六種植物生長調節(jié)劑促進裂壺藻油脂和DHA積累的研究*

張 劍，楊雨欣，唐裕芳，李玉芹，周 蓉，張妙玲

(湘潭大學 化工學院，湖南 湘潭 411105)

0 引言

二十二碳六烯酸(DHA)是一種對人體十分重要的ω-3多不飽和脂肪酸(PUFAs)[1]，具有預防心血管疾病、健腦益智和抗癌、抗過敏等重要的生理功能，在保健食品、飼料、醫(yī)療等行業(yè)具有廣泛的商業(yè)應用前景[2-3].DHA的傳統(tǒng)來源是深海魚油，但由于目前的海洋資源日益枯竭和環(huán)境污染造成魚油產量和質量無法滿足消費者對DHA的需求，因此，急需開發(fā)新的DHA綠色生產途徑以解決現(xiàn)有問題.海洋微藻裂壺藻是DHA等PUFAs的初級生產者，因其生長的營養(yǎng)要求相對簡單，生長環(huán)境可控，受到人們的廣泛重視，已成為PUFAs 的替代來源.但是，微藻細胞較低的產量和較高的培養(yǎng)成本限制了PUFAs大規(guī)模使用.

提高PUFAs產量除了提高微藻中PUFAs含量，還需提高微藻的生物量.微藻中的油脂含量和組成會因環(huán)境脅迫而變化，如營養(yǎng)成分的缺乏、高鹽度等非生物脅迫條件會促進微藻中油脂含量的增加，但非生物脅迫會抑制微藻的生長，造成微藻生物量減少[4-5].植物激素是植物體內產生的一類具有顯著調控作用的小分子代謝產物，作為信號分子在介導多細胞植物的生長、發(fā)育和環(huán)境脅迫反應方面起著至關重要的作用[6-7].有研究報道植物生長調節(jié)劑能同時促進微藻生物量和油脂、碳水化合物等高價值產品積累.Salama等[8]研究表明外源添加植物生長調節(jié)劑DA-6可以提高斜生柵藻的生物量和代謝產物含量.朱堯[9]發(fā)現(xiàn)低濃度的吲哚-3-乙酸和己酸二乙氨基乙酯刺激斜生柵藻的生長和脂肪酸含量明顯增加.但植物生長調節(jié)劑促進裂壺藻生長及油脂、DHA含量增長的研究報道較少.

因此，本研究探討6種植物生長調節(jié)劑萘乙酸(NAA)、6-芐氨基嘌呤(6-BA)、赤霉素(GA)、己酸二乙氨基乙醇酯(DA-6)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、茉莉酸甲酯(MeJA)對裂壺藻生長、油脂和DHA含量的影響，旨在為裂壺藻獲取更高產量油脂和DHA提供一種新的研究思路.

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)

實驗菌種裂壺藻(Schizochytrium) ATCC20888，購買于廣東省微生物菌種保藏中心.種子培養(yǎng)基配方為：葡萄糖50 g/L，酵母膏4 g/L，人工海水1 L，pH為6.5；發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：甘油70 g/L，酵母膏4 g/L，人工海水1 L，pH為6.5.二級種子液分別接種到含有六種植物生長調節(jié)劑的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為26 ℃，轉速180 r/min，連續(xù)培養(yǎng)5 d，以不添加植物生長調節(jié)劑為陰性對照.每組實驗設置三個平行.

1.2 生物量測定

取第5 d的發(fā)酵液置于已稱重的離心管中，8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，藻泥用蒸餾水洗滌三次，置于-80 ℃冰箱中冷凍4 h，然后于真空冷凍干燥機中凍干至恒重(約48 h)，稱凍干藻粉質量，根據式(1)計算裂壺藻生物量.

(1)

1.3 總脂測定

取裂壺藻藻粉0.5 g，加入30%的濃鹽酸3 mL，重懸菌體，于80 ℃水浴鍋中水浴1 h，油脂提取采用具體操作步驟見何文勝等[12].油脂含量和產量根據式(2)和(3)計算.

(2)

油脂產量(g/L)=油脂含量(%)×生物量(g/L).

