枸杞酒釀酒酵母的選育及其產(chǎn)香性能分析

趙苗苗，趙智慧，董建方，馬艷，陸健*，吳殿輝*

1(工業(yè)微生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物工程學(xué)院(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)3(江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)4(寧夏紅枸杞產(chǎn)業(yè)有限公司研發(fā)中心，寧夏 中衛(wèi)，755000)

果汁自然發(fā)酵成果酒的過程涉及多種微生物的參與，其中釀酒酵母起著核心作用[1]。使用釀酒酵母對(duì)果汁進(jìn)行純種發(fā)酵，可以更好地控制發(fā)酵過程，避免感官偏差、產(chǎn)品質(zhì)量不均等問題[2-3]。目前，市售枸杞酒以浸泡型枸杞酒為主，即以白酒或黃酒為酒基，通過對(duì)枸杞等中藥材浸泡、勾兌等調(diào)配而成。但此法得到的枸杞酒口感較差、品質(zhì)不穩(wěn)定、易沉淀，且枸杞中的生物活性成分提取不完全，保存率低[4]。發(fā)酵型枸杞酒相較于浸泡型枸杞酒能保留枸杞中原有的活性物質(zhì)，且酒精度低，適應(yīng)人群廣。目前發(fā)酵枸杞酒所用釀酒酵母為葡萄酒、果酒通用酵母，因缺少專用的釀酒酵母導(dǎo)致發(fā)酵枸杞酒酒體單薄、風(fēng)味不足、缺乏典型性等問題。因此，選育適合特定水果發(fā)酵的釀酒酵母是釀酒行業(yè)持續(xù)關(guān)注并亟需解決的問題[5]。

現(xiàn)代生物育種方法主要有誘變、基因工程及原生質(zhì)體融合技術(shù)等[6]。張惠玲[7]通過原生質(zhì)體融合方法打破分類界定，實(shí)現(xiàn)種間或更遠(yuǎn)緣的基因交流，篩選出適合枸杞酒釀造的新菌株，該菌株使枸杞酒中酯含量提高5%，酒精度提高2%vol～3%vol，發(fā)酵物質(zhì)增加了5%～7%，但風(fēng)味物質(zhì)增加不明顯，需要進(jìn)一步改善酒體典型風(fēng)味不突出的問題。田甜甜[6]通過常壓室溫等離子體誘變(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)、高通量篩選(high-throughput screening，HTS)以及適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化定向選育了1株耐酸性強(qiáng)、產(chǎn)香性能良好、用于青梅酒發(fā)酵的釀酒酵母ET008-c54。與其他育種方法相比，ARTP誘變技術(shù)進(jìn)行微生物育種具有突變頻率高、操作簡單、成本低、安全、無污染等特點(diǎn)[8]。因此針對(duì)枸杞酒香氣不足且典型性不突出等問題，選育適用于枸杞果汁發(fā)酵的釀酒酵母，是提高枸杞酒香氣質(zhì)量的根本所在。

本文從枸杞汁自然發(fā)酵液中分離篩選可以提高酒體醇厚性和風(fēng)味物質(zhì)含量的釀酒酵母。利用ARTP誘變和HTS方法進(jìn)一步選育產(chǎn)香性能較好的突變株，并通過自釀枸杞酒與2種市售發(fā)酵枸杞酒的理化指標(biāo)及風(fēng)味物質(zhì)的定量分析，解析了選育菌株在釀造枸杞酒產(chǎn)香方面的優(yōu)勢(shì)，并通過氣味活性值(odor activity value，OAV)分析確定了影響枸杞酒風(fēng)味的主要化合物，為枸杞酒工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和原料

果酒活性干酵母RW、SY和RV171，安琪酵母股份有限公司；活性干酵母DV10，法國萊蒙特葡萄酒酵母公司。

枸杞干果(寧杞5號(hào))、市售發(fā)酵枸杞酒健康快車(酒精度約12%vol，糖度約30 g/L，配料表：枸杞、二氧化硫)和金色傳杞(酒精度約12%vol，糖度約10 g/L，配料表：枸杞、二氧化硫)，寧夏紅枸杞產(chǎn)業(yè)集團(tuán)。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

