表面活性劑脅迫下的高透明型黃原膠的發(fā)酵生產(chǎn)及其流變性能研究

李茂瑋，朱莉，吳傳超，李敏，詹曉北*

1(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(無錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇 無錫，214125)

黃原膠(xanthan gum，XG)又名漢生膠、黃胞膠，是由美國農(nóng)業(yè)部北方研究所在20世紀(jì)50年代初，發(fā)現(xiàn)并分離得到的一種酸性多糖[1]。目前，它主要是通過野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)，以玉米淀粉、蔗糖等碳水化合物為主要原料，經(jīng)過好氧深層發(fā)酵得到[2]。1969年，美國食品和藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)黃原膠可以作為食品添加劑使用[3]；1980年，F(xiàn)DA將黃原膠列為安全產(chǎn)品。如今，中國是世界上最大的黃原膠生產(chǎn)國，高品質(zhì)和多規(guī)格是其發(fā)展方向。

黃原膠的基本結(jié)構(gòu)為3種單糖組成的重復(fù)單元，分別為葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛，其比例為2∶2∶1[4]。由于獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，其具有良好的增稠性、懸浮性和乳化穩(wěn)定性[5]，成為一種具有巨大商業(yè)收益及潛在價(jià)值的多功能微生物多糖，被廣泛應(yīng)用于食品、工業(yè)和醫(yī)藥等行業(yè)[6]。所以提高黃原膠產(chǎn)量，如利用表面活性劑等方法以提高其質(zhì)量一直是研究熱點(diǎn)。表面活性劑是一種同時(shí)具有親水性和親油性的聚合物，能夠降低表面和界面張力[7]，獨(dú)特結(jié)構(gòu)使其溶于水后，極少的量就可以顯著的改變界面性質(zhì)，從而產(chǎn)生一系列的應(yīng)用功能[8]。表面活性劑之所以能夠提高多糖產(chǎn)量，主要是由于其能夠通過提高細(xì)胞膜通透性，增加糖基轉(zhuǎn)移酶活力、促進(jìn)脂質(zhì)代謝和溶解脂質(zhì)分子，從而促進(jìn)細(xì)胞分泌胞外多糖[9-11]。除此之外，表面活性劑還可以提高氧轉(zhuǎn)移，從而改善黃原膠的生產(chǎn)和流變特性，如黏度。據(jù)報(bào)道，表面活性劑能夠提高β-葡聚糖類型的胞外多糖產(chǎn)量，例如普魯蘭多糖[12]和結(jié)冷膠[13]等。目前關(guān)于表面活性劑對于影響多糖發(fā)酵的細(xì)胞膜通透性、代謝狀態(tài)以及結(jié)構(gòu)等方面的具體機(jī)制尚不明確。因此利用表面活性劑來提高細(xì)胞膜通透性、改善脂質(zhì)代謝和提高酶的釋放，從而達(dá)到提高黃原膠產(chǎn)量的目的是具有潛力的可行性方法[14]。

本研究以X.campestrisTX53為出發(fā)菌株，使用甘油為唯一底物，在高濃度表面活性劑脅迫下進(jìn)行耐受性馴化，得到具有高耐吐溫-80和曲拉通X-100能力的突變株，并對其發(fā)酵生產(chǎn)的新型黃原膠的結(jié)構(gòu)、及其所引起的流變特性的改變進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

野油菜黃單胞菌X.campestrisCCTCC M2015714、野油菜黃單胞菌X.campestrisTX53(由表面活性劑脅迫下馴化篩選獲得)，均保藏于糖生物制造與生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(g/L)：甘油100.0，魚粉蛋白胨5.0，牛肉浸膏3.0，酵母浸膏1.0，瓊脂20.0，pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基(g/L)：甘油100.0，魚粉蛋白胨5.0，牛肉浸膏3.0，酵母浸膏1.0，pH 7.0～7.2。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：甘油 80.0，魚粉蛋白胨 3.0，酵母浸膏 1.5，NaNO30.8，MgSO4·7H2O 2.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，K2HPO4·3H2O 3.5，KH2PO42.0，pH 7.0～7.2。

