釀酒葡萄抗寒相關(guān)基因的研究進(jìn)展

馬 巖，劉牧青，孫雨航，鐘 軻，韓 寧，代玲敏

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353）

葡萄酒近年來在中國越來越被廣大人民接受，但葡萄酒的原料——?dú)W洲葡萄品質(zhì)雖好，但抗寒性較差。我國國土面積廣大，因氣候原因，北方地區(qū)冬季溫度過低導(dǎo)致葡萄植株受損而質(zhì)量下滑。隨著氣候與土壤條件的不斷變化以及一些植物的跨地域栽培，植物對環(huán)境的適應(yīng)變得極其重要。在一些極端條件下，植物為了適應(yīng)環(huán)境不斷進(jìn)化出一套防御體系。Jiang 等通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對低溫有一定抵抗能力的葡萄光合作用及與糖生物合成相關(guān)酶的活性比較強(qiáng)，這是植物開始適應(yīng)低溫環(huán)境的一種本能反應(yīng)；范高韜從歐亞種玫瑰香中分離得到一種基因并命名為，經(jīng)低溫誘導(dǎo)及熒光定量PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，該基因表達(dá)量在低溫誘導(dǎo)前期沒有顯著性變化，24 h 后顯著上調(diào)，這表明該基因可能被其他冷相關(guān)基因誘導(dǎo)表達(dá)。由此看出，基因的表達(dá)并不是獨(dú)立，而是一個甚至多個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

隨著分子生物學(xué)等的不斷發(fā)展，利用分子生物學(xué)等方法探索在低溫條件下抗寒基因的表達(dá)途徑。第二信使分子在細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞過程中扮演著重要的角色，鈣離子與脫落酸（Abscisic Acid，ABA）比較常見。信號傳遞一般分為兩類，不依賴ABA途徑與依賴ABA途徑。

不依賴ABA 信號傳導(dǎo)途徑：在低溫條件下，植物細(xì)胞膜發(fā)生相變，這種刺激信號使Ca內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)的Ca受體蛋白激酶被磷酸化，CRLK 作為連接CRPK 與MAPK 級聯(lián)途徑的橋梁，低溫信號通過該途徑被傳遞并逐漸放大。Xu 等從山葡萄中克隆出兩種ICE 基因（、），當(dāng)細(xì)胞感受到低溫信號后，在Ca信號作用下，基因編碼MYC 型轉(zhuǎn)錄因子并激活基因的表達(dá)，基因編碼bHLH 型轉(zhuǎn)錄因子以激活基因的表達(dá)，隨后轉(zhuǎn)錄因子與抗寒相關(guān)基因啟動子上的CRT/DRE 順式作用元件結(jié)合，啟動下游基因（、，基因相比于基因特異性調(diào)控基因）的表達(dá)。依賴ABA 信號傳導(dǎo)途徑：當(dāng)細(xì)胞感受到低溫信號后，ABA 濃度升高，在ABA 受體PYL 上合成AREB 蛋白，該蛋白與CE 元件偶聯(lián)結(jié)合到啟動子片段的ABRE 順式作用元件上啟動下游基因的表達(dá)（見圖1）。

圖1 抗寒基因表達(dá)通路

低溫是限制植物生長發(fā)育及存活的逆境脅迫，不但會改變酶的生存條件，使酶活性降低甚至是喪失，還會改變細(xì)胞膜的狀態(tài)。當(dāng)膜系統(tǒng)遭受冷凍傷害，為了適應(yīng)低溫條件，細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸比例升高，由于抗氧化酶活性受到影響，不飽和脂肪酸容易被氧化成脂氫過氧化物。脂氫過氧化物不僅會分解成丙二醛，還會均裂產(chǎn)生脂性自由基，這種物質(zhì)既會不斷損傷細(xì)胞膜，又會氧化蛋白質(zhì)從而使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集。低溫還會降低與光合作用相關(guān)的酶類活性：1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）、磷酸核酮糖激酶（PRK）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）等，減少糖類的合成。王依等[選取4種釀酒葡萄以篩選低溫適應(yīng)性強(qiáng)的葡萄品種，低溫處理后發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶活性以及可溶性脂肪含量升高，脯氨酸、可溶性糖及超氧化物歧化酶活性先升高后下降，過氧化物酶活性降低，電導(dǎo)率及丙二醛含量升高。2018年，賀蘭山地區(qū)發(fā)生低溫災(zāi)害，導(dǎo)致90%一年生葡萄幼株、30%～40%兩年生葡萄幼株受凍死亡。低溫條件會觸發(fā)植物自身的抵抗機(jī)制來抵御脅迫，但仍會對其造成極大的損害。因此我們需要采取并對比一切可以提高葡萄抗寒性的合理措施以使葡萄安然越冬。