(3)

1.4 DHA含量測定

脂肪酸甲酯化：取步驟1.3中提取的油脂，加入1 mL 0.5 mol/L NaOH-CH3OH，1 mg/mL內標物十九烷酸1 mL，于60 ℃水浴條件下皂化反應30 min，反應結束后加入2 mL 14% BF3-CH3OH，于60 ℃水浴條件下發(fā)生甲酯化反應30 min后冷卻至室溫，加入飽和NaCl溶液2 mL和正己烷3 mL，待混合溶液靜置分層后，取上清液至棕色進樣瓶中保存，然后用于氣相色譜分析.氣相色譜條件：毛細管柱HP-88(100 mm×250 μm×0.20 μm)，程序升溫：起始溫度100 ℃，停留1 min后以40 ℃/min的速度升至200 ℃，再以8 ℃ /min的速度升至280 ℃并停留5 min.載氣為氮氣，進樣口溫度280 ℃，F(xiàn)ID檢測器溫度為300 ℃.數(shù)據處理采用面積歸一法.最后以DHA質量占裂壺藻生物量中百分比表示(%).

所有實驗都重復3次，顯著性分析采用“Waller-Duncan”.

2 結果與討論

2.1 NAA對裂壺藻生長及油脂和DHA積累的影響

圖1為添加不同濃度NAA后裂壺藻生物量及裂壺藻中的油脂和DHA含量、產量.從圖1可以看出，植物生長調節(jié)劑NAA會影響裂壺藻的生長及細胞內油脂和DHA含量.如圖1(a)所示，NAA濃度為0.02 mg/L時，裂壺藻的生物量達到最大，為35.79 g/L，顯著高于不添加NAA對照組的生物量(31.20 g/L)，相比對照組提高了1.15倍.當NAA濃度超過0.02 mg/L時，裂壺藻的生物量無顯著增加.對裂壺藻中油脂含量和產量來說，隨著NAA濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，均顯著高于未添加NAA的對照組中油脂含量和產量.當NAA濃度為0.04 mg/L時，裂壺藻中油脂含量和產量達到最大，分別為36.6%和12.73 g/L，分別比對照組提高了1.30倍和1.45倍，其中油脂含量顯著高于其他濃度組中油脂含量.對裂壺藻中DHA含量和產量來說(如圖1(b)所示)，也是隨著NAA濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當NAA濃度為0.04 mg/L時，裂壺藻中DHA含量和產量達到最高，分別達到16.31%和5.67 g/L，相比對照組分別提高了1.18倍和1.32倍.

2.2 6-BA對裂壺藻生長及積累油脂和DHA的影響

圖2為添加不同濃度6-BA后裂壺藻生物量及裂壺藻中的油脂和DHA含量、產量.從圖2可以看出，外加6-BA后，裂壺藻的生物量、油脂和DHA含量及產量均顯著增加.從圖2(a)可知，當6-BA的濃度為0.04 mg/L時，裂壺藻的生物量達到最高為34.11 g/L，相比對照組提高了1.09倍.當6-BA濃度為0.08 mg/L時，裂壺藻的油脂含量及產量達到最大，分別為39.32%和13.32 g/L，相比對照組，分別提高了1.39倍和1.52倍.從圖2(b)可知，DHA含量和產量隨著6-BA濃度增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，當6-BA濃度為0.08 mg/L時，DHA的含量和產量最高，為19.20%和6.50 g/L，與對照組相比分別提高了1.40倍和1.51倍.

2.3 GA對裂壺藻生長及積累油脂和DHA的影響

圖3為添加不同濃度GA后裂壺藻生物量及裂壺藻中的油脂和DHA含量、產量.從圖3可知，添加GA后，裂壺藻的生物量以及裂壺藻中油脂和DHA含量、產量顯著增加，隨著GA濃度增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.從圖3(a)可知，當GA濃度為0.5 mg/L時，裂壺藻的生物量最高，為35.55 g/L，與對照組相比提高了1.14倍.當GA濃度為0.5 mg/L時，裂壺藻油脂含量和產量達最高，分別為37.39%和13.29 g/L，與對照組相比分別提高了1.33倍和1.51倍.從圖3(b)可知，當GA濃度為0.5 mg/L時，DHA的含量和產量達到最高，分別為15.38%和5.47 g/L，相比于對照組的DHA產量分別提高了1.12倍和1.28倍.

