超聲-水酶法對(duì)高品質(zhì)薄殼山核桃油釋放的影響

汪錦，應(yīng)瑞峰，王耀松，黃梅桂

(南京林業(yè)大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，江蘇 南京，210037)

薄殼山核桃又名碧根果(Caryaillinoinensis)，19世紀(jì)初引進(jìn)我國，在云南、浙江、江蘇和安徽等地區(qū)均有廣泛種植[1]。薄殼山核桃通常用在烘焙和糖果中，適量食用薄殼山核桃，可預(yù)防Ⅱ型糖尿病、高血壓和肥胖癥等疾病。薄殼山核桃中約含65%的油脂，以及蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)素[2]，而油脂中有大量有益健康的化合物可用于制造黃油、乳液等可食用產(chǎn)品[3]。

薄殼山核桃油的提取方法有：機(jī)械壓榨法(mechanical pressing，MP)、超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，SFE)和水酶法。但MP提取的油脂的主要問題是提取率低[4]，目前對(duì)SFE和水酶法已經(jīng)有了不少研究，SFE利用流體高密度和低黏度的特點(diǎn)，能有選擇性地提取出油脂[5]，但設(shè)備昂貴，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。鑒于水酶法在生產(chǎn)成本、油得率和產(chǎn)物綜合利用等方面的優(yōu)勢(shì)受到廣泛關(guān)注，目前已有研究將水酶法應(yīng)用于對(duì)山核桃、油茶籽、大豆等油料作物的提取[6]。水酶法選用特異性酶來降解細(xì)胞壁或脂蛋白、脂多糖，從而使油釋放，并利用油與水密度差異及不相溶性將其分離，實(shí)現(xiàn)油脂的提取。盡管通過酶引起的細(xì)胞壁降解可改善油通過膜的滲透性，但通過水酶法提取油脂依然比傳統(tǒng)方法提取效率低，如果在水酶法中運(yùn)用超聲波輔助處理，則可進(jìn)一步提高滲透性[7]。超聲處理提高油得率是利用超聲波產(chǎn)生空化效應(yīng)，空化氣泡產(chǎn)生的剪切力會(huì)破壞細(xì)胞壁，進(jìn)一步加快油脂擴(kuò)散到溶劑中，與傳統(tǒng)方法相比，超聲-水酶法(ultrasonic-assisted enzymatic extraction，UAEE)提取條件溫和，避免極端提取環(huán)境對(duì)油脂營養(yǎng)物質(zhì)的破環(huán)，使獲得高營養(yǎng)與感官質(zhì)量的油脂[8]。

盡管超聲處理不可避免的會(huì)產(chǎn)生乳狀液，但提取效率仍顯著增加，目前大多數(shù)研究只是確立了最佳提取工藝，卻忽略了油脂釋放機(jī)理以及油脂品質(zhì)的探討[6-7]。本試驗(yàn)中，在確定了超聲輔助果膠酶法提取薄殼山核桃油脂的最佳工藝條件的基礎(chǔ)上，著重探究了酶對(duì)薄殼山核桃油脂的釋放機(jī)理；并將優(yōu)化后的UAEE與MP、SFE提取薄殼山核桃油的理化性質(zhì)、脂肪酸組成和總抗氧化活性等進(jìn)行分析比較，確定了UAEE的優(yōu)勢(shì)所在和可完善的提取環(huán)節(jié)；旨在為薄殼山核桃油的精準(zhǔn)提取、高效開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

市售干燥的薄殼山核桃(波尼)；果膠酶(500 U/mg)，上海源葉生物科技有限公司；本試驗(yàn)中的甲酯化試劑均為色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；無水乙醚(30～60 ℃)、氫氧化鉀、氯化鈉等試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

FE28 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；JY92-IIDN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-18MS 高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JEM-1400 透射電鏡，日本電子株式會(huì)社；Quanta 200 環(huán)境掃描電子顯微鏡，美國FEI公司；Agilent 7890A 氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；SpectraMax i3x 酶標(biāo)儀，上海美谷分子儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 薄殼山核桃脂肪含量的測(cè)定