1.2.1 試劑

酵母提取物、胰蛋白胨、葡萄糖和氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)，中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、濃鹽酸、甲醇、無水乙醇等常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司；果膠酶，白銀賽諾生物科技有限公司；乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、β-紫羅蘭酮等標(biāo)準(zhǔn)品，阿拉丁(上海)生物科技有限公司。

1.2.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉1，葡萄糖2，胰蛋白胨2，115 ℃滅菌20 min；配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入瓊脂粉1.5～2.0。

TTC下層培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母浸膏10，瓊脂粉20。

TTC上層培養(yǎng)基(g/L)：TTC 0.05，葡萄糖0.5，瓊脂粉20。

1.3 儀器與設(shè)備

ARTP-3常壓室溫等離子體誘變儀，思清源生物科技有限公司；GC-MS，賽默飛世爾科技有限公司；LS-B50L自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司；SHP-2500低溫培養(yǎng)箱，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 枸杞酒釀酒酵母的初步篩選

1.4.1.1 釀酒酵母的分離

取5 g寧杞5號(hào)枸杞干果于30 mL無菌水中，室溫下靜置培養(yǎng)12 h，將培養(yǎng)液搖勻后進(jìn)行梯度稀釋，并涂布于YPD固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h，待菌落長出后，挑取單菌落劃線于YPD培養(yǎng)基平板中進(jìn)行純化，并保藏于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1.2 釀酒酵母的一級(jí)篩選

挑取YPD培養(yǎng)基上的單菌落于TTC下層培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，倒入15 mL TTC上層培養(yǎng)基，并于30 ℃避光培養(yǎng)24 h。TTC顯色原理是：活菌中所含脫氫酶可將TTC還原成紅色，使平板上的菌落顏色呈現(xiàn)肉眼可見的紅色菌落，且呈色的深淺可判斷酵母產(chǎn)酒精能力的高低，產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母會(huì)顯示深紅色，次之顯粉紅色、微紅色或不顯色[9]。因此TTC可作為釀酒酵母利用葡萄糖產(chǎn)乙醇能力的顯色劑。

1.4.1.3 釀酒酵母的二級(jí)篩選

取30 ℃，220 r/min培養(yǎng)48 h后的菌液50 μL接種于含有杜氏小管的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃，靜置培養(yǎng)，每2 h觀察1次杜氏小管中氣泡體積。杜氏管中產(chǎn)生氣泡的時(shí)間和氣泡的體積可直接反映菌株發(fā)酵的起酵速度和發(fā)酵能力。通過杜氏小管篩選試驗(yàn)，篩選出起酵速度快且發(fā)酵能力強(qiáng)的菌株。

1.4.1.4 釀酒酵母的三級(jí)篩選

不同的釀酒酵母分別進(jìn)行枸杞酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵工藝如下：枸杞20 g，料液比為1∶10(質(zhì)量比)，白砂糖調(diào)節(jié)糖度為200 g/L，酵母接種密度為1×107CFU/mL，添加偏重亞硫酸鉀至SO2含量為100 mg/L，果膠酶為30 U/g，發(fā)酵溫度20 ℃。每24 h測(cè)定重量損失以監(jiān)測(cè)發(fā)酵，發(fā)酵液24 h內(nèi)失重<0.2 g視為發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵結(jié)束后過濾并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行理化指標(biāo)和GC-MS分析。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)平行。

1.4.2 常溫室壓等離子體誘變

ARTP誘變條件參考田甜甜[6]離子體誘變方法。

1.4.3 高通量篩選

(1)初篩：利用自動(dòng)挑菌儀挑取平板上長出的單菌落，接入裝有100 μL YPD培養(yǎng)基的96孔板中，220 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)2 d，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600。將未接種的培養(yǎng)基用作對(duì)照，選取OD600較出發(fā)菌株明顯提高的正向突變株，甘油管保藏，并進(jìn)行復(fù)篩。