1 提高葡萄抗寒性的措施

提高葡萄越冬能力的方法多種多樣：（1）埋土。埋土作為廣泛采用的能使葡萄安然越冬的方法，從結(jié)果來看是極其有效的。葡萄在越冬期間，一年生枝干以及地表附近的根系容易受到損傷，土埋增加了根系周圍的土壤厚度，可有效提高根系周圍溫度，保護(hù)根系免受損傷，在來年可使其有效吸收水分及營養(yǎng)。但其存在的問題也比較明顯：首先，土埋比較費(fèi)時費(fèi)力，取土也存在一定風(fēng)險，只從葡萄株周圍取而不回填可能會人為對根系造成損傷，取土?xí)斐扇⊥羺^(qū)土壤厚度下降，在冬季對其造成二次傷害；其次，在葡萄成熟期以及采摘期，如果操作不得當(dāng)，還會使腐爛的葡萄顆粒留在土壤中使其感染病害。（2）選擇抗寒的砧木嫁接。不同砧木的抗寒性、抗旱性、抗鹽堿能力及抗病性存在差異，需要根據(jù)葡萄品種的特性選擇合適砧木。對5種抗寒性較好的砧木（5BB、5C、SO4、140R、kangzhen3）綜合抗寒力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)5BB 抗寒性最高。（3）灌水和熏煙。該方法需要及時關(guān)注天氣情況，在霜凍來臨前5 h 灌水，或點(diǎn)燃碎木屑，利用燃燒產(chǎn)生的熱量增加株間溫度。（4）建設(shè)保溫棚。胡悅等發(fā)現(xiàn)保溫棚可以有效提高棚內(nèi)地下20 cm 以內(nèi)的溫度，空氣濕度、土壤濕度都能有效提高，但是大棚的建設(shè)成本比較高，費(fèi)時費(fèi)力，適合小規(guī)模使用。（5）建設(shè)防護(hù)林。在冬季風(fēng)向的垂直方向建造防護(hù)林，使冷空氣沿樹體爬升。（6）噴施殼聚糖。殼聚糖分解后產(chǎn)生低聚合度的堿性寡糖可引起葡萄植株的應(yīng)激反應(yīng)，增加植株內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物的含量，降低冰點(diǎn)，提高抗寒性。（7）選擇合適的葡萄園，盡可能避開冷空氣聚集的低洼區(qū)。（8）通過基因工程的手段，定向提高葡萄的抗低溫能力。目前主要是通過轉(zhuǎn)入調(diào)控基因或者目的基因來改善葡萄的抗寒性。因?yàn)榛虻牟迦胛稽c(diǎn)隨機(jī)，需要篩選抗性優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因植株以穩(wěn)定遺傳。目前發(fā)現(xiàn)低溫轉(zhuǎn)錄因子（、等）、脫水素家族、單鋅指結(jié)合蛋白家族和泛素/26S 蛋白酶體系的表達(dá)會顯著提高植物的抗寒性。外源基因在植物的有性生殖中具有遺傳穩(wěn)定性，可避免每年投入大量的人力物力。從長遠(yuǎn)角度考慮，利用分子生物學(xué)及遺傳學(xué)方法與技術(shù)定向提高葡萄的抗寒性具有很光明的前景。