參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》，測(cè)定薄殼山核桃的脂肪含量。

1.2.2 UAEE提取薄殼山核桃油

首先稱取(5.00±0.01) g粉碎后的薄殼山核桃粉放入100 mL的燒杯中，按1∶8(g∶mL)的料液比加入蒸餾水，在300 W的超聲功率下進(jìn)行超聲預(yù)處理20 min，調(diào)節(jié)pH至3.5，加入一定量的果膠酶，其次，在55 ℃下恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)4 h后，置于80 ℃水浴10 min滅酶，再經(jīng)8 000 r/min離心10 min，收集1次清油后，去除水解液，把剩余乳狀液及殘?jiān)湃?40 ℃冰箱24 h后放置于25 ℃恒溫箱內(nèi)解凍至完全融化，重復(fù)上述離心操作，收集2次清油[9]。油得率計(jì)算如公式(1)所示，所有試驗(yàn)平行重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

(1)

式中：M1為薄殼山核桃仁的質(zhì)量，g；M2為總清油的質(zhì)量，g；65.29為薄殼山核桃中的脂肪含量，%。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

按照1.2.2 UAEE的步驟，單因素水平如下：加酶量為0%、0.2%、0.8%、1.0%、1.2%、2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))(以薄殼山核桃仁計(jì))，酶解時(shí)間為2、3、4、5、6 h，料液比為1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9(g∶mL)，超聲功率100、200、300、400、500 W，超聲時(shí)間5、10、15、20、25 min，所有試驗(yàn)平行重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3 薄殼山核桃油的性質(zhì)測(cè)定

1.3.1 超聲對(duì)薄殼山核桃微觀結(jié)構(gòu)的影響

薄殼山核桃透射電鏡參照LIU等[10]的方法并稍作修改。取薄殼山核桃切片放入戊二醛和鋨酸溶液里依次固定后，用一定濃度的丙酮逐級(jí)脫水，然后置于恒溫箱中37～45～60 ℃溫度段分別過夜，最后切片置于透射顯微鏡下觀察。將超聲前后的薄殼山核桃粉固定在金屬載臺(tái)，并將樣品表面噴金，于環(huán)境掃描電子顯微鏡下觀察。

1.3.2 油脂理化性質(zhì)的測(cè)定

水分含量的測(cè)定參照GB 5009.236—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)植物油脂水分及揮發(fā)物的測(cè)定》，酸價(jià)的測(cè)定參照GB 5009.229—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》，過氧化值的測(cè)定參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》，共軛二烯(K232)與共軛三烯(K268)的測(cè)定參照GB/T 22500—2008《動(dòng)植物油脂 紫外吸光度的測(cè)定》。

1.3.3 脂肪酸組成的測(cè)定

參照GB 5009.168—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》的方法來進(jìn)行脂肪酸的甲酯化與測(cè)定，采用峰面積歸一化法定量測(cè)量脂肪酸含量。

1.3.4 角鯊烯的測(cè)定

參照LS/T 6120—2017《糧油檢驗(yàn) 植物油中角鯊烯的測(cè)定 氣相色譜法》中的方法測(cè)定角鯊烯的含量，采用內(nèi)標(biāo)法量測(cè)量角鯊烯含量。

1.3.5 酚類化合物的提取及總酚、總黃酮的測(cè)定

參照本課題組已有方法[11]，采用福林酚法測(cè)定總酚含量，結(jié)果以每千克油中沒食子酸的含量表示(mg GAE/kg)。亞硝酸鈉-氯化鋁法測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果以每千克油中蘆丁的含量表示(mg GAE/kg)。

1.3.6 總抗氧化活性的測(cè)定

參照本課題組已有方法[11]，總抗氧化活性的測(cè)定分為：ABTS陽離子自由基清除活性、DPPH自由基清除活性和鐵離子還原能力測(cè)定。結(jié)果都以含有Trolox物質(zhì)的量表示(μmol TE/kg)。