(2)復(fù)篩：為了驗(yàn)證突變菌株的發(fā)酵性能，將出發(fā)菌株和初篩的突變菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。將上述菌株分別接入含糖量200 g/L的枸杞汁中，20 ℃條件下發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，使用GC-MS測(cè)定揮發(fā)性成分，篩選出具有良好風(fēng)味的突變菌株。

1.4.4 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵條件同1.4.1.4。通過測(cè)定CO2失重來檢測(cè)發(fā)酵過程，并對(duì)獲得的枸杞酒進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定和感官評(píng)價(jià)。

1.4.5 正向突變菌株遺傳穩(wěn)定性

將誘變后的菌株進(jìn)行枸杞酒的發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，離心(10 000 r/min，3 min)收集釀酒酵母菌株于YPD中，220 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)2 d，進(jìn)行下一次的枸杞酒發(fā)酵。連續(xù)傳代培養(yǎng)7次，發(fā)酵結(jié)束后通過測(cè)定枸杞酒的主要風(fēng)味化合物的含量來確定菌株是否具有遺傳穩(wěn)定性。

1.4.6 枸杞酒理化指標(biāo)分析

pH、總糖、總酸、酒精度根據(jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中描述的方法確定。

1.4.7 風(fēng)味物質(zhì)的分析

通過固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法(solid phase microextraction-GC-MS，SPME-GC-MS)測(cè)定枸杞酒中揮發(fā)性化合物，GC-MS條件參照李凱等[10]的方法。未知化合物的定性通過與NIST 05質(zhì)譜庫中標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對(duì)確定，化合物的定量通過在體積分?jǐn)?shù)10%的乙醇溶液中配制待測(cè)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定果酒中揮發(fā)性化合物的濃度[3]。OAV計(jì)算為在果酒中測(cè)得的某種物質(zhì)濃度與其在葡萄酒中氣味閾值之間的比率[11-12]。

1.4.8 感官評(píng)價(jià)

由10名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的小組成員組成感官品評(píng)小組，對(duì)枸杞酒的色澤、香氣、口感和狀態(tài)4個(gè)方面進(jìn)行打分，品評(píng)細(xì)則參考劇檸等[13]。

1.4.9 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平行實(shí)驗(yàn)后含量的均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用Origin 2020b和IBM SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行繪圖和顯著性分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞酒釀酒酵母的初步篩選

2.1.1 釀酒酵母的分離及鑒定

從寧杞5號(hào)自然發(fā)酵液中分離出201株菌株，經(jīng)過18S rDNA鑒定，其中釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)115株。115株釀酒酵母編號(hào)為M-1～M-115，并進(jìn)行下一步的篩選。

2.1.2 釀酒酵母的一級(jí)篩選

TTC顯色劑能夠被活細(xì)胞中的脫氫酶還原，形成從無色到紅色的呈色反應(yīng)，肉眼能直觀地觀察到細(xì)胞的呈色狀態(tài)[14]。釀酒酵母發(fā)酵過程是將葡萄糖經(jīng)過糖醇解途徑生成丙酮酸，再經(jīng)過丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶的作用生成乙醇。因此可利用TTC顯色原理對(duì)酵母菌株的產(chǎn)酒精能力進(jìn)行篩選[9]。菌落顏色越深，表明菌株產(chǎn)酒精能力越強(qiáng)；呈淺紅色或無色，表明產(chǎn)酒精能力較弱或不產(chǎn)酒精[15]。其中20株顏色呈深紅色，8株呈粉紅色，對(duì)此28株菌株進(jìn)行下一步的篩選。

