氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法研究枇杷蜂蜜成熟過程中低聚糖含量變化規(guī)律

王玉涵，王欣然，吉挺，陸超麗，吳殿軍，師豐豐，周金慧,4,5*

1(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京，100093)2(揚(yáng)州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州，225000)3(昭平縣農(nóng)村社會事業(yè)促進(jìn)站，廣西 賀州，546800)4(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實驗室，北京，100093)5(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，北京，100093)

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，在巢脾內(nèi)轉(zhuǎn)化、脫水、貯存至成熟的天然甜物質(zhì)[1]。枇杷蜂蜜是蜜蜂采集枇杷花蜜釀造而成的。枇杷蜜粉充足且花期長，是重要的冬季蜜源。枇杷果實味甜、營養(yǎng)豐富，枇杷蜂蜜中營養(yǎng)成分和獨(dú)特風(fēng)味來源于枇杷蜜源。枇杷蜂蜜色白濃稠，具有獨(dú)特的杏仁香味，有潤肺止咳、調(diào)節(jié)胃腸道功能和增強(qiáng)免疫力等功效，是蜜中佳品[2]。

蜂蜜中主要成分是糖類物質(zhì)，低聚糖是蜂蜜中重要的營養(yǎng)功效成分，其中低聚異麥芽糖(異麥芽糖、黑曲霉二糖等)、低聚果糖(蔗果三糖等)、大豆低聚糖(蜜三糖等)以及龍膽低聚糖(龍膽二糖等)[3]，功能性低聚糖能促進(jìn)腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌的生長[4]，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力[5]，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、降低膽固醇和調(diào)節(jié)腸道滲透壓等功效[3]。蜂蜜的釀造過程是復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化過程，目前已有對蜂蜜成熟過程中水分、單糖、蔗糖及酶值等物質(zhì)變化規(guī)律的研究[6-7]，但尚未見對成熟過程中低聚糖變化的相關(guān)研究，因此開展枇杷蜂蜜成熟過程中低聚糖變化規(guī)律研究，可為枇杷蜂蜜成熟過程中成分和生物活性變化研究提供依據(jù)。

目前對糖類物質(zhì)的檢測方法主要包括GC[8]、GC-MS[9]、HPLC[10]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)[11]、高效陰離子交換色譜法(high performance anion exchange chromatography，HPAEC)[12]，其中GC-MS因其靈敏度高、分離能力強(qiáng)，能準(zhǔn)確定性識別等優(yōu)勢，已被廣泛用于蜂產(chǎn)品中糖類物質(zhì)分析[9,13]。本研究建立了枇杷蜂蜜中低聚糖GC-MS檢測方法，分析枇杷蜂蜜成熟過程中低聚糖變化規(guī)律，為枇杷蜂蜜品質(zhì)評價提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷蜂蜜樣品：采集于江蘇省蘇州市吳中區(qū)東山鎮(zhèn)，采集蜂種為中華蜜蜂(華中型)。在枇杷盛花期隨機(jī)選擇枇杷園內(nèi)的蜂場作為采樣點(diǎn)，樣品采集前清空巢脾，每日清晨進(jìn)行樣品采集，每日采集3個蜂箱的蜂蜜作為平行樣品，共計45個枇杷蜂蜜樣品。

枇杷花蜜樣品：直接吸取于處于盛花期的枇杷花上。枇杷蜂蜜和花蜜樣品于-20 ℃貯存直至分析。

依據(jù)SN/T 0852—2012《進(jìn)出口蜂蜜檢驗規(guī)程》中規(guī)定的水分測定方法測定枇杷花蜜和蜂蜜中的水分含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，每個樣品平行測定3次。樣品采集信息及水分含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))見表1。

