三種甘草種子蛋白的提取方法、結(jié)構(gòu)及抗氧化活性比較研究

則拉萊·司瑪依，帕爾哈提·柔孜，吾哈麗妮薩·麥麥提托合提，古麗米熱·阿巴拜克日，鄧杰，楊曉君

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052)

甘草(Glycyrrhiza)屬豆科，多年生草本植物，是一種傳統(tǒng)的補(bǔ)益中草藥，應(yīng)用較廣泛，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛及調(diào)和諸藥等多種功效[1]。烏拉爾甘草、脹果甘草和光果甘草作為藥用甘草植物收載于《中國(guó)藥典》?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明甘草提取物的抗菌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等藥理活性對(duì)傳染病防治方面具有較好的效果[2]。

2019年12月以來(lái)，開(kāi)始滋蔓各地的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)因其導(dǎo)致的嚴(yán)重疾病和死亡引起了全人類(lèi)的恐慌。通過(guò)我國(guó)研究發(fā)現(xiàn)中藥中針對(duì)治療COVID-19的9種中藥組方中均含有甘草成分[3]。研究表明，甘草所含的甘草酸二胺能夠較好地抑制機(jī)體的炎性反應(yīng)，提高免疫功能，對(duì)輕度患者具有顯著療效，安全性高，并且能對(duì)抗抗病毒西藥導(dǎo)致的肝損傷的不良反應(yīng)[4]。甘草對(duì)艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)和重癥急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)等傳染性重大疾病也有較好的治療效果[5-6]；通過(guò)大量的臨床試驗(yàn)對(duì)防治艾滋病的27種單味中藥進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，甘草是使用頻率最高的抗病毒中藥制劑，并且具有很強(qiáng)的抑制HIV活性的作用[5]。蒲潔瑩等[6]報(bào)道甘草酸能防止SARS冠狀病毒的繁殖，也能阻止其對(duì)細(xì)胞的侵入。綜上所述，甘草具有多種藥效，并且不斷在被挖掘，因此，以研究尚未深入的甘草種子為對(duì)象，展開(kāi)一系列探究可為明確其功能成分活性并開(kāi)發(fā)相關(guān)抗氧化功能性食品提供參考。

甘草的前期研究大多以根及根莖部位中的甘草酸、黃酮及多糖等成分及其生物活性為主[7]，但有關(guān)甘草種子化學(xué)成分的研究尚未深入開(kāi)展，這不僅導(dǎo)致了甘草資源的浪費(fèi)，而且使有關(guān)甘草不同部位活性成分的研究未能更全面。甘草種子含有蛋白、多糖、油脂及其他重要的化學(xué)成分，蛋白作為種子類(lèi)植物富含的成分之一，具有較高的研究?jī)r(jià)值。目前關(guān)于種子蛋白類(lèi)化合物的提取方法包含了水、乙醇、緩沖液、堿、鹽、酸、酶法提取和堿溶酸沉及超聲波輔助提取等方法[8]，由于不同的提取方法對(duì)于不同的樣品發(fā)揮的作用并不一致，而選擇最佳提取方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要，因此，需要進(jìn)行對(duì)比篩選。呂凱波等[9]通過(guò)超聲波輔助堿溶酸沉法得到的紅花籽粕蛋白提取率和含量最高，分別為26.53% 和51.49 mg/mL，蛋白質(zhì)中多肽含量也最高，達(dá)到6.56 mg/mL，而堿法中得到的游離氨基酸含量較多，為2.14 mg/mL；說(shuō)明不同的提取方法不僅會(huì)影響蛋白提取率及含量，還可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)分子內(nèi)在結(jié)構(gòu)、分子片段大小及組成造成一定影響。因此，篩選甘草種子蛋白的最佳提取方法，對(duì)其擁有更高的開(kāi)發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景有著十分重要的意義。

