的研究

羅云春 胡 軍 許 俊

(三峽大學 第一臨床醫(yī)學院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 肛腸科， 湖北 宜昌 443003)

結腸癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其在我國的發(fā)病率和死亡率均較高，且呈逐年上升趨勢[1]。隨著近年來靶向藥物的臨床應用及外科手術的不斷進步，結腸癌的臨床治療效果顯著改善，但患者的5年生存率仍保持在較低水平，其原因在于大部分患者確診時已處于晚期階段或腫瘤發(fā)生了轉移[2]。因此，深入研究結腸癌發(fā)生的分子機制，尋找新的結腸癌診治標志物，對于提高結腸患者的生存周期和生活質量具有重要的臨床意義。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼單鏈RNA分子，長度約為18～25個核苷酸，具有高度保守性[1]。通常情況下，miRNA可與特定基因mRNA的3’UTR區(qū)域進行配對結合，抑制靶mRNA的翻譯過程或直接降解mRNA，從而實現(xiàn)對靶基因表達的調控。此外也有研究報道m(xù)iRNA可與某些mRNA的5’UTR區(qū)域進行結合[2]。研究表明，miRNA參與了多種腫瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲等生物學過程，并與腫瘤的診斷、治療及患者預后密切相關。miR-138-5p是近年來發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中存在差異性表達的一種miRNA，并起到重要調控作用。已有研究證實，miR-138-5p參與肺癌[3]、宮頸癌[4]、乳腺癌[5]及胰腺癌[6]等惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。但在結腸癌中，關于miR-138-5p調控作用及機制的研究少有報道。

本研究檢測了結腸癌組織和細胞系中miR-138-5p的表達水平，并分析miR-138-5p與患者臨床病理特征的相關性，并觀察miR-138-5p對結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，探討其可能的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集我院2018年1月～2019年6月收治的結腸癌患者72例，所有患者均行根治性切除手術，術中獲取新鮮腫瘤組織及癌旁正常組織(>5 cm)，取出后立即放入液氮保存，組織標本均經(jīng)病理確診。納入標準：①患者未接受放化療等其他抗腫瘤治療；②患者均經(jīng)細胞學和病理學確診。排除標準：①患者合并有其他嚴重肝腎部位疾??；②患者臨床分期無法確定；③患者伴隨有其他腫瘤；④患者存在傳染性疾病。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染

人結腸癌細胞株(SW480、SW620、LOVO和HT29)及正常人結腸上皮細胞(FHC細胞)均購自于中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所。所有細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Gibco，美國)的RMPI 1640培養(yǎng)基(含雙抗)(Thermo，美國)中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天更換1次培養(yǎng)基。采用LipofectamineTM 2000轉染試劑盒(Thermo，美國)進行細胞轉染，根據(jù)轉染物質的不同，將結腸癌細胞分為miR-138-5p組、陰性對照組(miR-NC組)及空白對照組(Blank組)，通過RT-PCR檢測轉染效率。

1.3 RT-PCR檢測

Trizol提取組織樣本及細胞中總RNA，采用逆轉錄試劑盒(Takara，日本)進行逆轉錄反應獲得cDNA。以cDNA為模板，后進行RT-PCR反應，反應條件為95℃、5 min；再40個循環(huán)的95℃、30 s，60℃、30 s，72℃、1 min。采用2-ΔΔCt法分析目的基因相對表達量。

miR-138-5p上游：5’-GGAGCTTCGGGAAGTTCA-3’，下游：5’-CAGTGCAGTGGTATTAGT-3’；U6上游：5’-CTCCAGGTAAGTGCACA-3’，下游：5’-AACCACACGTTGCGTGT-3’。SIRT1上游：5’-TAGGTCAAGCCTAGTGGACGGGA-3’，下游：5’-ACATTGCAGGGTACGTTCGTGT-3’；GAPDH上游：5’-ACCGACGTTACCGTCAACAC-3’，下游：5’-TCCAACGTACCGTTGGAGTA-3’。每個樣本設置3個復孔。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力

取生長狀態(tài)良好的細胞，胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，以2×103/孔接種于96孔板，放入CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。待細胞貼壁生長后，于檢測前1 h加入10 μL/孔的CCK-8試劑，酶標儀檢測各組細胞在0 h、24 h、48 h、72 h和96 h時450 nm波長下的OD值，每孔設置6個復孔。

1.5 細胞克隆形成實驗

各組細胞用胰蛋白酶消化并制成單細胞懸液，以1×103/孔接種至6孔板，輕輕搖晃混勻后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約14天后肉眼可見克隆時終止培養(yǎng)，PBS緩沖液清洗，4%多聚甲醛固定10 min，再用1%結晶紫染色10 min，晾干后采集細胞克隆形成情況圖片，每組設置3個復孔。

