協(xié)同兩類腈水合酶高效催化煙酰胺及丙烯酰胺生物合成

趙凱陽，黃微煜，蔡宋佳，陳員慶，吳超城，周麗，程中一，周哲敏

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

腈水合酶(nitrile hydratase，NHase)是一種可以將腈類物質(zhì)通過水合作用轉(zhuǎn)化生成更有利用價值的酰胺類化合物的金屬酶[1]。在工業(yè)生產(chǎn)中主要用于生產(chǎn)丙烯酰胺和煙酰胺等[2]。其中，煙酰胺是維生素B族的一員，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品及食品等行業(yè)；丙烯酰胺及其聚合物主要應(yīng)用于凝結(jié)劑、土壤改良劑及石油回收劑等行業(yè)。因此，開發(fā)高性能的腈水合酶催化劑，實現(xiàn)酰胺類產(chǎn)物的高效合成具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值和經(jīng)濟價值。

根據(jù)腈水合酶多聚體的分子質(zhì)量大小，可將其分為低分子質(zhì)量腈水合酶(low-molecular-mass nitrile hydratase，L-NHase)和高分子質(zhì)量腈水合酶(high-molecular-mass nitrile hydratase，H-NHase)。L-NHase由B、A、E 3個亞基構(gòu)成，而H-NHase由B、A、G 3個亞基構(gòu)成，它們的催化反應(yīng)性能有較大差異。如在大腸桿菌中表達(dá)R.rhodochrousJ1來源的L-NHase，重組L-NHase 以煙腈為底物的比酶活力比重組H-NHase(234 U/mg)高42%[3]。熱穩(wěn)定性方面，H-NHase在50 ℃下放置30 min仍然具有完全的活性，在60 ℃下放置1 h則能保存50%的活性，而L-NHase穩(wěn)定性則稍差。WANG等[4]用含有H-NHase的重組菌全細(xì)胞催化煙腈合成煙酰胺，在添加菌體終濃度OD600值為8時，可在105 min合成390 g/L煙酰胺；添加菌體濃度OD600值為160時，煙酰胺產(chǎn)量提高為508 g/L，是目前文獻報道的最高值。對底物和產(chǎn)物的耐受性方面，L-NHase用煙腈底物或者煙酰胺產(chǎn)物孵育后會導(dǎo)致酶活力大幅度降低，耐受性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于H-NHase。此外，不同的NHase具有不同的底物特異性，NHase的底物主要有芳香型底物(包括雜環(huán)型)、脂肪型底物兩類。H-NHase對脂肪型底物的親和性較高，尤其是丙烯腈；而L-NHase對帶有芳香環(huán)及雜環(huán)的腈類物質(zhì)(例如煙腈)具有較高的活力。可見，不同類型的腈水合酶在催化反應(yīng)中各有其明顯的優(yōu)勢和劣勢。目前，主要通過篩選不同菌株來源的腈水合酶或?qū)﹄嫠厦高M行改造以獲得具有高穩(wěn)定性和/或耐受性的腈水合酶，還沒有通過協(xié)同表達(dá)不同類型的腈水合酶以提供更高效的腈水合酶[5]細(xì)胞催化劑的報道。

本研究協(xié)同表達(dá)H-型腈水合酶與L-型腈水合酶，構(gòu)建兼具對底物和產(chǎn)物耐受性高以及催化活性高的基因工程菌，實現(xiàn)全細(xì)胞催化合成煙酰胺及丙烯酰胺。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

克隆宿主菌株大腸桿菌JM109、表達(dá)宿主菌株BL21(DE3)為本實驗室保藏菌株。質(zhì)粒pRSFDuet以及含有腈水合酶編碼基因的重組質(zhì)粒BAE、BAG由本實驗室保藏。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母粉5、氯化鈉10。

培養(yǎng)基中根據(jù)質(zhì)粒上攜帶的抗性基因，選擇添加相應(yīng)的抗生素，抗生素添加量為：卡那霉素終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，氯霉素終質(zhì)量濃度為34 μg/mL。

本研究所用引物如表1所示。

表1 本研究所用引物

1.3 儀器與設(shè)備

PCR儀、凝膠成像儀、蛋白電泳儀，BIO-RAD公司；UV-1800PC型紫外可見分光光度計，上海美普達(dá)有限公司；pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；生物傳感儀，山東省科學(xué)院；高效液相色譜儀，日立(HITACHI)公司；Organic Acid色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，Prevail公司。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.4.1 BAE-BAG質(zhì)粒的構(gòu)建