植物蛋白是一種天然的抗氧化物質(zhì)，具有抗氧化，抗過(guò)敏、抗糖尿病、抗癌癥等多種生理功能[10]。目前，有關(guān)甘草種子蛋白的研究鮮有報(bào)道。從甘草種子中提取蛋白，不僅能提高甘草的附加值，而且可以解決甘草資源浪費(fèi)的問(wèn)題，對(duì)甘草種子的開(kāi)發(fā)和利用意義重大。本文以3種藥用甘草種子為原料，通過(guò)研究水、乙醇、醋酸提取法和堿溶酸沉法及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)提取法等5種方法，以甘草種子蛋白提取率與含量為指標(biāo)選出最佳提取方法，通過(guò)傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)和掃描電鏡圖像(scanning electron microscopy, SEM)分析甘草種子蛋白的結(jié)構(gòu)特征，并通過(guò)研究對(duì)不同自由基的清除率測(cè)定其抗氧化活性，以期望能夠?yàn)楦什莘N子蛋白的深入研究和開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用的3種甘草種子均購(gòu)于新疆庫(kù)爾勒。石油醚、醋酸、氫氧化鈉、鐵氰化鉀，天津市鑫鉑特化工有限公司；無(wú)水乙醇、濃硫酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)制劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250，上海藍(lán)季生物有限公司；磷酸、三氯乙酸、硫酸亞鐵，天津永晟精細(xì)化工有限公司；97%牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)，北京索萊寶科技有限公司；DPPH試劑，上海麥克林生物公司；三氯化鐵，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；水楊酸，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司；過(guò)氧化氫，成都市科隆化學(xué)品有限公司；溴化鉀，北京化工廠(chǎng)。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004 N電子天平，上海箐海儀器有限公司；FW-135高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器，上海興創(chuàng)科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；SF-TDL-40D離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；LGJ-12真空冷凍干燥機(jī)，上海騰方儀器設(shè)備有限公司；T6紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 甘草種子蛋白的提取

分別稱(chēng)取適量3種甘草種子，進(jìn)行粉碎。將甘草種子粉末與石油醚按1∶10(g∶mL)的比例置搖床中振搖3 h后，重復(fù)3次、進(jìn)行抽濾；將脫脂后的粉末置于通風(fēng)處室溫下干燥12 h后，再次過(guò)篩，隨后置于4 ℃保存?zhèn)溆?。具體見(jiàn)圖1。

圖1 甘草種子水提蛋白

1.3.1.1 水提法

分別稱(chēng)取3種脫脂粉末各5 g，放入圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入蒸餾水100 mL[料液比為1∶20 (g∶mL)]，40 ℃下磁力攪拌提取2 h、過(guò)濾、離心，旋蒸濃縮、凍干，得到甘草種子蛋白。

1.3.1.2 乙醇提取法

分別稱(chēng)取3種脫脂粉末各3 g，放入圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇60 mL[料液比為1∶20(g∶mL)]，40 ℃下磁力攪拌提取2 h、過(guò)濾、離心，旋蒸濃縮、凍干，得到甘草種子蛋白。

1.3.1.3 醋酸提取法

分別稱(chēng)取3種脫脂粉末各3 g，置圓底燒瓶中，加入20%(體積分?jǐn)?shù))醋酸60 mL(1∶20，g∶mL)，40 ℃下磁力攪拌提取2 h、過(guò)濾、離心，旋蒸濃縮、凍干，得到甘草種子蛋白。

1.3.1.4 堿溶酸沉法

分別稱(chēng)取3種脫脂粉末各2 g，放入錐形瓶?jī)?nèi)，加入40 mL氫氧化鈉溶液(pH 10)，室溫靜置2 h、濃縮，將濃縮液置于錐形瓶中加入40 mL硫酸溶液(pH 4)室溫靜置1 h、離心、旋蒸、凍干，得到甘草種子蛋白。

1.3.1.5 磷酸鹽緩沖液

分別稱(chēng)取3種脫脂粉末各2 g，置錐形瓶中，加入40 mL PBS溶液(0.2 mol/L，pH 8)，室溫靜置2 h、離心、濃縮、凍干，得到甘草種子蛋白。

采用上述的不同方法提取3種甘草種子蛋白，并按照公式(1)計(jì)算蛋白提取率:

(1)

