超高壓-溫度聯(lián)合殺菌工藝對藍靛果忍冬脫苦果汁品質(zhì)及風味的影響

蔡朋舉，丁寧，史君彥，郝靜怡，鄭璐婕，胡欣，朱詩語，孫愛東*

1(北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院，北京，100083)2(林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京，100083)

藍靛果忍冬(Loniceracaerulea)又名藍靛果、黑瞎子果等，屬于忍冬科忍冬屬落葉灌木，具有較強抗寒能力和抗病性，原產(chǎn)于俄羅斯東北部、日本北海道、中國東北等地區(qū)。藍靛果忍冬果實富含礦物質(zhì)、維生素、氨基酸等營養(yǎng)成分和花色苷、類黃酮等活性物質(zhì)，是一種兼?zhèn)錉I養(yǎng)價值與醫(yī)療保健價值的新興漿果[1-3]。藍靛果忍冬果實具有種小皮薄、出汁率高、顏色飽和度極高等特性，是制作果汁的良好原料，但因其果實具有調(diào)配無法掩蓋的苦味[4]，且傳統(tǒng)熱殺菌技術會破壞果汁的營養(yǎng)成分、風味等[5]，以致目前市場上尚未出現(xiàn)風味可被消費者接受的藍靛果忍冬果汁產(chǎn)品。因此，為進一步開發(fā)利用藍靛果資源，需在加工過程中加入脫苦環(huán)節(jié)以改善不良口感，選擇適宜的殺菌技術，才能更好地保留果汁中的營養(yǎng)物質(zhì)，改善風味。

目前，用于果汁苦味物質(zhì)的脫除方法主要有吸附法、β環(huán)糊精包埋法、酶解法等，但這些方法還具有明顯的缺點。例如，β環(huán)糊精包埋法只能去除果汁中部分特定成分的苦味，酶解法因其需要溫和的條件而限制了在工業(yè)化上的應用[6]?；钚蕴渴且环N極佳的吸附劑，具有孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)達、比表面積大、表面官能團種類繁多、性能穩(wěn)定、可再生等吸附優(yōu)勢，常應用于食品脫色、脫味[7]。超高壓殺菌技術(ultra-high pressure processing，UHP)是指在常溫條件下，將食品置于100～1 000 MPa的超高壓設備中從而實現(xiàn)滅酶、殺菌的目的。與熱殺菌相比，UHP極大地避免了熱處理帶來的營養(yǎng)成分損失和理化性質(zhì)的不利變化[5]。但是單一超高壓殺菌所需壓力較高，對設備要求嚴格，使其殺菌成本過高，難以在食品工業(yè)中普遍推廣。因此超高壓聯(lián)合溫度殺菌(溫-壓聯(lián)合)技術是一種有效手段，達到良好殺菌效果的同時更好的保留食品中的營養(yǎng)物質(zhì)[8]。鑒于此，本試驗首次對藍靛果忍冬果汁進行脫苦研究，使用HPLC-MS/MS定性和定量分析藍靛果忍冬果汁中的苦味物質(zhì)，以活性炭為脫苦劑進行吸附脫苦，并探究溫-壓聯(lián)合技術對藍靛果忍冬果汁殺菌效果及貯藏期穩(wěn)定性的影響，為藍靛果忍冬的開發(fā)與利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍靛果忍冬購自遼寧省丹東市，于-20 ℃冰箱保存。乙腈(色譜級)，賽默飛世爾有限公司；甲酸、沒食子酸、福林酚、氯化鉀、無水碳酸鈉(均為分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；活性炭(食品級)，平頂山綠林活性炭有限公司；醋酸鈉(分析純)，西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent6530-1290液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀、XDB-C18色譜柱，安捷倫公司；JYL-C010打漿機，九陽股份有限公司；L3660D低速離心機，上海知信實驗儀器有限公司；TS-100B搖床，天呈儀器有限責任公司；ATC手持折光儀，上海勃基儀器儀表有限公司；UV-6100分光光度計，上海元析儀器有限公司；PHSJ-3F pH計，上海精科儀器公司；SC-80全自動色差計，北京儀康光光學儀器有限公司；Asrree Ⅱ/LS16電子舌，法國Alpha MOS公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 果汁樣品制備