2.1.3 釀酒酵母的二級(jí)篩選

酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)生CO2氣體，杜氏管中產(chǎn)生氣泡的體積和時(shí)間可直接反映菌株發(fā)酵的起發(fā)酵能力和起酵速度。二級(jí)篩選結(jié)果顯示：在12 h內(nèi)氣體充滿杜氏小管的菌株有11株，在24 h內(nèi)氣體充滿杜氏小管的菌株有7株，在36 h內(nèi)氣體充滿杜氏小管的菌株有5株，在48 h內(nèi)氣體充滿杜氏小管的菌株有3株，48 h后氣體仍未充滿杜氏小管的菌株視為無發(fā)酵能力。選擇12 h內(nèi)氣體充滿杜氏小管的11株菌株進(jìn)行下一步的篩選實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 釀酒酵母的三級(jí)篩選

將篩選的11株釀酒酵母和4株商業(yè)釀酒酵母分別進(jìn)行枸杞酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，根據(jù)理化指標(biāo)及感官評(píng)價(jià)進(jìn)行初步篩選，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，15株釀酒酵母產(chǎn)酒精能力基本相同，但是對(duì)枸杞酒的品質(zhì)影響顯著，其中M-23發(fā)酵的枸杞酒酒體醇厚，酯香明顯，酒體協(xié)調(diào)，且感官評(píng)價(jià)有最高得分。相較于其他14株菌株，M-23較適宜作為枸杞酒的釀造菌株，但菌株M-23發(fā)酵的枸杞酒香氣物質(zhì)提高較少，因此本文以該菌株作為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步選育。

表1 不同菌株發(fā)酵枸杞酒的理化指標(biāo)及感官評(píng)價(jià)

2.2 ARTP篩選具有良好產(chǎn)香性能的菌株

誘變時(shí)間是ARTP誘變的重要參數(shù)，對(duì)獲得最佳突變菌株具有重要意義[16]。現(xiàn)代育種理論表明，誘變致死率≥95%時(shí)，正向突變率最高，可獲得最佳突變體[17]。圖1為不同誘變時(shí)間處理下釀酒酵母M-23的致死率，表明在誘變時(shí)間為35 s時(shí)，M-23的致死率達(dá)到99.02%；當(dāng)誘變時(shí)間延長至40 s時(shí)，致死率幾乎達(dá)到100%，因此確定35、40、45和50 s為ARTP誘變的最佳處理時(shí)間。然而，在誘變過程中，進(jìn)行1次誘變處理獲得的非致死突變菌株中所需表型的菌株的比例很小，所以需進(jìn)行重復(fù)誘變直至獲得目的菌株[6]。

圖1 不同處理時(shí)間下M-23致死率

將35、40、45、50 s處理時(shí)間下獲得的852個(gè)菌株接入裝有200 μL YPD液體培養(yǎng)基的96孔板中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)48 h后測(cè)定其OD600，M-23作為對(duì)照。挑選OD600明顯高于M-23的菌株進(jìn)行枸杞酒釀造，測(cè)定其發(fā)酵特性和風(fēng)味物質(zhì)的含量，篩選出與對(duì)照組在的風(fēng)味物質(zhì)含量上具有顯著差異的菌株，并重復(fù)驗(yàn)證，部分結(jié)果如表2和表3所示。4株菌株發(fā)酵枸杞酒的理化指標(biāo)無明顯差異。在主要風(fēng)味物質(zhì)方面M-23-7-14的風(fēng)味物質(zhì)總含量明顯高于其他菌株。例如，M-23-7-14枸杞酒中β-紫羅蘭酮、苯乙醇、乙酸苯乙酯、辛酸和正己酸的含量分別是M-23的1.5、1.8、1.8、2.5和2.5倍。乙酸苯乙酯、苯乙醇和β-紫羅蘭酮具有典型的花香味，辛酸和正己酸具有奶酪味，分別對(duì)枸杞的香氣具有一定的貢獻(xiàn)?？傊?，與M-23相比，誘變菌株M-23-7-14菌株釀造的枸杞酒中風(fēng)味物質(zhì)的含量提高了37.0%。因此，菌株M-23-7-14作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的目的菌株。