1.3.2 甘草種子蛋白含量的測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配制

稱(chēng)取10 mg BSA標(biāo)準(zhǔn)品，定容至10 mL，配制1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，置4 ℃冰箱存放。

1.3.2.2 考馬斯亮藍(lán)的配制

精確稱(chēng)取100 mg考馬斯亮藍(lán)，加入50 mL 95%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇進(jìn)行溶解，再倒入100 mL 85%(體積分?jǐn)?shù))的磷酸，并加入蒸餾水至1 000 mL定容，備用。

1.3.2.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液稀釋成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 mg/mL等不同質(zhì)量濃度，每管加1 mL蛋白溶液和3.0 mL考馬斯亮藍(lán)溶液后立即搖勻，避光放置5 min后在595 nm處測(cè)定其吸光值。以質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，以質(zhì)量吸光值作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.3 樣品中蛋白含量的測(cè)定

取10 mg甘草種子蛋白，加10 mL蒸餾水溶解，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的母液，離心、上清液加蒸餾水稀釋成不同倍數(shù)的待測(cè)液、按照上述的方法分別測(cè)定其吸光值。

1.3.4 傅里葉紅外光譜掃描

將水提法所得蛋白樣品采用溴化鉀壓片法制樣，用紅外光譜儀檢測(cè)其在4 000～400 cm-1的紅外吸收光譜。

1.3.5 掃描電鏡分析

取適量3種甘草種子蛋白粉末于樣品臺(tái)上，使用離子濺射儀在其表面鍍一層導(dǎo)電膜，在5.0 kV電壓下分別放大500和1 000倍觀察其表面形態(tài)，利用X-射線(xiàn)能譜儀測(cè)定蛋白樣品表面元素含量。

1.3.6 抗氧化活性測(cè)定[11]

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力

分別準(zhǔn)確取2 mL質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液，再加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液于試管中，室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)吸光值，平行測(cè)定3次。清除率計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A0、A1、A2分別代表空白組、樣品組、對(duì)照組的吸光度。

1.3.6.2 羥自由基清除能力

分別準(zhǔn)確取1.0 mL質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液，依次均加入1.0 mL 6 mmol/L 的硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇溶液和雙氧水。在37 ℃條件下反應(yīng)30 min后，510 nm處測(cè)吸光值，平行測(cè)定3次。清除率計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0、A1、A2分別代表空白組、樣品組、對(duì)照組的吸光度。

1.3.6.3 總還原能力的測(cè)定

分別準(zhǔn)確取0.8 mL質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液，再加入0.4 mL PBS 和10 g/L的鐵氰化鉀水溶液，于50 ℃條件下放置20 min，降至室溫，再加入0.4 mL 10 g/L的三氯乙酸水溶液、1.6 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1 g/L的三氯化鐵水溶液，室溫靜止10 min后在700 nm處測(cè)吸光值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)研究

通過(guò)Origin 2019和SPSS 26對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖和處理。每次試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草種子蛋白提取率

由表1可知，提取方法對(duì)蛋白提取率及含量影響較大，且不同提取方法得到的3種甘草種子蛋白提取率均存在顯著差異，水提法所得的3種蛋白的提取率顯著高于其他方法(P<0.01)，分別為19.14%、23.93%、22.60%，說(shuō)明水溶液可充分溶出樣品中的蛋白成分；醋酸和PBS提取的蛋白提取率次之，為10.65%～9.62%，對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度也較高；而剩余兩種方法的提取率較低，為8.61%～4.04%，其中乙醇溶液的提取效果最不理想，可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)使用了95%乙醇，高濃度有機(jī)溶劑使蛋白失活，導(dǎo)致此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不理想。

表1 甘草種子蛋白提取率

2.2 甘草種子蛋白含量

由表2可知，5種提取方法提取的3種甘草種子蛋白含量也存在一定的差異，其中水提取的各樣品蛋白含量均為最高，分別為36.54、30.80、30.12 mg/mL，顯著高于其他方法所得蛋白(P<0.01)；乙醇和PBS提取的蛋白含量次之，為30.04～25.57 mg/mL；而堿溶酸沉和醋酸溶液提取的蛋白含量相對(duì)較低，為25.90～20.01 mg/mL。