圖3 不同濃度GA對裂壺藻生物量、油脂含量、油脂產量(a)及DHA含量、DHA產量(b)的影響Fig.3 Effects of different concentrations of GA on the biomass, lipid content, lipid yield (a) and DHA content, DHA yield (b) of Schizochytrium

2.4 2,4-D對裂壺藻生長及積累油脂和DHA的影響

圖4為添加不同濃度2,4-D后裂壺藻生物量及裂壺藻中的油脂和DHA含量、產量.從圖4可知，添加2,4-D后，裂壺藻的生物量以及裂壺藻中油脂和DHA含量、產量均顯著增加.隨著2,4-D濃度增加，油脂和DHA含量、產量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.從圖4(a)可知，當2,4-D濃度為1.5 mg/L時，裂壺藻的生物量高達32.54 g/L，相比對照組提高1.11倍，不同的2,4-D濃度下裂壺藻的生物量沒有顯著變化.當2,4-D的濃度為1.5 mg/L時，油脂含量和產量達到最大，分別為54.36%和17.69 g/L，與對照組相比分別提高了1.56倍和1.72倍.從圖4(b)可知，當2,4-D濃度為1.5 mg/L時，DHA含量和產量達到最大，分別為21.33%和6.94 g/L，相比對照組分別提高了1.46倍和1.62倍.

圖4 不同濃度2,4-D對裂壺藻生物量、油脂含量、油脂產量(a)及DHA含量、DHA產量(b)的影響Fig.4 Effects of different concentrations of 2,4-D on the biomass, lipid content, lipid yield (a) and DHA content, DHA yield (b) of Schizochytrium

2.5 DA-6對裂壺藻生長及積累油脂和DHA的影響

圖5為添加DA-6后裂壺藻生物量及裂壺藻中的油脂和DHA含量、產量.從圖5可知，添加DA-6后，裂壺藻的生物量以及裂壺藻中油脂和DHA含量、產量均顯著增加，且隨著DA-6濃度增加均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.從圖5(a)可知，DA-6濃度從0.01 mg/L增加1.0 mg/L，裂壺藻生物量未發(fā)生顯著變化，當DA-6濃度為0.05 mg/L時，裂壺藻生物量達到最高，為33.07 g/L，相比未添加DA-6的對照組提高了1.12倍.當DA-6濃度為0.05 mg/L時，油脂含量和產量也達到最大，分別為57.66%和19.06 g/L，相比于對照組分別提高了1.65倍和1.85倍.從圖5(b)可知，DA-6濃度為0.05 mg/L時，DHA含量和產量最高，分別為21.86%和7.23 g/L，與對照組相比分別提高了1.52倍和1.71倍.

圖5 不同濃度DA-6對裂壺藻生物量、油脂含量、油脂產量(a)及DHA含量、DHA產量(b)的影響Fig.5 Effects of different concentrations of DA-6 on the biomass, lipid content, lipid yield (a) and DHA content, DHA yield (b) of Schizochytrium

2.6 MeJA對裂壺藻生長及積累油脂和DHA的影響

圖6為添加MeJA后裂壺藻生物量及裂壺藻中的油脂和DHA含量、產量.從圖6可知，添加MeJA后，裂壺藻的生物量以及裂壺藻中油脂和DHA含量、產量均顯著增加，且隨著MeJA濃度增加均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.從圖6(a)可知，當MeJA濃度為2.5 mg/L時，裂壺藻的生物量達到最高為34.04 g/L，相比于對照組的生物量提高了1.15倍.當MeJA濃度為15 mg/L時，其油脂含量和產量達到最高，分別為54.97%和18.19 g/L，與對照組相比分別提高了1.57倍和1.77倍.從圖6(b)可知，當MeJA的濃度為15 mg/L時，DHA含量和產量達到最高，分別為21.83%和7.22 g/L，相比于對照組的DHA含量和產量分別提高了1.50倍和1.70倍.