1.6 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力

細胞遷移實驗：收集各組生長狀態(tài)良好的細胞，用不含血清的RPMI培養(yǎng)液調整細胞濃度為3×105個/mL，取100 μL加入Transwell小室的上室，下室中加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24 h。用棉簽擦拭上室的細胞，PBS緩沖液清洗，再用0.1%的結晶紫進行染色，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照，隨機觀察5個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)，實驗重復3次。

細胞侵襲實驗：將Matrigel膠用無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在冰上按1∶8比例稀釋，取25 μL Matrigel膠均勻鋪設于Transwell上室，37℃無菌過夜晾干，加入100 μL細胞懸液，剩余步驟同細胞遷移實驗。

1.7 雙熒光素酶驗證miR-138-5p與沉默信息調節(jié)因子1的靶向作用關系

構建沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1) 3’UTR野生型(WT)和突變型(MUT)質粒，將細胞懸液密度調整為3×105個/mL，接種于24孔板中，再將SIRT1野生型和突變型質粒與miR-138-5p和miR-NC共轉染，24 h后采用雙熒光素酶活性檢測試劑盒對每組的熒光素酶活性進行檢測，每個樣本設置3個復孔。

1.8 Western blot

采用RIPA細胞裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳將蛋白分離，再經(jīng)轉PVDF膜、封閉后，加入鼠抗人SIRT1單抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，以GAPDH作為內參，再加入辣根過氧化物歧化酶標記的二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，經(jīng)顯色后采用化學發(fā)光儀檢測，Quantity One軟件進行圖像分析。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-138-5p在結腸癌組織和結腸癌細胞株中表達

RT-PCR檢測結果顯示，miR-138-5p在結腸癌組織中的表達水平顯著低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與FHC細胞相比，miR-138-5p在4種結腸癌細胞株中表達均顯著降低(均P<0.05)，其中在SW480細胞的下調程度最大，如圖1所示。

注：A：miR-138-5p在腫瘤組織和癌旁正常組織中表達情況； B：miR-138-5p在結腸癌細胞株中表達情況。與Normal組或FHC組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2 miR-138-5p與結腸癌患者臨床病理參數(shù)相關性分析

根據(jù)miR-138-5p在72例腫瘤組織中相對表達量的平均值，將結腸癌患者分為miR-138-5p高表達組和miR-138-5p低表達組。分析發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p與患者的腫瘤浸潤深度、TNM分期和有無淋巴結轉移具有顯著相關性(均P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分化程度無明顯相關性(均P>0.05)，如表1所示。

表1 miR-138-5p與結腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關性

2.3 miR-138-5p對結腸癌SW480細胞增殖活性的影響

RT-PCR檢測結果顯示，miR-138-5p組miR-138-5p的表達水平顯著高于miR-NC組，而miR-NC組與Blank組的miR-138-5p表達水平無顯著性差異(P>0.05)，表明轉染成功，如圖2A所示。采用CCK-8法檢測各組細胞不同時間點的增殖活力，并根據(jù)檢測結果繪制生長曲線，結果顯示，從48 h開始，miR-138-5p組細胞的增殖活性顯著低于Blank和miR-NC組(均P<0.05)，如圖2B所示。細胞克隆形成實驗結果顯示，過表達miR-138-5p可抑制結腸癌SW480細胞克隆的形成數(shù)量(P<0.05)，如圖2C和2D所示。表明miR-138-5p可抑制結腸癌細胞的增殖能力。

注：A：不同轉染組細胞miR-138-5p的相對表達量，以U6為內參； B：CCK-8檢測各組細胞增殖活性； C、D：各組細胞克隆形成數(shù)量對比。與Blank或miR-NC組相比，*P<0.05

2.4 miR-138-5p對結腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell實驗結果表明，miR-138-5p組發(fā)生遷移和侵襲的細胞數(shù)量顯著低于miR-NC組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，表明miR-138-5p可抑制結腸癌細胞的遷移和侵襲能力，如圖3所示。

注：A上半部分、B：Transwell法檢測SW480細胞的遷移能力； A下半部分、C：Transwell法檢測SW480細胞的侵襲能力。與miR-NC組相比，*P<0.05

2.5 miR-138-5p與SIRT1的靶向作用關系

采用生物信息學網(wǎng)站TargetScan和miRanda預測發(fā)現(xiàn)SIRT1的3’UTR區(qū)與miR-138-5p存在結合位點。雙熒光素酶檢測結果顯示，miR-138-5p可降低共轉染SIRT1野生型的SW480細胞熒光素酶活性(P<0.05)，而對SIRT1突變型細胞的熒光素酶活性無顯著影響(P>0.05)。RT-PCR及Western blot結果顯示，過表達miR-138-5p后，結腸癌細胞中SIRT1 mRNA及蛋白的表達水平均顯著降低(均P<0.05)，表明miR-138-5p可直接作用于SIRT1 mRNA的3’UTR從而抑制SIRT1的表達，如圖4所示。

注：A：miR-138-5p與SIRT1存在直接結合位點； B：雙熒光素酶驗證miR-138-5p對SIRT1的直接靶向作用，WT為SIRT1野生型，Mut為SIRT1突變型； C、D：miR-138-5p對SIRT1 mRNA和蛋白表達的影響。與miR-NC組相比，*P<0.05