以BAE質(zhì)粒為模板，用DT7-BAE-F和DT7-BAE-R引物PCR擴增BAE基因；以pRSFDuet質(zhì)粒為模板，用DT7-BAE-S-F和DT7-BAE-S-R引物PCR擴增質(zhì)粒骨架；用In fusion方法組裝，構(gòu)建pRSFDuet-BAE重組質(zhì)粒。以BAG質(zhì)粒為模板，用DT7-BAG-F和DT7-BAG-R引物PCR擴增BAG基因；以pRSFDuet-BAE重組質(zhì)粒為模板，用DT7-BAG-S-F和DT7-BAG-S-R引物PCR擴增質(zhì)粒骨架；用In fusion方法組裝，構(gòu)建BAE-BAG重組質(zhì)粒(圖1)，并經(jīng)DNA測序驗證。

1.4.2 BAG-BAE的質(zhì)粒的構(gòu)建

以BAG質(zhì)粒為模板，用DT7-BAG-F和DT7-BAG-2引物PCR擴增BAE基因；以pRSFDuet-BAE質(zhì)粒為模板，用DT7-GE-S-1和DT7-BAG-S-R引物PCR擴增質(zhì)粒骨架；用In fusion方法組裝，構(gòu)建BAG-BAE重組質(zhì)粒(圖1)，并經(jīng)DNA測序驗證。

圖1 重組菌株質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

1.5 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)方法

挑取重組菌株單菌落接種于含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8。加入終濃度為0.2 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，在24 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)20 h左右誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。

1.6 細(xì)胞催化活力的測定方法

400 μL 125 mmol/L煙腈底物中加入100 μL OD600值為1.0的菌體細(xì)胞，25 ℃反應(yīng)10 min，加入500 μL乙腈終止反應(yīng)。HPLC檢測煙酰胺含量。

單位酶活力定義：25 ℃條件下，單位毫升細(xì)胞1 min 催化煙腈產(chǎn)生煙酰胺的量(U/mL)。

1.7 細(xì)胞耐受性測定方法

將100 μL OD600值為6.0[6]的重組菌細(xì)胞分別加入900 μL不同濃度的煙腈、煙酰胺、丙烯腈、丙烯酰胺溶液中，25 ℃下放置30 min，用10 mmol/L 磷酸鉀緩沖液(KPB)(pH 7.4)清洗細(xì)胞2次，測定細(xì)胞殘余酶活。相對酶活力計算如公式(1)所示：

(1)

未經(jīng)過有機試劑處理的細(xì)胞其相對酶活力為100%。

1.8 全細(xì)胞催化方法

將重組菌株用去離子水重懸，并將吸光度OD600值調(diào)整為8[7]。取50 mL菌液置于燒杯中，邊攪拌邊反應(yīng)，并控制反應(yīng)溫度低于30 ℃。以第一次加底物(2 g煙腈/次或者1.5 mL丙烯腈/次)為起點計時，每隔2 min取10 μL反應(yīng)液加到加入990 μL乙腈中終止反應(yīng)。用高效液相分析樣品中煙酰胺或者丙烯酰胺產(chǎn)物的量，并測定底物是否有剩余，待沒有底物剩余時繼續(xù)加底物。重復(fù)前面步驟，直到底物不能繼續(xù)被消耗。

1.9 煙腈、煙酰胺、丙烯腈、丙烯酰胺含量檢測方法

采用C18色譜柱及液相色譜，檢測煙腈、煙酰胺、丙烯腈、丙烯酰胺的含量。流動相為水和乙腈(體積比2∶1)的混合溶液。檢測波長設(shè)定220 nm，柱溫為40 ℃。流速設(shè)定為0.8 mL/min，進樣體積10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 協(xié)同表達(dá)BAG和BAE菌株的構(gòu)建

將含有BAE、BAG的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21菌株[8]，獲得5種重組菌株(圖1)。重組菌株經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)腈水合酶，全細(xì)胞SDS-PAGE如圖2所示。BAE和BAG都具有α和β 2個亞基，其β亞基大小略有差別，而α亞基大小相近。BAE菌株表達(dá)量明顯低于BAG菌株。BAG+BAE雙質(zhì)粒菌株中，同時實現(xiàn)了2種類型腈水合酶的表達(dá)，其中BAE的表達(dá)水平與BAE單酶菌株相似，而BAG的表達(dá)水平低于BAG的單酶菌株。BAG-BAE菌株和BAE-BAG菌株中BAG的表達(dá)水平與BAG單酶菌株相仿，而BAE的表達(dá)水平較低。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker

2.2 重組菌株耐受性分析

由圖3可知，BAG菌株對4種化合物的耐受性顯著優(yōu)于BAE菌株。BAG+BAE、BAG-BAE、BAE-BAG菌株中協(xié)同表達(dá)BAG與BAE，使得其耐受性優(yōu)于BAE菌株。其中，BAG-BAE、BAE-BAG菌株在一個質(zhì)粒上同時表達(dá)了BAE和BAG兩種酶，它們對4種化合物的耐受性顯著優(yōu)于將BAE和BAG兩種酶分別放在2個質(zhì)粒上表達(dá)的BAG+BAE菌株，達(dá)到了與BAG菌株相仿的水平。因此，本研究協(xié)同表達(dá)BAG與BAE兩種腈水合酶，提高全細(xì)胞催化反應(yīng)速率的同時，仍保留了重組菌株對底物和產(chǎn)物較高的耐受性。

2.3 全細(xì)胞催化合成煙酰胺

利用重組菌株細(xì)胞催化煙腈底物合成煙酰胺[9]的反應(yīng)過程如圖4-a所示。反應(yīng)前期BAG+BAE與BAE的反應(yīng)速率基本相同；但是在反應(yīng)后期，BAE由于對產(chǎn)物耐受性較差，反應(yīng)速率明顯降低，且反應(yīng)會較早停止，而BAE+BAG比BAE的耐受性更好，而且后期反應(yīng)速率也很高，最終產(chǎn)物煙酰胺[10]的合成量高于BAE。BAG的反應(yīng)速率較慢，但是耐受性最強，可以持續(xù)反應(yīng)較長時間，產(chǎn)物量高。該結(jié)果表明通過協(xié)同表達(dá)BAG與BAE，實現(xiàn)了提高反應(yīng)速率的目的。

由圖4-b所示，反應(yīng)前期BAE-BAG反應(yīng)速率很快；在反應(yīng)后期，BAE-BAG由于對產(chǎn)物耐受性較好，反應(yīng)速率也較高，但隨時間延長，底物不斷被消耗，產(chǎn)物不斷積累，反應(yīng)速率減弱，最終產(chǎn)量顯著高于BAE+BAG雙質(zhì)粒菌株。該結(jié)果表明將BAE和BAG構(gòu)建在同一質(zhì)粒上，實現(xiàn)了提高反應(yīng)速率和產(chǎn)量的目的。

a-BAE、BAG、BAG+BAE菌株；b-BAE-BAG、BAG-BAE菌株

郭軍玲等[11]報道了用含有BAG的重組大腸桿菌細(xì)胞催化煙腈合成煙酰胺，在添加菌體終濃度OD600值為8時，可在105 min合成390 g/L煙酰胺；添加菌體濃度OD600值為160時，煙酰胺產(chǎn)量提高為508 g/L，是目前文獻報道的最高值。本文將BAG與BAE協(xié)同表達(dá)，菌株BAE-BAG在反應(yīng)70 min就可以產(chǎn)生400 g/L煙酰胺，反應(yīng)速度顯著高于文獻報道；同時，最終煙酰胺產(chǎn)物的產(chǎn)量可以提高為516 g/L；表明成功實現(xiàn)了協(xié)同提高催化速率和產(chǎn)量的目標(biāo)。

2.4 全細(xì)胞催化合成丙烯酰胺

利用重組菌株細(xì)胞催化丙烯腈底物合成丙烯酰胺[12]的反應(yīng)過程如圖5所示。BAE催化丙烯腈合成丙烯酰胺的速率高于BAG菌株。協(xié)同表達(dá)BAE與BAG使得催化速率接近BAE菌株。其中BAE-BAG與BAG-BAE菌株在產(chǎn)物達(dá)到較高濃度后，仍能繼續(xù)反應(yīng)，最終產(chǎn)物濃度比BAE菌株提高了19.1%。該結(jié)果表明協(xié)同表達(dá)BAE、BAG同樣協(xié)同提高了催化丙烯腈合成丙烯酰胺[13]的催化速率和產(chǎn)量。

圖5 全細(xì)胞催化合成丙烯酰胺

3 結(jié)論

本文協(xié)同表達(dá)H-Nhase與L-Nhase型腈水合酶，成功構(gòu)建了兼?zhèn)溥@兩種腈水合酶優(yōu)勢的BAE-BAG菌株。該菌株對底物、產(chǎn)物耐受性較強并具有較高催化反應(yīng)速率。最終煙酰胺產(chǎn)量可達(dá)到516 g/L，是目前報道的最高產(chǎn)量；丙烯酰胺產(chǎn)量比原始BAE或BAG菌株提高19.1%以上，有利于工業(yè)化應(yīng)用。