基礎(chǔ)馴化培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基。馴化過程中培養(yǎng)基中吐溫-80的質(zhì)量濃度以5 g/L為梯度依次增加至50 g/L, 曲拉通X-100質(zhì)量濃度此基礎(chǔ)上以5 g/L為梯度增加至30 g/L，其他成分不變。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

甘油、魚粉蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、NaOH、HCl、NaNO3、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、無水乙醇、C2HF3O2、CH4O、CHCl3、C4H10O、吐溫-80、Triton X-100等試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Sigma 3K15離心機(jī)，德國Sigma公司；TU-1810 紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Quanta200掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)，美國FEI公司；Brookfield DV-Ⅱ型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)，美國 Brookfield 公司；Scientz-10 N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 表面活性劑脅迫下野油菜黃單胞菌適應(yīng)性馴化選育過程

將X.campestrisCCTCC M2015714種子培養(yǎng)至生長中期，取5 mL接入含有5 g/L吐溫-80的50 mL種子培養(yǎng)液中，連續(xù)傳代10次。取1 mL種子稀釋液涂布至相同固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)。挑取大且飽滿、色澤鮮亮的菌落。后續(xù)培養(yǎng)液中吐溫-80以5 g/L 的增量直至50 g/L進(jìn)行馴化篩選。將上述菌種按照相同方法進(jìn)行曲拉通X-100脅迫下的耐受性馴化，質(zhì)量濃度逐漸增加至30 g/L。

1.4.2 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將獲得的X.campestrisTX53連續(xù)傳代，于30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)120 h，測量每一代新型黃原膠的產(chǎn)量、微生物數(shù)量，驗(yàn)證X.campestrisTX53的遺傳特性。

1.4.3 多糖樣品與純化

發(fā)酵結(jié)束后稀釋發(fā)酵液，離心收集上清液，加入無水乙醇，4 ℃過夜。離心收集沉淀，氮吹去除有機(jī)試劑，純水復(fù)溶得到粗寡糖。去除殘存蛋白，重新醇沉析出多糖，氮吹復(fù)溶，冷凍干燥得到純品[15]。

1.4.4 分析測定方法

1.4.4.1 多糖含量測定

總糖含量測定采用苯酚-硫酸法[16]。酸性多糖含量測定采用間苯二酚法。

1.4.4.2 蛋白含量測定

利用紫外光譜掃描法[17]。

1.4.4.3 產(chǎn)量的測定

發(fā)酵液稀釋離心后得到上清液中加入無水乙醇析出黃原膠，于40 ℃、0.1 MPa真空干燥至恒重，測量并計(jì)算黃原膠產(chǎn)量。

1.4.5 單糖組成分析

準(zhǔn)確稱取5×10-3g新型黃原膠樣品、2 mg烘至恒重的單糖標(biāo)準(zhǔn)品(葡萄糖、巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸)，按照王子朝等[18]的方法，進(jìn)行單糖標(biāo)曲的繪制和樣品的處理。

1.4.6 紅外光譜分析(Fourier-transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)

取1 mg多糖樣品粉末與KBr充分混合，采用壓片法制樣。Nexus 470紅外光譜儀對多糖進(jìn)行掃描[19]。

1.4.7 掃描電子顯微鏡觀察

將凍干的樣品固定于金屬樣品臺上，鍍膜后用Quanta 200掃描電子顯微鏡觀察拍照，加速電壓15 kV。

1.4.8 流變學(xué)性能的測定

配制質(zhì)量濃度為 1、2.5、5、7.5、10 g/L的新型黃原膠和食品級黃原膠溶液，采用 Brookfield DV-Ⅱ 型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)于 25 ℃、3號轉(zhuǎn)子、6 r/min下分別測定不同膠濃度下黏度變化，以及測量不同剪切速率的新型黃原膠和食品級黃原膠溶液黏度變化；4、25、50、80、100 ℃下2種溶液黏度變化情況；溶液加熱至100 ℃ 30、60、90、120、150、180 min并恢復(fù)至室溫，測定其黏度變化；在pH分別為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0時(shí)測定2種溶液的黏度變化；在2種溶液中，分別加入不同量的NaCl、MgSO4、KCl和CaCl2，保證4種鹽的終質(zhì)量濃度均為1、2.5、5、7.5、10 g/L，測定其黏度變化。