表1 枇杷花蜜和成熟過程中蜂蜜樣品信息表

試劑：吡啶、六甲基二硅胺烷、三氟乙酸酐(均為分析純)、松二糖(CAS：547-25-1，純度為98%)，上海阿拉丁試劑有限公司；鹽酸羥胺(分析純)，北京酷來搏科技有限公司；無水乙醇(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；苯基-β-D-葡萄糖苷(CAS：1464-44-4，純度為98%)、黑曲霉二糖(CAS：497-48-3，純度為93%)北京百靈威科技有限公司；蔗糖(CAS：57-50-1，純度≥98%)、棉子糖(CAS：512-66-3，純度≥98%)、α，α-海藻糖(CAS：99-20-7，純度≥98%)、α，β-海藻糖(CAS：585-91-1，純度為98%)、β，β-海藻糖(CAS：499-23-0，純度為98%)、昆布二糖(CAS：34980-39-7，純度≥95%)、麥芽糖(CAS：69-79-4，純度≥98%)、異麥芽酮糖(CAS：13718-94-0，純度≥98%)、龍膽二糖(CAS：554-91-6，純度≥98%)、蜜二糖(CAS：585-99-9，純度為98%)、異麥芽糖(CAS：499-40-1，純度≥97%)、蜜三糖(CAS：512-69-6，純度≥98%)、蔗果三糖(CAS：470-69-9，純度≥98%)、吡喃葡糖基蔗糖(CAS：13101-54-7，純度≥97%)、松三糖(CAS：597-12-6，純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；QL-866旋渦混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；1-15PK離心機(jī)，Sigma有限公司；TUS-200P振蕩型恒溫金屬浴，上海一恒科技有限公司；Auto Vap S60樣品全自動氮吹儀，美國ATR公司；BSA124S分析天平(感量0.000 1 g)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.3 溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量苯基-β-D-葡萄糖苷，用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇水配制成0.025 mg/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液。準(zhǔn)確稱取棉子糖、α，α-海藻糖、α，β-海藻糖、β，β-海藻糖、蔗糖、昆布二糖、黑曲霉二糖、松二糖、麥芽糖、異麥芽酮糖、龍膽二糖、蜜二糖、異麥芽糖、蜜三糖、蔗果三糖、吡喃葡糖基蔗糖和松三糖標(biāo)準(zhǔn)品適量，用超純水配制成5～200 mg/mL的儲備液，于4 ℃下避光儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品提取與衍生化處理

稱取0.25 g蜂蜜樣品溶解于25 mL 80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液中，渦旋混勻，于8 000 r/min，4 ℃離心10 min，吸取上清液1 mL，用80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇水稀釋10倍(測定蔗糖含量時需稀釋50倍)，吸取稀釋液100 μL于1.5 mL離心管，于40 ℃氮吹至干，待衍生。參照RUIZ-MATUTE等[9]的方法，上述1.5 mL離心管中加入20 μL苯基-β-D-葡萄糖苷溶液(0.025 mg/mL)，渦旋混勻，加入350 μL鹽酸羥胺吡啶溶液(25 mg/mL)，渦旋混勻，75 ℃反應(yīng)30 min，隨后加入350 μL六甲基二硅胺烷和35 μL三氟乙酸酐，渦旋混勻，45 ℃反應(yīng)30 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液至進(jìn)樣瓶內(nèi)，用于GC-MS分析。

1.5 分析條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：DB-5(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣為氦氣，流量0.99 mL/min；進(jìn)樣口溫度300 ℃，不分流進(jìn)樣；升溫程序：初始溫度180 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升溫至255 ℃，保持1 min，然后以15 ℃/min 升溫至265 ℃，保持1 min，然后以1 ℃/min升溫至270 ℃，然后以10 ℃/min升溫至300 ℃，然后以20 ℃/min升溫至320 ℃，保持10 min，進(jìn)樣量1 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件

電子電離源；離子源溫度230 ℃；電離能量70 eV；溶劑延遲10 min；掃描類型：選擇離子監(jiān)測模式(selected ion monitoring，SIM)。低聚糖衍生物對應(yīng)的保留時間、監(jiān)測特征離子參數(shù)見表2。

表2 低聚糖的保留時間、監(jiān)測離子

1.6 數(shù)據(jù)處理

枇杷蜂蜜和花蜜樣品中低聚糖含量均平行測定3次，數(shù)據(jù)結(jié)果均以“平均含量±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。采用IBM SPSS Statistics 23數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS儀器條件優(yōu)化