1.3.7 不同提取方法的薄殼山核桃油的熱重測(cè)定

稱取(10.0±0.1) mg樣品，放置于樣品盤中，測(cè)試溫度25～600 ℃[12]。掃描速率10 K/min，N2保護(hù)，記錄溫度變化與質(zhì)量的關(guān)系曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均平行重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，數(shù)據(jù)采用Origin 2018進(jìn)行繪制。用SPSS 26進(jìn)行單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)，并檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性，不同字母標(biāo)注表示具有顯著差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 UAEE提取薄殼山核桃油脂單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 酶的種類、酶量、酶解時(shí)間和料液比對(duì)薄殼山核桃油得率的影響

酶的選擇取決于油料的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁組成，果仁細(xì)胞壁一般由果膠、纖維素和半纖維素組成，不同的酶單一或混合使用都會(huì)產(chǎn)生不同的提取效果。如圖1-a所示，混合使用果膠酶和堿性蛋白酶時(shí)，提取效率最高可達(dá)(75.2±1.4)%，可能是由于堿性蛋白酶能夠使嵌在細(xì)胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的蛋白體水解，增強(qiáng)細(xì)胞壁的膜滲透力，使油脂更容易被釋放[13]。由各種酶的提取率可知，薄殼山核桃細(xì)胞壁的主要成分是果膠，從試驗(yàn)操作來考慮，接下來使用果膠酶進(jìn)行試驗(yàn)。

除了酶種類，酶添加量和酶解時(shí)間也會(huì)影響油得率，如圖1-b所示，酶添加量在0.0%～1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，油得率呈顯著增加趨勢(shì)，這是因?yàn)樘岣呙柑砑恿靠梢栽黾用概c底物分子之間的碰撞，提高反應(yīng)速度，有利于油脂的釋放[14]。在酶的添加量為1%時(shí)，油得率達(dá)到(73.9±0.78)%，當(dāng)繼續(xù)增加酶量時(shí)，油得率增加不顯著(P<0.05)，然而，酶量過大會(huì)導(dǎo)致酶解細(xì)胞壁速率變快以及產(chǎn)生苦味和異味[15]，還會(huì)增加工藝成本。如圖1-c所示，酶添加量為1%時(shí)，酶解時(shí)間從2 h增加到4 h，油得率呈快速上升趨勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間繼續(xù)延長，提取率反而有所下降。這主要是因?yàn)榧?xì)胞壁降解出的水溶性的單糖、低聚糖，由于酶解時(shí)間過長又與釋放出來的油滴和蛋白水解液在酸性環(huán)境不斷攪拌的情況下，形成穩(wěn)定的乳狀液，使油滴難以從乳狀液中分離出來[16]。過多延長酶解時(shí)間，會(huì)使薄殼山核桃油暴露在空氣中的時(shí)間過長，接觸氧氣，造成油脂過氧化，因此確定4 h為最佳酶解時(shí)間。

合適的料液比有助于酶滲透到底物中，由圖1-d可知，當(dāng)料液比用量過低時(shí)，薄殼山核桃仁中大量油脂、蛋白質(zhì)導(dǎo)致漿料黏度較大，導(dǎo)致果膠酶與底物接觸不完全，不利于酶解的進(jìn)行。當(dāng)料液比過高時(shí)，酶和底物濃度則會(huì)變得相對(duì)較低，酶與底物發(fā)生碰撞的幾率降低，影響果膠酶的反應(yīng)速率[17]?？紤]到副產(chǎn)物的濃縮與生產(chǎn)成本，因此，確定1∶8(g∶mL)為最佳的料液比。