1.4.9 透明度

配制10 g/L黃原膠溶液，離心30 min去除攪拌溶解過程中裹入的氣泡。于600 nm處測量各溶液吸光度，以純水溶液做空白對照。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均具有3次平行,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式體現(xiàn)。采用Origin 9.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面活性劑脅迫下野油菜黃單胞菌馴化篩選

通過多次不間斷轉(zhuǎn)接，最終耐受性達(dá)到了吐溫-80 50 g/L、曲拉通X-100 30 g/L，后通過平板篩選，馴化得到1株可耐受吐溫-80 50 g/L、曲拉通X-100 30 g/L-的野油菜黃單胞菌X.campestrisTX53，并且活性較好、突變性能穩(wěn)定。此后的馴化菌特性研究都是采用此突變株為研究對象。

從圖1可以看出，馴化株X.campestrisTX53生長在50 g/L吐溫-80，30 g/L曲拉通X-100的培養(yǎng)基上時(shí)，其他條件相同，其形成的菌落明顯小于原始菌，生長曲線基本一致，但是生長略滯后于原始菌。根據(jù)研究表明，這是由于不同表面活性劑對于菌體毒性不一，能夠不同程度的抑制細(xì)菌的生長，與對照組相比，所有表面活性劑在添加后都會使得細(xì)菌細(xì)胞減小，其中曲拉通X-100影響最大，導(dǎo)致細(xì)菌的大小發(fā)生了明顯變化，并且細(xì)胞形態(tài)由桿狀向圓形轉(zhuǎn)變[14]。

a-原始菌種X.campestris CCTCC M2015714未添加表面活性劑的培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)；b-馴化菌種X.campestris TX53在添加表面活性劑的培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)；c-原始菌種與馴化菌種的生長曲線

2.2 產(chǎn)量的測定

如圖2-a所示，X.campestrisTX53在未添加和添加表面活性劑情況下的黃原膠產(chǎn)量均高于X.campestrisCCTCC M2015714，產(chǎn)量最高為9.3 g/L，較之前提升了25%～30%。這與兩者發(fā)酵120 h總糖含量變化的結(jié)果一致 (圖2-b)。總糖的測定采用苯酚-硫酸法，而發(fā)酵液中成分極其復(fù)雜，無法精確測定其中某個(gè)特定多糖的含量，黃原膠是一種酸性多糖，采用間苯二酚法對其中酸性多糖進(jìn)行測定，其結(jié)果更為精確，并消除了中性多糖的影響。

圖2 原始菌與馴化菌未添加和添加表面活性劑發(fā)酵黃原膠產(chǎn)量

2.3 產(chǎn)物組成及結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 紫外光譜分析

使用紫外光譜對2種黃原膠溶液在200～300 nm 進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖3-a所示。結(jié)果顯示，樣品在200 nm處附近出現(xiàn)最大的紫外吸收峰，這也是碳水化合物對紫外可見光的吸收特性，進(jìn)一步證明發(fā)酵產(chǎn)物是多糖。此外，在其他波長處無紫外吸收[20]，說明純化樣品中幾乎不含核酸和蛋白質(zhì)，對后續(xù)實(shí)驗(yàn)不造成影響。

2.3.2 單糖組成分析

在黃原膠的合成過程中，特定的酶和前體物質(zhì)的缺失可能會導(dǎo)致其有關(guān)性質(zhì)的改變[21-22]。對比圖3-b單糖標(biāo)準(zhǔn)品出峰結(jié)果，在表面活性劑脅迫下馴化菌種發(fā)酵得到新型多糖，只由葡萄糖、甘露糖和葡萄醛酸組成，其摩爾比為2.0∶1.71∶1，與普通食品級黃原膠單糖組成相同，摩爾比例為2.0∶1.84∶1。由此可見，新型多糖的單糖組成和摩爾比與食品級黃原膠基本一致。