優(yōu)化升溫程序可實現(xiàn)多種低聚糖的色譜分離，17種低聚糖的衍生物總離子流色譜圖見圖1-a。但由于糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)類似，僅依靠色譜分離難以實現(xiàn)完全區(qū)分，因此需對質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以實現(xiàn)同時對蜂蜜中多種低聚糖的準(zhǔn)確定性、定量分析。SIM模式下所獲目標(biāo)物色譜峰噪聲干擾小，響應(yīng)值高，目標(biāo)物檢測靈敏度高，因此采用SIM模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。糖類物質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜分析后獲得的離子碎片相近，選擇單一離子難以對低聚糖進(jìn)行有效區(qū)分，因此選擇響應(yīng)值高且可以與其他物質(zhì)有效區(qū)分的離子作為特征定量離子，另選擇響應(yīng)值較高的其他碎片離子作為特征定性離子，3種特征定量離子提取色譜圖見圖1-b～圖1-d。

1-苯基-β-D-葡萄糖苷；2-棉子糖；3-蔗糖；4-α，α-海藻糖；5- α，β-海藻糖；6-β，β-海藻糖；7-昆布二糖；8- 黑曲霉二糖(特征色譜峰1)；9- 松二糖(特征色譜峰1)；10- 麥芽糖(特征色譜峰1)；11- 松二糖(特征色譜峰2)；12- 麥芽糖(特征色譜峰2)；13- 黑曲霉二糖(特征色譜峰2)；14- 異麥芽酮糖(特征色譜峰1)；15- 龍膽二糖(特征色譜峰1)；16- 異麥芽酮糖(特征色譜峰2)；17- 龍膽二糖(特征色譜峰2)；18- 蜜二糖(特征色譜峰1)；19- 異麥芽糖(特征色譜峰1)；20- 蜜二糖(特征色譜峰2)；21- 異麥芽糖(特征色譜峰2)；22-蜜三糖；23-蔗果三糖；24-吡喃葡糖基蔗糖；25-松三糖

2.2 衍生化方法選擇

低聚糖不易揮發(fā)，通常先將其轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)的低聚糖衍生物后，再進(jìn)行GC-MS分析。常見的衍生化方法主要為硅烷化、?；屯榛苌?，其中硅烷化衍生適用于含活性氫官能團(tuán)物質(zhì)的衍生化反應(yīng)，其衍生產(chǎn)物易揮發(fā)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易降解，可直接進(jìn)行色譜分析，因此在本研究中被應(yīng)用于蜂蜜中低聚糖的衍生化處理。但還原性低聚糖由于存在環(huán)化和開環(huán)轉(zhuǎn)化等反應(yīng)，直接進(jìn)行硅烷化衍生時會產(chǎn)生多種異構(gòu)體，難以準(zhǔn)確定量。在硅烷化衍生前對低聚糖進(jìn)行肟化反應(yīng)，可使其環(huán)化反應(yīng)受限，有效減少還原性低聚糖多種衍生產(chǎn)物的形成[14]。最終，經(jīng)肟化-硅烷化衍生后，還原性低聚糖(黑曲霉二糖、麥芽糖、松二糖、異麥芽酮糖、龍膽二糖、蜜二糖和異麥芽糖)僅形成順式和反式2種衍生產(chǎn)物；非還原性低聚糖(蔗糖、海藻糖，昆布二糖、棉子糖、松三糖、蜜三糖、蔗果三糖和吡喃葡糖基蔗糖)形成單一衍生產(chǎn)物[15]，利于準(zhǔn)確定量分析。