表2 甘草種子蛋白含量

通過(guò)比較不同提取方法可知，就蛋白提取率和含量而言，水提法提取率及含量均較高，說(shuō)明水溶液能夠使甘草種子蛋白充分溶出。因此，最終選擇水提法作為甘草種子蛋白提取工藝，并后期將對(duì)它進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3 紅外光譜分析

GUSP-烏拉爾甘草種子蛋白；GISP-脹果甘草種子蛋白；GGSP-光果甘草種子蛋白

表3 甘草種子蛋白紅外光譜峰位及解析

3.4 掃描電鏡圖像分析

可通過(guò)SEM對(duì)蛋白樣品進(jìn)行清晰地定位分析，從而可觀察其微觀形貌結(jié)構(gòu)特征，蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)反映了其分子的聚集情況，能夠影響甚至決定蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。由圖3-A可知，烏拉爾甘草種子蛋白主要呈現(xiàn)出不規(guī)則的片狀和纖維狀聚集碎裂和疏松的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，說(shuō)明蛋白質(zhì)原有的纖維結(jié)構(gòu)基本沒(méi)有遭到損壞。圖3-B顯示脹果甘草種子蛋白呈現(xiàn)出表面光滑的片狀和棒狀結(jié)構(gòu)狀態(tài)，且其厚薄較均勻，明顯保持了較完整的結(jié)構(gòu)。如圖3-C所示，光果甘草種子蛋白呈現(xiàn)出不規(guī)則的棒狀和片狀及球狀結(jié)構(gòu)狀態(tài)，且存在少量大小不一的微孔，說(shuō)明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有部分被改變，但蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)仍較為完整。綜上所述，水提法提取的甘草種子蛋白保留了較完整的結(jié)構(gòu)，擁有較廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。

A-烏拉爾甘草種子蛋白；B-脹果甘草種子蛋白；C-光果甘草種子蛋白

表面元素組成的結(jié)果如表4所示，3種甘草種子蛋白均含有一定含量的氮和磷元素，此外，脹果甘草種子蛋白還含有少量硅元素；其中，磷是參與骨代謝和組成骨骼中無(wú)機(jī)鹽成分的主要元素，能夠維持骨骼和牙齒的健康[14]。

表4 甘草種子蛋白元素分析表

2.5 甘草種子抗氧化活性

2.6.1 DPPH自由基清除能力

DPPH是一種具有很強(qiáng)穩(wěn)定性的自由基，其存在孤對(duì)電子，一旦遇到抗氧化劑，因孤對(duì)電子與抗氧化劑進(jìn)行配對(duì)，會(huì)使其顏色變淺，光譜吸收減少，因此，根據(jù)DPPH自由基的含量變化可以判斷物質(zhì)的抗氧化能力。

由圖4可知，3種甘草種子蛋白質(zhì)量濃度與其清除率呈明顯的正相關(guān)關(guān)系。其中，烏拉爾甘草種子蛋白的清除作用稍強(qiáng)于其余2個(gè)品種(P<0.01)，在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)到92.37%；脹果甘草次之，而光果甘草為最低，在相同質(zhì)量濃度下，兩者對(duì)DPPH自由基的清除率分別為82.78%和72.91%。通過(guò)計(jì)算得出3種樣品的IC50分別為0.37、0.47、0.61 mg/mL，這說(shuō)明3種樣品均有較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力。

圖4 DPPH自由基清除率

2.6.2 羥自由基清除能力

羥自由基清除能力，是指具有提供氫質(zhì)子能力的抗氧化劑能夠還原高度氧化的羥自由基，從而阻止自由基的連鎖反應(yīng)的能力。由圖5可知，3種甘草種子蛋白對(duì)羥自由基的清除能力隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而顯著提高(P<0.01)。在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，3種樣品對(duì)羥自由基的清除率從高到低的排序?yàn)椋簽趵瓲柛什莘N子、脹果甘草種子、光果甘草種子；其清除率分別為77.30%、70.01%、65.81%。通過(guò)計(jì)算得出3種樣品的IC50依次為0.51、0.92、0.77 mg/mL，由此推測(cè)，3種甘草種子蛋白均具有較強(qiáng)的供氫能力。