2 抗寒相關(guān)基因

2.1 抗寒相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

CBF 轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/EREBP 型轉(zhuǎn)錄因子，是植物低溫脅迫中主要依賴的一條抗寒途徑。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的CBF1、CBF2、CBF3 和CBF4 基因，前三者位于四號染色上，后者位于五號染色體上且被發(fā)現(xiàn)是四類CBF 基因中唯一一個與ABA 調(diào)控途徑互作的基因。當(dāng)植物遭受低溫脅迫，ICE（inducer of CBF expression）基因被誘導(dǎo)表達(dá)，該基因結(jié)合到CBF 基因的啟動子區(qū)域直接驅(qū)動CBF 基因的表達(dá)。CBF 蛋白隨后結(jié)合到COR 基因啟動子的CRT/DRE 順式作用元件上啟動下游基因的表達(dá)。從山葡萄中克隆得到VaCBF1 基因，經(jīng)脅迫處理及熒光定量PCR 檢測后發(fā)現(xiàn)，該基因受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，不受山梨醇和氯化鈉誘導(dǎo)。其他轉(zhuǎn)錄因子，如、、、及等都可以提高植物抗寒性。

2.2 抗寒功能基因

2.2.1 脫水素基因

脫水素（Dehydrin，DHN）是一種晚期胚胎發(fā)育豐富蛋白（late embryogenesis abundant protein，LEA），屬于LEA 蛋白的第二家族，分子量在9～200 KDa 之間，在種子發(fā)育后期和逆境條件下大量積累。Malik發(fā)現(xiàn)在非生物脅迫下，脫水素基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均上調(diào)且植物的抗逆性提高。脫水素由3 個保守片段：K 片段、S 片段和Y 片段組成，Mota還發(fā)現(xiàn)富含極性氨基酸的、不保守的φ片段參與形成SKn 型大豆脫水素。K 片段位于C末端，可形成雙親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)，K 片段與陽離子抗菌多肽性質(zhì)極度相似，脫水素表達(dá)會抑制大腸桿菌的生長。S 片段由一系列絲氨酸組成，易發(fā)生磷酸化，與核定位有關(guān)的信號肽結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞核，與脫水素定位到細(xì)胞核并幫助肽鏈初步折疊行使分子伴侶功能有關(guān)。還有一些S 片段包含LHR 序列（GXGGRRKK），能夠與K 片段連接，也可發(fā)生磷酸化。Y 片段((V/T)DEYGNP)位于N 末端，其氨基酸序列與植物和細(xì)菌的分子伴侶的核酸結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列具有同源性。Y 片段富含甘氨酸，與組織特異性有關(guān)，亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)含Y 片段的脫水素在種子中大量表達(dá)，其他不含Y片段的脫水素沒有組織特異性。脫水素含有的3個保守片段數(shù)量和排列方式被分為五類，不同類型脫水素響應(yīng)的脅迫也存在區(qū)別（見表1）。

表1 不同類型脫水素的性質(zhì)與響應(yīng)模式

其中，YSK型脫水素以其雙親性的特點(diǎn)，通過靜電作用與細(xì)胞膜的脂質(zhì)分子結(jié)合，在細(xì)胞失水條件下可以防止膜聚集而保護(hù)膜結(jié)構(gòu)。KS 型脫水素可以直接結(jié)合金屬離子或間接清除活性氧自由基，降低氧化損害。SK和K型脫水素在低溫脅迫下有明顯積累。脫水素最早在研究棉花子葉中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白時被發(fā)現(xiàn)，這類蛋白因在逆境脅迫下大量累積被廣泛關(guān)注。脫水素的功能主要體現(xiàn)在以下幾個方面：（1）K 片段賦予脫水素的雙親性結(jié)合膜結(jié)構(gòu)，防止膜發(fā)生聚集；（2）結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的金屬離子維持細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，降低由金屬離子產(chǎn)生的活性氧自由基；（3）具有分子伴侶的功能。脫水素會在植物中選擇性表達(dá)避免浪費(fèi)機(jī)體資源，如亞洲白樺樹為適應(yīng)凍害在冬季表達(dá)大量脫水素蛋白但在夏季不會表達(dá)。第一次表明脫水素具有抗凍活性的研究是從桃中分離到的PAC60 基因，它既可以防止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，又可以產(chǎn)生熱滯效應(yīng)，使植物在一定程度上免受冰晶造成的物理損傷，提高植物的耐低溫性。過表達(dá)榴蓮脫水素基因的擬南芥經(jīng)低溫處理，發(fā)現(xiàn)脫水素可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒性。將梅花脫水素基因轉(zhuǎn)入煙草后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草的葉片相對含水量、可溶性糖含量都明顯升高，抗寒性也隨之升高。Hincha認(rèn)為脫水素對一些關(guān)鍵酶產(chǎn)生的保護(hù)作用與它本質(zhì)上無規(guī)則的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，脫水素維持酶的活性有兩個可能：（1）依賴其不規(guī)則的結(jié)構(gòu)形成物理障礙，阻礙蛋白質(zhì)的聚集變性；（2）脫水素可以防止蛋白質(zhì)錯誤折疊從而維持酶活性。Sánchez 等從仙人掌中分離得到一個SK3 型脫水素基因，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)產(chǎn)物在植物體內(nèi)可以自身相互作用，K 片段與富含組氨酸的基序在自身互作中起著關(guān)鍵性作用。脫水素分子量大小與其對乳酸脫氫酶的保護(hù)能力呈正相關(guān)。葡萄中的脫水素基因比較少，共分離出4種 并 命 名 為、、、，其 中受低溫、高溫、干旱和白粉病誘導(dǎo)表達(dá)，受高溫、低溫誘導(dǎo)表達(dá)，后兩者僅在胚胎發(fā)育后期的種子中表達(dá)。