2.3 方法學(xué)評價

建立食品中內(nèi)源性物質(zhì)檢測分析方法，需對其進(jìn)行方法學(xué)評價，以確保檢測方法的可靠性和有效性。目前，針對內(nèi)源性物質(zhì)的方法學(xué)評價主要有標(biāo)準(zhǔn)加入法、替代基質(zhì)法和替代分析物法3種方式[16]，由于枇杷蜂蜜樣品中低聚糖響應(yīng)較高，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法添加同濃度目標(biāo)分析物后，會出現(xiàn)峰值過飽和的現(xiàn)象，損傷儀器，同時不能實現(xiàn)對目標(biāo)物的準(zhǔn)確定量。此外，難以獲得不含目標(biāo)分析物的替代基質(zhì)，使得替代基質(zhì)法同樣不適用于枇杷蜂蜜中低聚糖分析的方法學(xué)評價。最終采用替代分析物法進(jìn)行方法學(xué)評價，選用與待測低聚糖結(jié)構(gòu)類似且枇杷蜂蜜和花蜜中均不含有的苯基-β-D-葡萄糖苷作為替代物。為進(jìn)一步驗證其作為替代物的可行性，采用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇水配制17種低聚糖與苯基-β-D-葡萄糖苷的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)1.4節(jié)所述方法提取、衍生并上機(jī)測定。結(jié)果顯示待測低聚糖回收率為81.72%～118.99%，苯基-β-D-葡萄糖苷回收率為118.83%，說明苯基-β-D-葡萄糖苷與待測低聚糖在提取以及衍生化過程中化學(xué)行為相近，同時，經(jīng)色譜分離可實現(xiàn)良好區(qū)分，因此苯基-β-D-葡萄糖苷可作為待測低聚糖的替代物用于方法學(xué)評價。

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)評價

采用替代物評估枇杷蜂蜜中低聚糖含量分析方法的基質(zhì)效應(yīng)。枇杷蜂蜜樣品經(jīng)上述1.4節(jié)制備苯基-β-D-葡萄糖苷空白基質(zhì)液。分別配制質(zhì)量濃度為0.13～13.24 μg/mL的苯基-β-D-葡萄糖苷系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液并進(jìn)行測定。基質(zhì)效應(yīng)通過替代物的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比進(jìn)行評估，結(jié)果表明，替代物在枇杷蜂蜜中的基質(zhì)效應(yīng)為103.25%，符合歐盟對方法學(xué)評價中基質(zhì)效應(yīng)的相關(guān)要求[17]，因此可采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行枇杷蜂蜜和花蜜中低聚糖的定量分析。

2.3.2 線性范圍、檢出限及定量限

內(nèi)標(biāo)法定量可減少前處理及儀器測定過程中的誤差，降低基質(zhì)干擾，實現(xiàn)對待測物的準(zhǔn)確定量。因此本研究中選擇苯基-β-D-葡萄糖苷為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法對待測低聚糖進(jìn)行定量分析。

吸取適量各低聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制不同濃度低聚糖系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(表3)，按1.4節(jié)方法在衍生化前加入20 μL內(nèi)標(biāo)物苯基-β-D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.025 mg/mL),經(jīng)衍生化處理后上機(jī)測定。以低聚糖與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)，以低聚糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。17種低聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、回歸系數(shù)及線性范圍見表3。17種低聚糖在其相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

表3 十七種低聚糖的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.3.3 回收率和精密度

通過添加替代分析物開展方法的回收率和精密度評價[18]，選擇與目標(biāo)物線性濃度范圍內(nèi)響應(yīng)相近的替代物添加濃度進(jìn)行添加回收實驗。本方法中枇杷蜂蜜樣品中分別按照0.01、0.10、1.00 g/100g添加苯基-β-D-葡萄糖苷，按照1.4節(jié)進(jìn)行樣品提取與衍生化處理，GC-MS測定，計算方法回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，蜂蜜樣品中苯基-β-D-葡萄糖苷在3個添加濃度的回收率在87.43%～117.17%。日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.97%～11.94%；日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.25%～14.13%，說明方法準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性良好，可滿足檢測的要求，因此本方法適用于枇杷蜂蜜和花蜜中低聚糖的定量分析。