藍靛果忍冬于室溫下解凍，然后按照果實與水質(zhì)量比1∶7放置于榨汁機內(nèi)，打漿30 s，6層紗布過濾果渣，4 000 r/min離心10 min，上清液即為藍靛果忍冬果汁。

1.3.2 苦味物質(zhì)分析及果汁脫苦

1.3.2.1 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)；流動相：溶劑A為0.1%甲酸溶液，溶劑B為乙腈溶液；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；梯度洗脫程序：0～15 min 10% B，15～25 min 60% B，25～35 min 70% B；254 nm下進行檢測。

質(zhì)譜儀型號：LCMS-IT/TOF；檢測器：PDA檢測器；離子源：ESI(電噴霧離子源)；檢測模式：負離子模式；離子源溫度：300 ℃；采用全自動二級質(zhì)譜掃描100～1 200m/z。

1.3.2.2 果汁脫苦

準確量取藍靛果忍冬果汁200 mL于錐形瓶，加入6%活性炭混勻，置于搖床上進行脫苦，脫苦時間為65 min，脫苦溫度為45 ℃，然后用4層紗布過濾，4 000 r/min離心10 min除去果汁中的活性炭，獲得澄清果汁。苦味物質(zhì)含量用脫苦前后液相色譜中苦味物質(zhì)峰面積的變化表示[9]。

1.3.3 溫-壓聯(lián)合處理殺菌工藝篩選

根據(jù)前期預實驗的結(jié)果，經(jīng)感官評價，得到藍靛果忍冬果汁配方為藍靛果忍冬添加量6.67%，蔗糖添加量14%，檸檬酸添加量0.1%，三氯蔗糖添加量0.04%(均為質(zhì)量分數(shù))。將果汁裝入無菌采樣袋內(nèi)，然后置于超高壓設備中，根據(jù)前期預試驗結(jié)果，將壓力設置為200、300、400 MPa，處理時間3 min，經(jīng)超高壓處理后分別于40、50、60 ℃下各加熱2、5、8 min，迅速冷卻至室溫，測定其殺菌效果。以致死率表示殺菌效果[9]，確定所有可行的溫-壓聯(lián)合殺菌條件。

1.3.4 藍靛果忍冬果汁貯藏期穩(wěn)定性測定

將經(jīng)上述所有可行殺菌條件處理的果汁于4 ℃冰箱內(nèi)貯藏35 d，每隔7 d測定貯藏期菌落總數(shù)變化，篩選出滿足安全保質(zhì)期的溫-壓聯(lián)合殺菌條件，并對其貯藏期內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)及理化特性進行檢測。菌落總數(shù)的測定參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》的方法，結(jié)果以對數(shù)記。

1.3.5 生理指標測定

花青素含量測定：采用雙波長pH示差法[10]。以矢車菊素3-O-葡萄糖苷為參照。取1 mL果汁加去離子水稀釋10倍，加入pH 1.0的KCl緩沖液3 mL；再取1 mL果汁稀釋10倍，加入pH 4.5的醋酸鈉緩沖液3 mL，均于暗處靜置反應1 h，然后用紫外-可見分光光度計分別測定510 nm和710 nm處吸光值。花青素含量的計算如公式(1)和公式(2)所示：

(1)

A=(A510-A710)pH=1.0-(A510-A710)pH=4.5

(2)

式中：X，花青素含量，g/L；A，樣品在pH 1.0和pH 4.5 緩沖液體系中測得的吸光度之差；M，矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子質(zhì)量(449.2)；ε，矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)(29 600)；F，測試溶液的稀釋倍數(shù)；L，比色皿距離(1 cm)。