圖6 不同濃度MeJA對裂壺藻生物量、油脂含量、油脂產量(a)及DHA含量、DHA產量(b)的影響Fig.6 Effects of different concentrations of MeJA on the biomass, lipid content, lipid yield (a) and DHA content, DHA yield (b) of Schizochytrium

2.7 討論

以上6種植物生長調節(jié)劑均不同程度促進裂壺藻的生長及油脂和DHA積累，但是，適宜濃度的植物生長調節(jié)劑才能有效促進裂壺藻生長及油脂和DHA積累.添加植物生長調節(jié)劑等化學物質是一種不阻礙微藻生長又能促進代謝物產量增加的新措施.Vijay等[10]證實0.25 mmol/L激動素使斜生柵藻生物量增加1.6倍，吲哚-3-乙酸濃度大于50 mmol/L 顯著促進斜生柵藻油脂含量增加.這可能是因為植物生長調節(jié)劑可作為細胞內化學信號分子，調節(jié)有絲分裂中涉及的信號通路以及調控代謝物產物的合成途徑，通過刺激細胞周期進程來促進細胞的生長[11-12].而外源添加植物生長調節(jié)劑使油脂積累的原因可能是蛋白質和碳水化合物的降解，碳源分配方向發(fā)生了改變，從而為藻類的脂質積累提供碳源或能量[13].相比NAA、6-BA、GA三種植物生長調節(jié)劑，DA-6、2,4-D、MeJA三種植物生長調節(jié)劑更能促進裂壺藻生長以及油脂和DHA積累.這結果可能是因為不同植物生長調節(jié)劑對同一微藻的應激作用不同所致.Nazir等[14]在探討萘氧乙酸、赤霉素、激動素、茉莉酸、水楊酸、脫落酸、褪黑素、乙醇胺8種植物生長調節(jié)劑對Aurantiochytriumsp.SW1生長和DHA積累的影響時也發(fā)現(xiàn)類似的結果：只有其中的赤霉素、激動素、茉莉酸顯著促進Aurantiochytriumsp.SW1生長及DHA積累.同時，適宜濃度的植物生長調節(jié)劑才能最大幅度促進微藻生長和油脂或DHA積累.例如：相比對照組，2 mg/L激動素使Aurantiochytriumsp.SW1 生物量增加最大，增加27.9%，而4 mg/L GA和20 mg/L 茉莉酸才能使Aurantiochytriumsp.SW1生物量增加最大，分別增加20.2%和16.3%.對Aurantiochytriumsp.SW1中DHA含量來說，添加4 mg/L GA和20 mg/L 茉莉酸時增加幅度最大，分別達到5.1 g/L和5.3 g/L, 而添加2 mg/L激動素時，DHA的增加幅度最大，為4.8 g/L[14].另外，同一植物生長調節(jié)劑促進不同微藻菌株生長和油脂積累的最適濃度及促進效果可能均有差異.例如，Nazir等[14]發(fā)現(xiàn)萘氧乙酸不能顯著促進Aurantiochytriumsp.SW1油脂積累，但Wang等[15]發(fā)現(xiàn)萘氧乙酸在最適濃度2 mg/L能使Schizochytriumsp.S31細胞中油脂含量顯著增加11.16%.植物生長調節(jié)劑對微藻油脂積累的影響程度還與微藻的培養(yǎng)模式有關.非生物脅迫耦合植物生長調節(jié)劑會進一步促進微藻油脂積累[5, 16-17]，這可能是因為植物生長調節(jié)劑會減緩非生物脅迫對微藻造成的氧化損傷和增強微藻細胞中的抗氧化防御系統(tǒng)，從而進一步促進油脂含量.另外，兩種植物生長調節(jié)劑協(xié)同能進一步促進微藻中油脂積累[15, 18-19]或者植物生長調節(jié)劑與其他化學調節(jié)劑復配促進微藻中油脂或DHA增加[20].這些策略都可以借鑒到積累裂壺藻中油脂和DHA 積累.但是植物生長調節(jié)劑促進微藻油脂積累的詳細分子機理尚需解析，機理分析將為利用微藻生物合成油脂并用于實踐奠定理論基礎.

3 結論

本文研究的6種植物生長調節(jié)劑在合適濃度均能顯著促進裂壺藻生長及裂壺藻中油脂和DHA積累.其中DA-6、2,4-D、MeJA促進裂壺藻生物量及油脂、DHA產量增加的幅度高于其他三種植物生長調節(jié)劑促進裂壺藻生物量及油脂、DHA產量增加幅度.本研究實驗結果表明，外加合適濃度的植物生長調節(jié)劑能促進微藻生長及細胞中油脂和DHA積累，并且較低濃度人工合成植物生長調節(jié)劑就能顯著促進裂壺藻中油脂和DHA含量增加，投入成本低，具有潛在經濟效益.該研究結果為開發(fā)促進微藻中油脂和DHA積累策略開辟新的思路.