圖5 羥自由基清除率

2.6.3 總還原能力

3種甘草種子蛋白均有一定的還原能力(圖6)。其中，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)，烏拉爾甘草種子蛋白的還原能力稍強(qiáng)于其余2個(gè)品種，可達(dá)到2.344，而脹果甘草和光果甘草間差異并不顯著，在相同質(zhì)量濃度下兩者總還原能力分別為2.012和1.998。說(shuō)明3種甘草種子都擁有良好的還原能力。通過(guò)抗氧化測(cè)定結(jié)果得知，3種甘草種子蛋白均具備了較好的清除自由基的能力和總還原能力，是一種潛在的抗氧化劑，可在醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域中發(fā)揮作用。

圖6 總還原能力

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1 提取率及含量

豆科植物作為一種理想的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)來(lái)源，已普遍被大眾食用，其中被譽(yù)為“黃金豆”的鷹嘴豆更是具有低過(guò)敏性、高生物效價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，并且其蛋白質(zhì)提取率高達(dá)82.33%[15]。陳曉萌等[16]對(duì)2種紅蕓豆的蛋白含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其可溶性蛋白提取率與含量均為最高，分別為57.65%、66.81%和74.08%、66.50%。而蕓豆籽的蛋白含量為20%～30%[17]，較接近于甘草種子蛋白。以往的研究表明，甘草的根、莖和葉子部位均含有豐富的蛋白質(zhì)。丁原全等[18]測(cè)得甘草根莖中氨基酸種類(lèi)多達(dá)18種，其中人體必需氨基酸含量達(dá)到62.87 mg/mL，證明甘草是一種優(yōu)質(zhì)蛋白資源。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)水提法提取的3種甘草種子蛋白提取率最高可達(dá)19.14%、23.93%、22.60%，相對(duì)應(yīng)的蛋白含量為36.54、30.80、30.12 mg/mL，雖然其蛋白提取率與含量均沒(méi)有大部分豆科植物高，但其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值絕對(duì)不容小覷。由此推斷，甘草種子有望作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來(lái)源，代替甘草根入藥，來(lái)實(shí)現(xiàn)充分利用甘草各個(gè)部位，節(jié)省甘草資源，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)變廢為寶。

3.1.2 結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)是由氨基酸經(jīng)肽鍵連接而成的生物大分子，其結(jié)構(gòu)能夠反映其分子的聚集情況，能夠影響甚至決定蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。黑蕓豆蛋白在紅外光譜掃描下表現(xiàn)出幾個(gè)特征峰，包括3 278.63 cm-1處的酰胺 A 帶、1 634.31 cm-1處的酰胺Ⅰ帶和1 519.76 cm-1處的酰胺 Ⅱ 帶[19]。李婷等[20]通過(guò)掃描電鏡觀察花生粕4種蛋白發(fā)現(xiàn)，在2 000 倍下4種蛋白結(jié)構(gòu)具有顯著差異；清蛋白表面存在棱狀突起和孔隙；球蛋白表面不平整，無(wú)多孔結(jié)構(gòu)；醇溶蛋白表面高度不均勻，呈球狀，連接緊密。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)分析3種甘草種子蛋白的紅外光譜掃描圖得知，3種樣品均在1 640～1 660 cm-1處有吸收峰，其中烏拉爾甘草種子蛋白的吸收峰在1 637 cm-1處，歸屬于β-折疊，而脹果甘草和光果甘草種子蛋白的吸收峰分別在1 654 和1 664 cm-1處，說(shuō)明均具有α-螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)觀察3種甘草種子蛋白在500和1 000倍放大的掃描電鏡圖得知，烏拉爾甘草種子蛋白主要呈現(xiàn)出不規(guī)則的片狀和纖維狀聚集碎裂和疏松的結(jié)構(gòu)狀態(tài)；脹果甘草種子蛋白呈現(xiàn)出表面光滑的片狀和棒狀結(jié)構(gòu)狀態(tài)，且其厚薄較均勻；光果甘草種子蛋白呈現(xiàn)出不規(guī)則的棒狀和片狀及球狀結(jié)構(gòu)狀態(tài)，且存在少量大小不一的微孔。綜上所述，水提法提取的甘草種子蛋白與一些豆科植物有著相似的結(jié)構(gòu)，因此也可能擁有一致的生物活性。