總酚含量測定：采用福林酚法測定[11]。取1 mL提取液，加入1 mL 福林酚試劑、3 mL 7.5% Na2CO3溶液，用去離子水定容至10 mL，混勻后在室溫下暗反應60 min，然后用紫外分光光度計測定其在765 nm處的吸光值計算總酚含量，計算如公式(3)所示：

(3)

式中：M，樣品中的多酚含量，mg/g；C，樣品待測液中的多酚質(zhì)量濃度，μg/mL；V，樣品待測液的體積，mL；N，稀釋倍數(shù)；m，樣品質(zhì)量，g。

pH和可溶性固形物含量測定：分別使用阿貝折光儀和pH計測定果汁中可溶性固形物含量和pH值。

果汁褐變度測定：采用分光光度法測定果汁褐變度。

1.3.6 電子舌分析果汁風味變化

采用電子舌結(jié)合主成分分析檢測未經(jīng)脫苦處理的藍靛果果汁樣品(WTK)、脫苦后未經(jīng)調(diào)配的果汁樣品(WTP)、調(diào)配后未殺菌的果汁樣品(YTP)、殺菌處理后的果汁樣品(YMJ)、4 ℃貯藏35 d的果汁樣品(YZC)的風味變化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Origin 2018進行統(tǒng)計并繪圖；采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦味物質(zhì)的鑒定及脫苦效果

利用HPLC-MS/MS技術共檢測到藍靛果忍冬果汁中3種苦味物質(zhì)[12-13]，如圖1所示。第一種是馬錢苷酸(C16H24O10)，根據(jù)檢測到的一級質(zhì)核比375.131 5，確定[M-H]-為母離子，通過二級質(zhì)譜(圖1-a)分析，檢測到特征子離子對應的二級質(zhì)譜質(zhì)核比為149.060 7、167.071 2、179.057 0、193.051 7、211.061 4、241.119 7、347.334 5和373.115 5，保留時間為7.629 min。第二種是開聯(lián)番木鱉苷(C17H24O10)，根據(jù)檢測到的一級質(zhì)核比433.137 6，確定[M+HCOO]-為母離子，通過二級質(zhì)譜(圖1-b)分析檢測到特征子離子對應的二級質(zhì)核比為153.091 9、161.045 9、205.122 9、223.135 0、269.046 5、385.188 6、392.427 7、431.193 8和480.871 4，保留時間為21.431 min。第三種是馬錢苷(C17H26O10)，檢測到一級質(zhì)核比435.132 6，確定[M+HCOO]-為母離子的準分子離子，通過二級質(zhì)譜(圖1-c)分析檢測到特征子離子對應的質(zhì)核比為151.002 7、271.061 9、295.067 4、313.075 7、360.358 9和 433.120 2，保留時間為24.355 min。

a-馬錢苷酸；b-開聯(lián)番木鱉苷；c-馬錢苷

苦味物質(zhì)含量可以用高效液相色譜法測定并以峰面積表示[14]，吸附過程中，活性炭吸附劑的孔徑與吸附質(zhì)分子或離子的幾何尺寸需要有一定的匹配。本試驗檢測到的未經(jīng)脫苦的果汁中3種苦味物質(zhì)在高效液相色譜圖中總面積為5.03×105，而經(jīng)活性炭脫苦后苦味物質(zhì)總面積為3.08×105，降低了39%，可能是由于此實驗所用食品級活性炭的孔徑與苦味物質(zhì)大小吻合[7]，因此利用活性炭對藍靛果果汁產(chǎn)生良好脫苦效果。