2.3.3 紅外光譜分析

1-阿拉伯糖;2-半乳糖;3-葡萄糖;4-木糖;5-甘露糖;6-半乳糖醛酸;7-葡萄糖醛酸

綜合新型黃原膠的紅外圖譜和單糖組成，與普通食品級黃原膠一致，進(jìn)一步表明該多糖是黃原膠。

2.3.4 分子質(zhì)量的測定

由表1可知，原始菌在不添加表面活性劑時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)黃原膠的分子質(zhì)量為6.7×106Da，添加適量表面活性劑后，原始菌種產(chǎn)黃原膠的分子質(zhì)量為1.4×107Da，而食品黃原膠的分子質(zhì)量為2.0×107Da。馴化菌種產(chǎn)黃原膠的分子質(zhì)量為1.2×107Da，略低于原始菌種。這與報(bào)道[14]一致，在所有情況下，從含有不同表面活性劑的發(fā)酵液中，提取純化得到的黃原膠的分子質(zhì)量都高于對照組。

表1 不同黃原膠分子質(zhì)量

聚合物分散性指數(shù)(polymer dispersity index，PDI)，常用于描述聚合物分子質(zhì)量分布。黃原膠作為一種大分子的微生物多糖，可通過PDI=Mw/Mn(Mw為重均分子質(zhì)量，Mn為數(shù)均分子質(zhì)量)，計(jì)算其分散性指數(shù)。經(jīng)過聚合物散性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，表面活性劑的加入，有效降低了黃原膠分子質(zhì)量的離散程度，使得到的黃原膠的質(zhì)量得以提升。

2.3.5 掃描電子顯微鏡

在本研究中，利用掃描電鏡對食品黃原膠與新型黃原膠的微觀形態(tài)進(jìn)行研究。圖4-a中食品黃原膠的微觀結(jié)構(gòu)更致密，表面更光滑，沒有孔洞的出現(xiàn)。而圖4-b中新型黃原膠的微觀表面結(jié)構(gòu)更為粗糙，出現(xiàn)大量分布不均勻的多孔狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)由原始的片狀轉(zhuǎn)變?yōu)榻z狀。這表明表面活性劑具有破壞黃原膠膠體結(jié)構(gòu)的能力，可使其產(chǎn)生缺陷、鏈接鍵斷裂，進(jìn)而造成凝膠網(wǎng)絡(luò)弱化、絲狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的現(xiàn)象，達(dá)到了黏度降低的效果。這一結(jié)果與彭曼曼等[23]報(bào)道的，由于多糖表面結(jié)構(gòu)的斷裂，導(dǎo)致溶膠黏度降低的結(jié)果一致。

a-食品級黃原膠；b-新型黃原膠

2.4 流變性能分析

2.4.1 不同膠濃度對溶液黏度的影響

由圖5-a可知2種黃原膠溶液的膠濃度與黏度呈正相關(guān)，即使新型黃原膠質(zhì)量濃度達(dá)到10 g/L，其黏度才達(dá)到2 700 cp左右，遠(yuǎn)低于同等條件下的食品級黃原膠。

2.4.2 pH對溶液黏度的影響

在pH低于3.0或高于9.0時(shí)，黃原膠的側(cè)鏈基團(tuán)會發(fā)生降解，但是其黏度基本穩(wěn)定不變。從圖5-b可以看出，這種新型黃原膠與普通食品級黃原膠性質(zhì)一樣，在1～13的pH值范圍內(nèi)具有相當(dāng)穩(wěn)定的黏度，這說明其對酸堿具有非常良好的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他學(xué)者的論述觀點(diǎn)保持一致。