a-酶的種類；b-酶添加量；c-酶解時(shí)間；d-料液比

2.1.2 超聲功率和時(shí)間對(duì)薄殼山核桃油得率的影響

超聲功率和時(shí)間對(duì)油得率的影響如圖2-a、圖2-b所示，隨著超聲功率和時(shí)間的增加，薄殼山核桃油得率呈先增大后減小的趨勢(shì)。由此可見，超聲功率和時(shí)間對(duì)油得率的影響是雙重的，提高超聲功率和時(shí)間有利于增加熱量和剪切力，使油脂體分解導(dǎo)致蛋白和油滴暴露于水相促進(jìn)氫鍵結(jié)合，這種反應(yīng)有助于蛋白質(zhì)或碳水化合物聚集體的解體[18]、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、增大酶與底物分子的接觸面積、加速了油脂的釋放，從而縮短提取時(shí)間、提高油得率。另一方面，高超聲功率會(huì)導(dǎo)致油脂降解或異構(gòu)化，導(dǎo)致油得率下降[19]。超聲時(shí)間過長，會(huì)增加能耗，使油品質(zhì)下降，因此，選擇300 W和20 min為最佳條件。

a-超聲功率；b-超聲時(shí)間

2.1.3 超聲促進(jìn)油脂釋放情況

為了更好地了解UAEE提取油脂的機(jī)制，用透射顯微鏡來觀察薄殼山核桃的優(yōu)質(zhì)體與蛋白體，如圖3-a、圖3-b所示，觀察到薄殼山核桃中的油脂體與蛋白體多呈球形和橢圓形，很少有不規(guī)則形狀。薄殼山核桃油脂體的平均直徑為(4.18±1.39) μm，油脂體直徑較大且數(shù)量多于蛋白體，這表明油體需要適量的酶來與細(xì)胞壁反應(yīng)[20]。超聲預(yù)處理可以產(chǎn)生空化作用導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，使酶與油脂體的接觸面積增大，從而徹底釋放油脂。如圖3-c、圖3-d所示，樣品在超聲前，表面結(jié)構(gòu)未見明顯破壞，經(jīng)過超聲后，樣品的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出明顯的不規(guī)則孔洞，表明超聲預(yù)處理有助于破壞樣品的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)油的釋放，這與KHADHRAOUI等[21]的研究結(jié)果相似。

2.1.4 不同提取方式的薄殼山核桃油脂品質(zhì)

2.1.4.1 不同提取方式的薄殼山核桃油脂理化性質(zhì)、脂肪酸組成及角鯊烯含量的對(duì)比

油脂的理化性質(zhì)可以預(yù)判油脂的品質(zhì)，薄殼山核桃油的理化性質(zhì)包括：水分含量、過氧化值、酸價(jià)、K232、K268、脂肪酸組成、角鯊烯。如表1所示，3種提取方式的水分含量較低且無顯著差異(P<0.05)。K232、K268反映油脂中的多不飽和脂肪酸的氫過氧化程度越高，油脂的氧化穩(wěn)定性越弱。UAEE提取油脂的K268值最高，這與酶解時(shí)間有一定關(guān)系[22]。過氧化值和酸價(jià)是反映油脂品質(zhì)的重要指標(biāo)，UAEE提取的油脂的過氧化值為(0.032±0.003) mg/g，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，可能是因?yàn)楣z酶能使油脂的氧化程度降低[23]。3種提取方式的過氧化值和酸價(jià)均低于GB 2716—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物油》中0.25 g/100g和4 mg/g的上限。

薄殼山核桃油的脂肪酸主要是棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸，還含有其他少量的脂肪酸如：γ-亞油酸、二十烯酸等[2]。由表1可知，提取方式對(duì)脂肪酸的組成影響不大，但影響其脂肪酸含量，UAEE組油的總不飽和脂肪酸含量在90%以上，且油酸含量為68.62%顯著高于MP組的66.61%和SFE組的65.19%(P<0.05)，這可能是因?yàn)槌曁幚砑铀倭思?xì)胞壁的降解，有利于油脂的溶出[24]。MP組油中角鯊烯含量最少為(98.11±5.36) mg/kg，是因?yàn)樵趬赫ミ^程中，油料處理溫度較高且榨油機(jī)也產(chǎn)生極大的剪切力與高溫，導(dǎo)致角鯊烯的損失，然而UAEE反應(yīng)條件比較溫和，角鯊烯相對(duì)損失較小，但與SFE相比，還有一定的差距。根據(jù)理化性質(zhì)結(jié)果表明，UAEE組油與MP和SFE組相比，具有一定優(yōu)勢(shì)。