2.2 溫-壓聯(lián)合處理對藍靛果果汁殺菌效果的影響

溫-壓聯(lián)合處理對藍靛果果汁殺菌效果的影響如圖2所示。200 MPa條件下的溫-壓聯(lián)合殺菌效果均低于2.5 lg，且優(yōu)于單獨超高壓(1.03 lg)；300 MPa聯(lián)合60 ℃ 5 min/8 min、400 MPa聯(lián)合50 ℃ 5 min/8 min、60 ℃ 2 min/5 min/8 min處理后的果汁，微生物的致死率均達到2.78 lg，此時趨近于無菌狀態(tài)，且均優(yōu)于單純的超高壓殺菌(300 MPa，1.73 lg；400 MPa，1.95 lg)和熱殺菌(1.5 lg)。這說明溫-壓聯(lián)合殺菌能夠顯著降低果汁中的微生物數(shù)量，且殺菌效果與超高壓壓力、處理時間和溫度等有關。因此，選擇300 MPa聯(lián)合60 ℃ 5 min/8 min，400 MPa聯(lián)合50 ℃ 5 min/8 min、60 ℃ 3 min/5 min/8 min以及單獨熱殺菌、超高壓組為對照進行貯藏期穩(wěn)定性檢測，進一步篩選最佳殺菌條件。

a-200 MPa；b-300 MPa；c-400 MPa

2.3 溫-壓聯(lián)合處理對藍靛果忍冬果汁貯藏期穩(wěn)定性的影響

2.3.1 溫-壓聯(lián)合處理對果汁貯藏期間菌落總數(shù)的影響

溫-壓聯(lián)合處理對藍靛果忍冬果汁貯藏期間菌落總數(shù)的影響如表1所示。4 ℃貯藏條件下，組1、組2溫-壓聯(lián)合處理組及組8、組9對照組貯藏至第21天時，菌落總數(shù)增至不可計數(shù)，>100 CFU/mL，說明300 MPa溫-壓聯(lián)合處理(組1、組2)、單一超高壓處理(組8)及熱殺菌處理(組9)的果汁在貯藏期內(nèi)不滿足食品衛(wèi)生標準GB 7101—2015中對于果蔬汁菌落總數(shù)100 CFU/mL的要求，而400 MPa溫-壓聯(lián)合處理組(組3～組7)在整個貯藏期內(nèi)菌落總數(shù)小于或等于1 CFU/mL，可以在4 ℃條件下貯藏35 d。故選組3～組7及組8、組9的前14 d作為貯藏期試驗處理條件，后續(xù)生理指標的測定以此7組進行。

表1 溫-壓聯(lián)合處理對藍靛果忍冬果汁貯藏期間菌落總數(shù)的影響 單位：CFU/mL

2.3.2 溫-壓聯(lián)合處理對藍靛果忍冬果汁貯藏期間總酚和花青素含量的影響

溫-壓聯(lián)合處理對藍靛果忍冬果汁貯藏期間總酚和花青素含量的影響如圖3所示。在4 ℃貯藏條件下，溫-壓聯(lián)合處理組(組3～組7)的果汁中總酚含量均呈先增加后降低的趨勢，且貯藏末期其含量略高于初始含量，這可能是前期苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase，PAL)發(fā)揮主要作用而促進了酚類物質(zhì)的合成，導致總酚含量增加。貯藏后期PAL等受到反饋抑制，多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)等用于多酚氧化的酶發(fā)揮主要作用，同時伴隨著酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)的聚合，導致總酚含量逐漸下降[15]。而超高壓組(組8)和熱殺菌組(組9)在前14 d 總酚含量與溫-壓聯(lián)合處理組無明顯差異。這表明溫-壓聯(lián)合處理可以有效維持果汁貯藏期間的總酚含量。

a-總酚含量；b-花青素含量

4 ℃貯藏條件下溫-壓聯(lián)合處理組(組3～組7)的果汁中花青素含量在前14 d內(nèi)呈下降趨勢，然后趨于較弱回升狀態(tài)，這可能是貯藏前期花青素與酚類化合物(如阿魏酸和丁香酸)發(fā)生氧化和縮合使其含量降低，貯藏后期酚類物質(zhì)減少使得氧化和縮合反應分解進而釋放了花青素，此外貯藏期內(nèi)果汁pH、金屬離子等因素的變化也會影響花青素穩(wěn)定性[5,16]。不同處理組果汁中花青素含量基本一致，說明不同溫-壓聯(lián)合處理條件對果汁貯藏期間花青素含量變化的影響無差異。而貯藏期內(nèi)前14 d熱殺菌處理組(組9)高溫破壞了花青素穩(wěn)定性以致其含量低于溫-壓聯(lián)合處理組，說明溫-壓聯(lián)合處理可以有效延緩藍靛果忍冬果汁貯藏期內(nèi)花青素含量的降低。