2.4 枇杷蜂蜜和枇杷花蜜中低聚糖組成差異

枇杷蜂蜜和花蜜樣品按1.4節(jié)方法進(jìn)行提取和衍生化處理，采用1.5節(jié)GC-MS方法進(jìn)行測定，結(jié)果表明，枇杷蜂蜜中共有效檢出11種低聚糖，分別為蔗糖、α，β-海藻糖、黑曲霉二糖、松二糖、麥芽糖、異麥芽酮糖、異麥芽糖、蜜三糖、蔗果三糖、吡喃葡糖基蔗糖和松三糖。枇杷花蜜中共檢出6種低聚糖，分別為蔗糖、β，β-海藻糖、昆布二糖、黑曲霉二糖、蔗果三糖和吡喃葡糖基蔗糖。枇杷蜂蜜低聚糖組成較花蜜更為豐富，枇杷花蜜和蜂蜜中低聚糖種類組成差異如圖2所示，枇杷蜂蜜和花蜜中均含有蔗糖、黑曲霉二糖、蔗果三糖和吡喃葡糖基蔗糖。β，β-海藻糖、昆布二糖僅存在于花蜜中，并未在蜂蜜中發(fā)現(xiàn)，其原因是經(jīng)蜂蜜釀造后，花蜜中昆布二糖和β，β-海藻糖可被β-葡萄糖苷酶和海藻糖酶分解為葡萄糖[19-20]。α，β-海藻糖、松二糖、麥芽糖、異麥芽酮糖、異麥芽糖、蜜三糖和松三糖7種低聚糖僅存在于枇杷蜂蜜中，其原因是在蜂蜜釀造過程中，在蜜蜂的分泌物和花蜜中酸類物質(zhì)等作用下解離出花蜜中鍵合的低聚糖[6]，同時存在酶解[7]和轉(zhuǎn)糖基化[21]等作用使蜂蜜中的糖類物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，進(jìn)而產(chǎn)生了更多種類的低聚糖。

圖2 枇杷花蜜和枇杷蜂蜜中低聚糖比較的韋恩圖

2.5 枇杷蜂蜜中低聚糖含量特征分析

我國枇杷蜂蜜中低聚糖種類豐富，枇杷蜂蜜中各低聚糖的占比不同。釀造15 d的蜂蜜中，蔗糖含量占檢出低聚糖總含量的52.10%；吡喃葡糖基蔗糖占30.10%；麥芽糖占10.96%；松二糖占1.51%；黑曲霉二糖占1.08%；異麥芽糖占0.95%；蔗果三糖占0.64%；異麥芽酮糖占0.55%；蜜三糖、α，β-海藻糖和松三糖含量偏低，占比均<0.50%。我國枇杷蜂蜜中低聚糖總含量豐富，11種低聚糖的總含量為15.77～20.97 g/100g，高于西班牙北部伊比利亞高原的薰衣草蜜、百花蜜、甘露蜜等蜂蜜(5.63～8.52 g/100g)[22]。

三糖中吡喃葡糖基蔗糖含量最高，含量范圍為2.91～5.51 g/100g，高于西班牙枇杷蜂蜜、牛油果蜂蜜、樹莓蜂蜜以及加拿大苜蓿蜂蜜、油菜蜜、三葉草蜜(0.07～3.43 g/100g)等蜂蜜[10,23]。蔗果三糖含量(0.07～0.12 g/100g)相對高于西班牙枇杷蜂蜜(0～0.09 g/100g)[23]。蜜三糖含量(0.05～0.14 g/100g)相對高于西班牙牛油果蜜、樹莓蜜以及冬香薄荷蜜(0.00～0.05 g/100g)[23]。松三糖含量范圍為0.03～0.05 g/100g，與報道的西班牙枇杷蜂蜜中松三糖含量范圍(0.00～0.09 g/100g)接近[23]。本研究中枇杷蜂蜜中三糖含量(除松三糖外)較上述已報道的西班牙和加拿大蜂蜜高，其中吡喃葡糖基蔗糖含量最高，是我國枇杷蜂蜜中特征性三糖。