2.4.3 100 ℃加熱不同時(shí)間對溶液黏度的影響

由圖5-c和圖5-d可知，加熱不同時(shí)間及恢復(fù)室溫后，2種黃原膠溶液的黏度無顯著變化，表明了新型黃原膠與食品級黃原膠同樣具有良好耐熱性，且在溫度冷卻至室溫后，黏度可快速恢復(fù)。這一結(jié)果也與文獻(xiàn)報(bào)道黃原膠所具有的特性一致。

a-膠濃度對黃原膠溶液黏度的影響；b-pH對膠溶液黏度的影響；c-100 ℃加熱不同時(shí)間對膠溶液黏度的影響；d-恢復(fù)至室溫后對溶液膠濃度的影響

2.4.4 鹽對溶液黏度的影響

從圖6可以看出，食品級黃原膠溶液在加入不同種類的鹽之后，表現(xiàn)出良好的鹽耐受性，其溶液黏度幾乎不受鹽濃度影響。而新型黃原膠則表現(xiàn)出特殊的流變學(xué)特性，根據(jù)CLARKE-STURMAN等[24]的報(bào)道，當(dāng)鹽離子質(zhì)量濃度在1～10 g/L時(shí)，溶液黏度呈現(xiàn)上升趨勢，這是由于分子鏈間的非共價(jià)鍵導(dǎo)致的棒狀排列的分子結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了相互纏繞，這與食品級黃原膠的結(jié)果不一致。

圖6 鹽對膠溶液黏度的影響

2.4.5 剪切速率對溶液黏度的影響

由圖7可知，2種黃原膠溶液黏度均與剪切速率呈負(fù)相關(guān)，說明在表面活性劑脅迫下發(fā)酵生產(chǎn)的新型黃原膠仍具有假塑性特性。

2.4.6 透明性

黃原膠溶液透明度是衡量其表觀性能的重要指標(biāo)之一，與外觀和用途密切相關(guān)。多糖的結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量大小、溶解性和來源等多種因素都會影響其溶液透明度[25]。新型黃原膠透光率最高可達(dá)90%以上，遠(yuǎn)高于食品級黃原膠。圖7-c中可以明顯看到新型黃原膠溶液清澈透明透明性明顯高于食品級黃原膠。新型黃原膠的高透明性可以在牙膏、飲料、醬油和化妝品等產(chǎn)品加工過程形成更好的色澤，提高產(chǎn)品接受度。

a-剪切速率對食品級黃原膠膠溶液黏度的影響；b-剪切速率對新型黃原膠膠溶液黏度的影響；c-食品級黃原膠和新型黃原膠透明性對比圖；d-膠濃度對透明性的影響

3 結(jié)論

本研究在表面活性劑脅迫下，以甘油為唯一底物發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠，采取梯形馴化的方法，結(jié)合搖瓶復(fù)篩，獲得了1株能夠耐受50 g/L吐溫-80和30 g/L曲拉通X-100的野油菜黃單胞菌優(yōu)良菌株X.campestrisTX53，該菌株在12 g/L表面活性劑質(zhì)量濃度下發(fā)酵120 h，可穩(wěn)定生產(chǎn)分子質(zhì)量在1.2×107～2.0×107Da 的新型黃原膠。經(jīng)過結(jié)構(gòu)鑒定，新型黃原膠與原始黃原膠的結(jié)構(gòu)一致，但兩者的微觀表面存在顯著差異，食品級黃原膠空間排列整齊緊湊，新型黃原膠空間結(jié)構(gòu)雜亂且疏松，呈現(xiàn)不連續(xù)、粗糙的多孔結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了兩者之間流變性能的差異。研究結(jié)果表明，新型黃原膠仍為剪切變稀流體，即假塑性流體，其溶液的黏度與剪切速率負(fù)相關(guān)，說明這種新型黃原膠在原料加工和泵送過程中可以通過增大流速而減小阻力。

研究結(jié)果顯示，通過添加表面活性劑來獲得新型多糖具有可行性。該新型黃原膠呈現(xiàn)出的高透明度與流變性能，體現(xiàn)出了其作為功能性多糖的多應(yīng)用性。此外還需進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基組成、探索代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，以提高新型黃原膠的產(chǎn)量并探究新型黃原膠的潛在功能性。若作為食品添加劑，在同等條件下高透明低黏度的新型黃原膠可以提高在飲料、膳食纖維等產(chǎn)品中的添加量，進(jìn)一步確定新型黃原膠作為新型膳食纖維、食品添加劑或抗氧化補(bǔ)充劑的適用性，真正推廣到食品中還需進(jìn)行更多探索與驗(yàn)證。