2.3.3 溫-壓聯(lián)合處理對藍靛果忍冬果汁貯藏期間pH、可溶性固形物和褐變度變化的影響

溫-壓聯(lián)合處理對藍靛果忍冬果汁貯藏期間pH、可溶性固形物和褐變度變化的影響如圖4所示。4 ℃ 貯藏條件下不同的溫-壓聯(lián)合處理組(組3～組7)及貯藏期前14 d超高壓組(組8)、熱殺菌組(組9)pH值變化趨勢基本一致，且在貯藏期內(nèi)略有下降。果汁中酸和鉀鹽(如檸檬酸鉀和蘋果酸鉀)易形成緩沖溶液，導致pH變化不顯著，但果汁在貯藏期內(nèi)營養(yǎng)成分的改變也會伴隨pH值的改變。鄧紅等[17]發(fā)現(xiàn)超高壓處理的獼猴桃果漿pH值隨著貯藏時間延長而降低，與本研究的結(jié)論一致，這可能是由于高壓處理使果汁中的果膠酶分解，在貯藏期間形成果膠酸而使其酸性提高導致pH降低?？扇苄怨绦挝锸呛饬克{靛果果汁品質(zhì)的重要指標。超高壓組(組8)、熱殺菌組(組9)及不同溫-壓聯(lián)合殺菌(組3～組7)處理后的果汁可溶性固形物含量在整個貯藏期間無明顯變化，始終維持在(12±0.1)Brix。有研究表明經(jīng)超高壓處理的石榴汁[18]在貯藏期間也維持穩(wěn)定的可溶性固形物含量。不同溫-壓聯(lián)合處理組(組3～組7)的果汁貯藏至28 d時褐變度逐漸升高，然后趨于穩(wěn)定，這可能是由于果汁中發(fā)生多酚氧化物的氧化縮合和降解反應，貯藏前期多酚物質(zhì)的合成為酶褐變的發(fā)生提供了原始底物，貯藏后期隨著多酚類物質(zhì)含量的下降，酶促褐變也趨于停滯[19]。此結(jié)果與超高壓殺菌處理冷破碎獼猴桃果漿貯藏期間褐變度的變化一致[17]。而貯藏期前14 d熱殺菌組(組9)褐變度要高于溫-壓聯(lián)合處理組及超高壓組(組8)，這說明溫-壓聯(lián)合殺菌可以有效延緩褐變度的升高。

a-pH值；b-可溶性固形物；c-褐變度

2.4 不同加工階段的果汁樣品電子舌分析結(jié)果

電子舌模擬人體味覺系統(tǒng)是近年來分析滋味的新型檢測手段，其原理是將測試樣品的電勢值轉(zhuǎn)化為味覺進而對味道進行綜合信息評價[20]。不同加工階段的果汁樣品電子舌分析結(jié)果如圖5所示。根據(jù)電子舌響應雷達圖，WTP與WTK相比，脫苦后的果汁苦味響應值反而加強，而酸味顯著降低，甜味顯著提高，但是口感上苦味降低，這可能是酸味的降低及甜味的提高而混淆大腦味覺從而掩蓋了苦味；YTP與WTP相比，調(diào)配后甜味反而降低，酸味提高，這可能是檸檬酸的酸作用強于蔗糖的甜作用；YMJ與YTP相比，兩者響應值幾乎一致，說明溫-壓聯(lián)合殺菌不會對果汁滋味產(chǎn)生影響；而YZC與YMJ相比，苦味、甜味響應值顯著提高，酸味顯著降低，這可能與貯藏期內(nèi)營養(yǎng)成分的變化有關。所以，對于口感上苦味的降低，應結(jié)合電子舌響應雷達圖綜合分析味道的掩蓋作用。