本研究中江蘇東山白玉枇杷花蜜中蔗糖含量高達(dá)21.70 g/100g，高于報道的福建莆田枇杷花蜜中蔗糖含量(3.35 g/100g)[24]。不同品種枇杷中的糖類組差異[25]可能是不同品種枇杷花蜜中蔗糖含量差異的原因之一。由于枇杷蜜源中的蔗糖含量較高，導(dǎo)致枇杷蜂蜜中含有較高含量的蔗糖。經(jīng)蜜蜂長時間釀造轉(zhuǎn)化后，蔗糖含量在釀造15 d的蜂蜜中可降至9.24 g/100g，但高于GH/T 18796—2012《蜂蜜》所規(guī)定蜂蜜中蔗糖含量(≤5 g/100g)以及西班牙枇杷蜂蜜中蔗糖含量(0～0.1 g/100g)[23]。枇杷蜂蜜中，除蔗糖外，麥芽糖含量最高，含量為0.92～2.08 g/100g，高于西班牙枇杷蜂蜜(0.97～1.49 g/100g)[23]以及加拿大油菜蜜(0.76 g/100g)[10]，但低于西班牙龍舌蘭蜂蜜(2.71 g/100g)[23]。黑曲霉二糖在枇杷蜂蜜中含量為0.09～0.20 g/100g，與報道的加拿大油菜蜜中黑曲霉二糖含量(0.23 g/100g)接近[10]，但低于西班牙枇杷蜂蜜(1.08～1.63 g/100g)[23]。松二糖在枇杷蜂蜜中含量為0.17～0.32 g/100g，低于西班牙枇杷蜂蜜(1.64～2.71 g/100g)[23]及西班牙其他10種蜂蜜(0.72～2.87 g/100g)[13]；枇杷蜂蜜中海藻糖和異麥芽酮糖含量偏低，其中α，β-海藻糖含量(0.04～0.07 g/100g)低于西班牙牛油果蜜、百花蜜、枇杷蜜等蜂蜜(0.35～0.76 g/100g)[23]；異麥芽酮糖含量(0.06～0.11 g/100g)接近報道的加拿大苜蓿蜂蜜中異麥芽酮糖含量(0.067 g/100g)[10]，但低于西班牙枇杷蜂蜜(0.28～0.56 g/100g)[23]。本研究中枇杷蜂蜜中蔗糖、麥芽糖含量相對高于西班牙枇杷蜂蜜，其他二糖含量相對低于西班牙枇杷蜂蜜。

2.6 蜂蜜干重中低聚糖含量隨釀造天數(shù)變化分析

蜂蜜釀造過程是脫除水分、富集與轉(zhuǎn)化營養(yǎng)物質(zhì)的復(fù)雜生物過程。隨釀造時間延長，蜂蜜水分含量逐漸降低，如表1水分含量測定結(jié)果所示，花蜜中水分含量受環(huán)境影響較大，環(huán)境濕度高時采集的花蜜中水分含量高，可達(dá)53.66%質(zhì)量分?jǐn)?shù)。花蜜經(jīng)蜜蜂采集釀造后，釀造1 d蜂蜜中水分含量降至25.34%，在釀造1～8 d的枇杷蜂蜜中水分含量在21.76%～25.34%波動變化，釀造9 d時水分含量下降，在釀造9～15 d枇杷蜂蜜中水分含量在18.89%～20.52%且含量無顯著性差異。由水分變化規(guī)律可知，在釀造2 d后枇杷蜂蜜中水分含量低于24%，符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GH/T 18796—2012《蜂蜜》所規(guī)定的二等品水分含量要求；釀造13 d后枇杷蜂蜜水分含量低于20%，符合GH/T 18796—2012《蜂蜜》所規(guī)定的一等品水分含量要求。水分含量的減少對蜂蜜中物質(zhì)具有一定的濃縮效應(yīng)。本研究通過對樣品干重中低聚糖含量[樣品干重中低聚糖含量=樣品濕重中低聚糖含量測定值/(100%-樣品水分含量)]變化進(jìn)行分析，以排除因濃縮效應(yīng)造成的低聚糖含量上升。各低聚糖在枇杷花蜜和蜂蜜樣品干重中的含量及單因素方差分析結(jié)果如表4所示。