表2 ARTP誘變后枸杞酒的理化指標(biāo)

表3 ARTP誘變后枸杞酒主要風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量 單位：μg/L

2.3 釀酒酵母 M-23-7-14的遺傳穩(wěn)定性分析

由于酵母存在自我修復(fù)機(jī)制，只有具有穩(wěn)定遺傳特性的菌株才能用于工業(yè)生產(chǎn)[18]，因此需要對(duì)菌株M-23-7-14進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析。對(duì)M-23-7-14進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并對(duì)發(fā)酵枸杞酒的主要風(fēng)味化合物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。在7代傳代培養(yǎng)中，菌株M-23-7-14發(fā)酵的枸杞酒的風(fēng)味物質(zhì)含量均保持相對(duì)穩(wěn)定水平，說明菌株M-23-7-14具有較好的遺傳穩(wěn)定性，可用于枸杞酒的釀造。

圖2 M-23-7-14遺傳穩(wěn)定性的驗(yàn)證

2.4 枸杞酒揮發(fā)性化合物含量分析

2.4.1 揮發(fā)性化合物半定量分析

風(fēng)味作為果酒的一個(gè)產(chǎn)品屬性，是評(píng)價(jià)其品質(zhì)的重要指標(biāo)，而風(fēng)味物質(zhì)的種類、含量、感官閾值及其相互作用，是構(gòu)成果酒香氣的重要因素，決定了果酒的風(fēng)味特征和典型特征[6]。目前，最普遍的分析方法是GC-MS和感官評(píng)價(jià)法[19]。主要的揮發(fā)性化合物對(duì)枸杞酒的品質(zhì)發(fā)揮著重要作用，利用GC-MS對(duì)枸杞酒中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行檢測(cè)(數(shù)據(jù)未顯示)。在2種市售枸杞酒(健康快車、金色傳杞)和2種自釀枸杞酒中共檢測(cè)出84種揮發(fā)性化合物，其中醇類物質(zhì)13種，酯類化合物38種，酸類化合物7種，醛/酮類化合物15種，芳香烴類化合物2種，其他類化合物6種。不同枸杞酒中揮發(fā)性化合物種類存在一定的差異，市售健康快車枸杞酒中檢測(cè)出的揮發(fā)性化合物種類最少，有37種，M-23-7-14菌株發(fā)酵枸杞酒中檢測(cè)出的化合物種類最多有53種，M-23菌株發(fā)酵枸杞酒和市售金色傳杞枸杞酒分別檢測(cè)出49和39種揮發(fā)性化合物。相較于菌株M-23，菌株M-23-7-14釀造的枸杞酒中癸酸和辛酸分別是M-23釀造枸杞酒的16.4和11.6倍，癸酸和辛酸具有黃油奶酪味，對(duì)枸杞酒的香氣具有積極作用[20]。值得一提的是，β-紫羅蘭酮是枸杞酒具有代表性的水果香氣物質(zhì)，該物質(zhì)閾值極低，對(duì)果酒的香氣品質(zhì)影響極為明顯[21]。在2種市售的枸杞酒中未檢測(cè)到β-紫羅蘭酮的存在，且菌株M-23-7-14釀造枸杞酒中該物質(zhì)的含量是M-23的2倍。為了進(jìn)一步探究枸杞酒中風(fēng)味物質(zhì)對(duì)枸杞酒香氣的影響，選取4種枸杞酒中相對(duì)濃度較高及閾值較低的物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