a-響應雷達圖；b-主成分分析圖

根據(jù)主成分分析圖，各組處理第一主成分(principal component 1，PC1)和第二主成分(PC2)的累積貢獻率分別為94.6%和3.9%，兩者累積貢獻率解釋了樣品之間98.5%的差異，樣品之間的差異足以使用主成分分析方法進行區(qū)別分析。樣品在主成分分析圖中的距離遠近可以表示不同樣品之間滋味的差異，距離越遠說明樣品差異越大[21]。其中，WTK與WTP距離較遠，說明脫苦效果顯著，WTP與YTP距離較遠，說明調(diào)配可以改善果汁滋味；YTP與YMJ出現(xiàn)重疊，且與YZC距離較近，說明果汁經(jīng)溫-壓聯(lián)合處理后風味無明顯變化，且4 ℃下貯藏35 d對果汁風味變化亦無顯著影響。這說明經(jīng)活性炭處理可有效實現(xiàn)果汁脫苦，調(diào)配后果汁風味明顯改善，溫-壓聯(lián)合處理亦有效維持其殺菌后及貯藏期間的風味。

3 結(jié)論與討論

超高壓技術作為一種非熱加工技術，不僅能夠殺滅果汁中的致病菌和腐敗菌，還能最大程度地保留營養(yǎng)成分[5]。但也有研究發(fā)現(xiàn)單獨超高壓處理可導致發(fā)酵石榴汁[18]等在貯藏期間的總酚和花色苷含量降低，使刺梨汁貯藏期間褐變度上升[24]。而本研究發(fā)現(xiàn)，與單純的熱或超高壓殺菌相比，溫-壓聯(lián)合殺菌處理的果汁微生物致死率更高，殺菌效果更好，且有效延緩了貯藏期內(nèi)花色苷含量的下降和褐變度的升高，在4 ℃貯藏條件下可達到35 d食品安全貯藏期。這說明溫-壓聯(lián)合殺菌不僅能夠有效殺滅果汁中的微生物，還可以有效維持果汁貯藏期間的營養(yǎng)品質(zhì)。

目前，電子舌技術已應用于分析草莓果汁、西瓜汁、紅棗汁等果汁滋味，且研究發(fā)現(xiàn)超高壓處理能夠明顯改善果汁品質(zhì)[25]。本試驗首次利用電子舌分析溫-壓聯(lián)合處理后的藍靛果果汁，結(jié)果顯示雖然脫苦后苦味響應值增加，酸味降低，但相比于脫苦前改善了苦味口感，說明酸對苦味口感發(fā)揮了協(xié)同增效作用。調(diào)配果汁可以改善口感，且溫-壓聯(lián)合處理果汁可以較好維持貯藏期內(nèi)果汁品質(zhì)和風味。因此，綜合成本、貯藏效果因素考慮，宜選擇400 MPa 3 min-50 ℃ 5 min貯藏4 ℃作為藍靛果忍冬果汁殺菌及貯藏條件。

綜上所述，活性炭具有良好的脫苦效果，溫-壓聯(lián)合殺菌處理對果汁具有良好的殺菌效果，維持貯藏期穩(wěn)定性，該方法對提升藍靛果忍冬加工產(chǎn)品品質(zhì)及推進藍靛果忍冬的開發(fā)與利用有重要意義。本研究已確定藍靛果忍冬的苦味物質(zhì)和活性炭的脫苦工藝，可依據(jù)苦味物質(zhì)的特性，篩選多種脫苦劑聯(lián)合脫苦，進一步脫除果汁中的苦味，優(yōu)化脫苦工藝，促進藍靛果果汁產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，提高藍靛果忍冬的資源利用率。