表4 枇杷花蜜和蜂蜜中低聚糖含量(均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3) 單位：g/100g干重

2.6.1 枇杷蜂蜜釀造過程中二糖變化規(guī)律

在蜂蜜釀造過程中，蔗糖可被酶解為單糖[7]，同時也可在酶的轉(zhuǎn)化作用下轉(zhuǎn)化為其他糖類物質(zhì)[26]，因此蔗糖含量隨釀造時間延長呈下降趨勢。蔗糖在花蜜干重中含量為43.35 g/100g，經(jīng)蜂蜜釀造后，蔗糖含量下降，在釀造1～11 d蜂蜜干重中含量在13.17～18.30 g/100g范圍內(nèi)波動，釀造12 d后蔗糖含量顯著降低并在14 d時降至最低含量(11.41 g/100g)，之后含量無顯著性差異。

除蔗糖外，枇杷蜂蜜中其他二糖在釀造過程中含量均呈上升趨勢。麥芽糖是枇杷蜂蜜中含量較高的二糖，但未在枇杷花蜜中檢出。已有報道顯示，枇杷花蜜中存在麥芽四糖和麥芽五糖[22]，枇杷蜂蜜的麥芽糖可來源于花蜜中麥芽多糖的分解[27]。麥芽糖在蜂蜜干重的含量在1～6 d內(nèi)含量無顯著性差異，含量為1.54～1.72 g/100g；7 d時含量上升至2.27 g/100g；在8～11 d內(nèi)含量無顯著性差異，含量為1.89～2.06 g/100g；12 d時含量開始持續(xù)上升并在15 d時達(dá)到最高含量(2.41 g/100g)。

松二糖、黑曲霉二糖、異麥芽糖、異麥芽酮糖和α，β-海藻糖在蜂蜜釀造過程中含量表現(xiàn)出相似的上升規(guī)律。松二糖、異麥芽糖、異麥芽酮糖和α，β-海藻糖均未在花蜜中檢出，其在蜂蜜釀造過程中含量的增加可能源于糖類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化作用。由于糖苷酶在分解糖類物質(zhì)的同時伴隨著轉(zhuǎn)糖基化作用而產(chǎn)生新的低聚糖，如麥芽糖經(jīng)轉(zhuǎn)糖基化生成異麥芽糖[28]。黑曲霉二糖在花蜜干重中含量為0.01 g/100g，經(jīng)蜜蜂釀造后，黑曲霉含量增加，除花蜜中黑曲霉二糖的富集外，也可能存在糖類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化生成黑曲霉二糖。枇杷蜂蜜中松二糖、黑曲霉二糖、異麥芽糖、異麥芽酮糖和α，β-海藻糖在1～13 d內(nèi)含量保持波動上升，在松二糖、黑異麥芽糖、異麥芽酮糖和α，β-海藻糖第14天含量達(dá)到最高水平，分別為0.36、0.21、0.13、0.09 g/100g，之后含量均無顯著性差異；黑曲霉二糖在15 d時含量達(dá)最高(0.24 g/100g)。

由以上分析結(jié)果可知，枇杷蜂蜜中除蔗糖外，其他二糖含量均隨釀造時間延長呈增加趨勢，在釀造前期含量波動上升，其中麥芽糖和黑曲霉二糖在15 d時含量達(dá)最高；松二糖、異麥芽糖、異麥芽酮糖和α，β-海藻糖含量在14 d時達(dá)到最高，之后含量無顯著性差異。

2.6.2 枇杷蜂蜜釀造過程中三糖變化規(guī)律

本研究中三糖在枇杷蜂蜜釀造過程中呈無規(guī)律波動性變化。枇杷蜂蜜中，除吡喃葡糖基蔗糖外，其他三糖經(jīng)蜂蜜釀造后含量未表現(xiàn)出明顯增加。吡喃葡糖基蔗糖在枇杷蜂蜜干重中含量顯著高于花蜜，在釀造1～15 d中吡喃葡糖基蔗糖含量呈波動性變化，含量為3.80～6.84 g/100g，其在釀造15 d時含量上升至最高水平(6.84 g/100g)。釀造過程中蔗糖可經(jīng)轉(zhuǎn)糖基化作用生成吡喃葡糖基蔗糖[26]，同時吡喃葡糖基蔗糖也可被酶解[29]，在這兩種轉(zhuǎn)化作用的共同作用下可造成吡喃葡糖基蔗糖含量的波動性變化。