2.4.2 枸杞酒揮發(fā)性化合物的OAV分析

揮發(fā)性化合物的半定量分析可以測(cè)定枸杞酒中揮發(fā)性化合物的種類以及說明不同枸杞酒中揮發(fā)性化合物含量上的差異，但揮發(fā)性化合物在果酒中的實(shí)際含量和閾值對(duì)果酒的影響較大[3]。因此在揮發(fā)性化合物半定量的基礎(chǔ)上進(jìn)行定量分析，可以更好地反應(yīng)枸杞中揮發(fā)性化合物的含量。選取半定量分析中相對(duì)濃度較高及閾值較低的21種揮發(fā)性化合物進(jìn)行了定量測(cè)定，并對(duì)其進(jìn)行OAV分析。結(jié)果如表4所示。

揮發(fā)性化合物對(duì)枸杞酒香氣的貢獻(xiàn)主要取決于該化合物在介質(zhì)中的閾值，OAV>1的化合物說明其含量高于閾值，其于樣品整體香氣的呈現(xiàn)具有貢獻(xiàn)作用，并且OAV值越大作用越顯著[22]。由表4所示，在2種市售枸杞酒(健康快車和金色傳杞)中OAV>1的特征香氣成分均為7種，與2種市售枸杞酒相比，自釀枸杞酒增加了2種OAV>1的物質(zhì)(肉桂酸乙酯和β-紫羅蘭酮)，對(duì)增加枸杞酒的花香具有一定的貢獻(xiàn)。自釀枸杞酒中OAV最大的是乙酸異戊酯(10.5)，其次是異戊醇(8.3)、丙醇(6.6)、β-紫羅蘭酮(4.7)和肉桂酸乙酯(3.7)，對(duì)枸杞酒的果香、花香及紫羅蘭等香氣輪廓的形成起決定性作用。健康快車枸杞酒中OAV最大的是丙醇(5.8)，其次是乙酸乙酯(5.6)、乙酸異戊酯(4.4)、異戊醇(4.0)和丁酸乙酯(2.9)。對(duì)健康快車枸杞酒中清新口味、果香、花香以及威士忌等香氣輪廓的形成起決定性作用。金色傳杞枸杞酒中，OAV最大的是異戊醇(5.5)和丙醇(5.5)，其次是己酸乙酯(4.8)、丁酸乙酯(3.6)和乙酸異戊酯(3.4)，對(duì)金色傳杞的清新醇味、威士忌香以及水果香輪廓的形成起著決定性作用。整體來說，自釀枸杞酒中主要風(fēng)味化合物的種類和含量均高于2種市售枸杞酒。

表4 枸杞酒香氣成分的OAV分析

3 結(jié)論

本研究基于菌種發(fā)酵性能實(shí)驗(yàn)及感官品評(píng)分析，初步獲得1株生長及發(fā)酵性能良好的菌株M-23，菌株M-23發(fā)酵的枸杞酒，酒體醇厚、酯香明顯、酒體協(xié)調(diào)。以菌株M-23為出發(fā)菌株，通過ARTP和HTS進(jìn)一步對(duì)枸杞酒優(yōu)良釀酒酵母進(jìn)行選育，得到1株優(yōu)良菌株M-23-7-14。對(duì)不同菌株發(fā)酵的枸杞酒進(jìn)行定性分析，結(jié)果表明M-23-7-14發(fā)酵枸杞酒的風(fēng)味化合物的含量較出發(fā)菌株M-23提高了37.0%。本文首次對(duì)發(fā)酵枸杞酒中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量研究，并結(jié)合OAV分析，明確了影響枸杞酒風(fēng)味的9種揮發(fā)性化合物，分別是乙酸異戊酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、肉桂酸乙酯、丙醇、異戊醇、苯乙醇、β-紫羅蘭酮。本研究提供了一種系統(tǒng)選育枸杞酒釀酒酵母的方法，基于該方法篩選得到的M-23-7-14菌株釀造的枸杞酒風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量均高于2種市售枸杞酒，且較出發(fā)菌株M-23風(fēng)味物質(zhì)含量提高了37.0%，對(duì)提高枸杞酒的香氣具有重要的參考價(jià)值。