2.6 過表達SIRT1可逆轉miR-138-5p的調控作用

為進一步證實miR-138-5p是通過靶向作用SIRT1發(fā)揮其對結腸癌細胞的調控作用，我們對miR-138-5p組細胞共轉染SIRT1過表達質粒。CCK-8及Transwell檢測結果顯示，SW480細胞的增殖、遷移和侵襲能力均得到顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，表明SIRT1可在一定程度上逆轉miR-138-5p對結腸癌細胞的調控作用，如圖5所示。

注：A：CCK-8法檢測各組細胞增殖活性； B～D：Transwell法檢測各組細胞遷移和侵襲能力。與miR-138-5p組相比，*P<0.05

3 討論

結腸癌的發(fā)生是一個涉及多因素、多步驟的復雜過程，常伴隨多種基因的表達失調，深入研究結腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，對于提高結腸癌患者的早期診斷和改善預后具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，大部分miRNAs作用于與腫瘤進展相關的染色體區(qū)域，這些miRNAs可對腫瘤相關基因的轉錄表達發(fā)揮調控作用，進而影響腫瘤細胞的細胞周期、增殖、凋亡及上皮細胞間質轉化(epithelial mesenchymal transition, EMT)等過程[7]。在結腸癌細胞中，存在多種差異性表達的miRNAs，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-143在結腸癌組織中表達水平顯著低于癌旁正常組織，過表達miR-143可抑制細胞的增殖并促進其凋亡[8]。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-185在結腸癌細胞中可通過靶向抑制Wnt1的表達，從而發(fā)揮對結腸癌細胞粘附、侵襲、遷移能力的抑制作用。另有研究報道，miR-139-3p可靶向結合IGF1R，從而抑制結腸癌的浸潤和轉移，并提高結腸癌細胞的化療敏感性[10]。以上研究表明miRNA在結腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要調控作用。

miRNA的表達具有組織特異性、保守性和時序性，這使得miRNA用于臨床結腸癌的診斷、治療評估、預后判斷上具有巨大的潛力。miR-138-5p是miR-138家族成員之一，定位于第16號染色體上[11]，在多種惡性腫瘤中表達下調，發(fā)揮類似抑癌基因的功能。趙軍華等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p可靶向抑制HIF-1α的表達，從而阻滯腎癌細胞周期，抑制腎癌細胞的增殖。原偉偉等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p在胃癌中表達下調，過表達miR-138-5p可通過作用TCF3抑制胃癌細胞的增殖和遷移能力，并促進其凋亡。另有研究報道，miR-138-5p在膀胱癌中可靶向作用于Survivin基因，抑制膀胱癌細胞的EMT過程及侵襲能力[14]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-138-5p在結腸癌組織和結腸癌細胞系中表達均顯著下調，且其表達水平與患者浸潤深度、TNM分期和淋巴結轉移具有顯著相關性，表明miR-138-5p參與了結腸癌的發(fā)生且影響腫瘤進展程度。同時，過表達miR-138-5p后結腸癌細胞SW480的增殖、遷移和侵襲能力均顯著降低，表明miR-138-5p可抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

SIRT1屬于去乙?；附M蛋白家族，其在哺乳動物體內主要定位于細胞核，在早期胚胎組織中含量豐富，是調節(jié)組織發(fā)育、代謝和衰老的重要蛋白[15-16]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可通過去乙?；瘏⑴c多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。多項研究證實，SIRT1可通過抑制p53及某些DNA修復蛋白的表達，促進結腸癌[17]、前列腺癌[18]和乳腺癌[19]等腫瘤的發(fā)生和進展。為明確miR-138-5p在結腸癌中的調控機制，我們首先通過生物信息學預測，發(fā)現(xiàn)SIRT1可能是miR-138-5p的下游靶基因，進而采用雙熒光素酶實驗進行驗證，發(fā)現(xiàn)miR-138-5p可降低共轉染SIRT1野生型SW480細胞的熒光素酶活性，而對SIRT1突變型細胞的熒光素酶活性無顯著影響，表明miR-138-5p對SIRT1具有直接靶向作用。且過表達miR-138-5p可顯著抑制結腸癌細胞中SIRT1 mRNA和蛋白水平，進一步證實了miR-138-5p對SIRT1表達的抑制作用。我們在miR-138-5p組細胞進一步轉染SIRT1過表達質粒后，結腸癌細胞SW480的增殖、遷移和侵襲能力均得到顯著增強，表明過表達SIRT1可在一定程度上逆轉miR-138-5p對結腸癌細胞的調控作用，進一步證實了miR-138-5p是通過靶向作用SIRT1來發(fā)揮其對結腸癌細胞的調控作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)miR-138-5p在結腸癌中低表達，且其表達水平與腫瘤進展程度密切相關。miR-138-5p可通過靶向作用SIRT1發(fā)揮對結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。