3.1.3 抗氧化

豆類(lèi)因含有豐富的蛋白質(zhì)成分被認(rèn)為是天然抗氧化劑的來(lái)源，豆類(lèi)蛋白質(zhì)構(gòu)成了世界上大多數(shù)地區(qū)人們飲食中不可或缺的部分，為促進(jìn)機(jī)體健康付出的貢獻(xiàn)不容忽視。曲柳青等[21]對(duì)英國(guó)紅蕓豆蛋白進(jìn)行水解，得到的抗氧化肽對(duì)DPPH自由基和羥自由基均有較高的抑制效果，分別為215.31和181.59 U/mg。以往的研究結(jié)果證明，甘草多糖也擁有較高的抗氧化能力。柴美靈等[22]通過(guò)利用超聲輔助水提法從烏拉爾甘草根中提取多糖，發(fā)現(xiàn)其對(duì)DPPH自由基有一定的清除作用，其IC50為2.80 mg/mL。MUTAILLIFU等[23]以光果甘草根為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)其多糖對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除效果，樣品質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，其清除活性為約83%，并且在多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率為24.1%。此外，最新研究發(fā)現(xiàn)3種甘草籽多糖的體外抗氧化活性均高于其根部多糖，并且與蛋白質(zhì)結(jié)合的多糖可以增強(qiáng)分子的負(fù)電荷，能夠更好地穩(wěn)定自由基，抑制氧化反應(yīng)[24]。本實(shí)驗(yàn)研究的甘草種子蛋白體外抗氧化活性結(jié)果顯示，3種蛋白樣品均有較好的自由基清除能力與還原能力，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，烏拉爾甘草種子蛋白對(duì)DPPH自由基、羥自由基的清除能力與總還原能力均為最高，分別為92.37%、77.30%和2.344；IC50分別為0.37和0.51 mg/mL。根據(jù)上述數(shù)據(jù)推斷，甘草種子蛋白對(duì)自由基可能有更強(qiáng)的清除效果，對(duì)此還需進(jìn)行更深入的研究比較來(lái)驗(yàn)證。此外，紫花蕓豆蛋白的羥自由基清除率和總還原能力分別為23.96%和0.280 5[25]。因此，可以判斷甘草種子具有較強(qiáng)的的體外抗氧化活性，并且甘草種子蛋白的體外抗氧化活性可能比部分豆科植物蛋白更高。

3.2 結(jié)論

本研究對(duì)3種甘草種子蛋白的最佳提取方法、結(jié)構(gòu)和抗氧化能力進(jìn)行了研究和比較。結(jié)果表明，水提法得到的蛋白提取率與含量均為最高，提取率分別為19.14%、23.93%、22.60%，含量分別為36.54、30.80、30.12 mg/mL；3種蛋白的紅外光譜都較為相似，均顯出了典型的蛋白吸收峰，其中烏拉爾甘草種子蛋白具有β-折疊結(jié)構(gòu)，而脹果甘草和光果甘草種子蛋白具有α-螺旋結(jié)構(gòu)。掃描電鏡圖像結(jié)果顯示，3種蛋白呈現(xiàn)出不同的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，但均保留了較完整的結(jié)構(gòu)。此外，所有蛋白均對(duì)DPPH自由基和羥自由基有較強(qiáng)的清除能力以及總還原能力。由此可見(jiàn)，甘草種子蛋白具有較好的抗氧化能力，研究結(jié)果可為甘草種子蛋白的進(jìn)一步探究和利用及甘草新型蛋白資源的開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。