隨釀造時間延長，蔗果三糖、蜜三糖和松三糖含量分別為0.09～0.16、0.07～0.14、0.03～0.06 g/100g。同時，蔗果三糖、蜜三糖和松三糖含量分別在釀造1 d與釀造15 d的枇杷蜂蜜干重中無顯著性差異。值得注意的是，蔗果三糖在枇杷花蜜中干重含量達(dá)0.80 g/100g，顯著高于枇杷蜂蜜干重中蔗果三糖含量。經(jīng)蜜蜂釀造，花蜜中蔗果三糖被轉(zhuǎn)化酶分解[30]，可造成枇杷蜂蜜中蔗果三糖含量低于枇杷花蜜。蜂蜜釀造過程中物質(zhì)分解和轉(zhuǎn)化作用是導(dǎo)致三糖含量呈波動性變化的原因之一。

2.6.3 枇杷蜂蜜釀造過程中檢出低聚糖總含量變化規(guī)律

隨釀造時間的延長，蜜蜂將采集的花蜜不斷添加到巢脾中，巢脾內(nèi)蜜量增多，同時經(jīng)蜜蜂振翅扇風(fēng)和吞吐釀造，蜂蜜中水分被脫除，巢脾逐漸封蓋。在釀造過程中營養(yǎng)物質(zhì)被富集，同時也發(fā)生著物質(zhì)轉(zhuǎn)化。隨釀造時間延長，枇杷蜂蜜中糖類物質(zhì)經(jīng)過蜜蜂充分釀造轉(zhuǎn)化，在釀造后期各物質(zhì)含量趨于穩(wěn)定。蔗糖在枇杷蜂蜜11種低聚糖總含量中占比最高，隨釀造時間延長蔗糖含量降低，也導(dǎo)致低聚糖總含量在蜂蜜干重中隨釀造時間延長而降低，釀造14 d時低聚糖總含量達(dá)到最低(19.91 g/100g)，之后含量無顯著性差異。

3 結(jié)果與討論

本研究建立了基于兩步法衍生化的GC-MS法測定枇杷花蜜和不同釀造天數(shù)枇杷蜂蜜中低聚糖含量，該技術(shù)準(zhǔn)確度高、精密度好，可為枇杷蜂蜜品質(zhì)評價提供技術(shù)支持。通過測定枇杷花蜜和蜂蜜中低聚糖含量，發(fā)現(xiàn)花蜜經(jīng)蜜蜂的釀造轉(zhuǎn)化后，在蜂蜜中產(chǎn)生了種類更為豐富的低聚糖，且以吡喃葡糖基蔗糖為枇杷蜂蜜中特征性三糖。通過分析不同釀造天數(shù)枇杷蜂蜜中低聚糖含量變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在蜂蜜釀造過程中，低聚糖含量處于動態(tài)變化中，隨釀造天數(shù)延長低聚糖含量變化規(guī)律不同。二糖中，蔗糖含量下降，在釀造14 d時蔗糖含量降低至最低含量水平之后含量無顯著性差異；其他二糖含量均呈上升趨勢，松二糖等4種二糖含量在釀造14 d時達(dá)到最高，之后無顯著性差異；麥芽糖和黑曲霉二糖含量在釀造15 d時達(dá)到最高。三糖含量在釀造過程中呈無規(guī)律波動變化，其中吡喃葡糖基蔗糖含量在蜂蜜釀造15 d時達(dá)到最高。本研究為制定枇杷蜂蜜的合理采收時間和鑒別其是否釀制完全提供數(shù)據(jù)支撐。