表1 不同提取方式薄殼山核桃油的理化性質(zhì)、脂肪酸組成及角鯊烯含量的對(duì)比

2.1.4.2 不同提取方式的油的總酚、總黃酮及總抗氧化活性

多酚類物質(zhì)是油脂的天然抗氧化劑，對(duì)油脂的加工、貯藏具有重要意義。由表2可知，MP、UAEE和SFE提取的酚類化合物含量分別為(199.9±9.26)、(129.0±2.26)和(111.6±7.79) mg GAE/kg，UAEE的多酚化合物含量顯著低于MP(P<0.05)，主要是因?yàn)樗庖褐卸嗵桥c酚類之間的相互作用，形成穩(wěn)定的多酚-多糖復(fù)合物，這也被認(rèn)為是提取過程中酚類物質(zhì)損失的主要原因之一，但超聲處理和添加果膠酶有利于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，使活性物質(zhì)釋放到油脂中[23]。DPPH、ABTS用于評(píng)估提取化合物的自由基清除活性，而鐵離子還原/抗氧化能力法(ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)來確定提取化合物的鐵離子還原能力，由表2可知，3種方式提取油脂的DPPH抗氧化活性并無顯著差異(P<0.05)。UAEE的ABTS抗氧化活性比SFE低，這可能是由于UAEE組中的酚類被果膠酶降解，大部分親水性酚類溶于水解液而浪費(fèi)[11]。FRAP的變化趨勢(shì)與DPPH抗氧化活性相似，綜上所述，超聲處理和添加果膠酶在一定程度上能夠提高油脂的抗氧化能力。

表2 不同提取方式的總酚、總黃酮及總抗氧化活性

2.1.4.3 不同提取方式的薄殼山核桃油脂的熱重

油脂在加熱過程中，熱穩(wěn)定性的改變常常表現(xiàn)為小分子物質(zhì)的生成，導(dǎo)致油脂質(zhì)量的變化。不同提取方式的薄殼山核桃油脂的失重率如圖4所示，UAEE提取的油脂在25～397 ℃質(zhì)量幾乎不變化，主要是揮發(fā)性物質(zhì)較少。MP、SFE提取的油脂明顯比UAEE起始氧化溫度要低，油脂在397～480 ℃失重速率較高，主要是甘油三酯及不飽和脂肪酸的降解，其余則為碳質(zhì)殘?jiān)黐25]，在500 ℃附近油脂幾乎全部失重[12]。不同提取方式的薄殼山核桃油脂氧化進(jìn)程相似，起始失重溫度接近，但UAEE組油的失重幅度比MP和SFE組的油要小，可能是因?yàn)镸P和SFE提取油脂的飽和脂肪酸比UAEE含量高，說明UAEE提取的油脂有良好的熱氧化穩(wěn)定性。

圖4 不同提取方式的薄殼山核桃油熱重曲線

3 結(jié)論與討論

UAEE以MP、SFE提取的薄殼山核桃油脂為對(duì)照，UAEE比MP和SFE提取的油酸分別約高2%和3.4%，UAEE組油的總不飽和脂肪酸含量在90%以上，表明UAEE有助于油酸的提取和保留，油脂的過氧化值低于對(duì)照組，這說明在提取過程中超聲處理和添加果膠酶能使油脂的氧化程度降低，UAEE組脂的熱裂解溫度較高且失重幅度低，說明油脂中含有較多的抗氧化物質(zhì)和較少的飽和脂肪酸，防止油脂氧化裂解，超聲處理和果膠酶能有效降解薄殼山核桃細(xì)胞壁，有助于果仁中游離酚的釋放，從而提高薄殼山核桃油中總酚含量及抗氧化活性。這些結(jié)果都表明適當(dāng)超聲預(yù)處理和添加果膠酶有助于薄殼山核桃油脂品質(zhì)的提高，同時(shí)降低提取時(shí)間，節(jié)約成本。UAEE提取的薄殼山核桃油脂具有良好的營養(yǎng)保健功能，可作為功能性油脂來開發(fā)利用。