2.2.2 DNA結(jié)合單鋅指蛋白基因

DNA 結(jié)合單鋅指（DNA binding with one zinc finger，Dof）蛋白是植物中特有的一類蛋白，單鋅指結(jié)構(gòu)由4個半胱氨酸與一個鋅離子結(jié)合組成。

該蛋白一般由200～400個氨基酸組成，N末端是52 個氨基酸組成的具有保守性的功能結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合DNA 及蛋白質(zhì)以相互作用；C 末端含有不保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控域，賦予Dof 蛋白多樣性。AAAG 基序是Dof 蛋白結(jié)合域的核心結(jié)合位點(diǎn)，Dof 蛋白還會與細(xì)胞內(nèi)的可與DNA 結(jié)合的未磷酸化的HMG 蛋白互作，增加Dof 蛋白的結(jié)合能力。Dof 蛋白還參與植物中的種子萌發(fā)、碳氮代謝、開花調(diào)控及光調(diào)節(jié)等。Zhang 等從蘋果中分離出60 個Dof 蛋白基因，大多數(shù)響應(yīng)低溫脅迫。Dof 蛋白是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，Su 等發(fā)現(xiàn)，GhDof 在低溫條件下可被誘導(dǎo)表達(dá)，并提高細(xì)胞內(nèi)、、基因的表達(dá)及種子含油量；Ma等發(fā)現(xiàn)白菜基因在低溫條件下被上調(diào)；李成慧在葡萄當(dāng)中鑒定出25 個基因，其中11 個基因參與響應(yīng)生物和非生物脅迫；代偉娜發(fā)現(xiàn)基因響應(yīng)激素誘導(dǎo)，對MeJA 響應(yīng)最為明顯，MeJA 通常與植物抵御病蟲害等生物脅迫息息相關(guān)。

2.2.3 泛素/26S蛋白酶體基因

泛素是一類由76 個氨基酸組成的高度保守的小分子蛋白質(zhì)。N 端的1 個甲硫氨酸及7 個賴氨酸可以與其他泛素分子結(jié)合形成泛素鏈以調(diào)節(jié)生物體不同的生命活動。泛素/26S 蛋白酶體系是真核生物體內(nèi)降解蛋白的有效途徑，可降解生物體內(nèi)80%～85%的蛋白質(zhì)。該體系包含泛素、泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）、泛素連接酶（E3）、蛋白酶體。泛素在有ATP 供應(yīng)下被E1 激活，隨即與E2 結(jié)合形成E2-泛素結(jié)合體，再與E3 連接并將泛素直接或間接轉(zhuǎn)移到蛋白上，使蛋白泛素化以被蛋白酶體識別并降解。泛素連接酶可被分為四類：U-box、HECT、RING 和F-box，前三者屬于單亞基類，后者屬于多亞基類。U-box 與RING 相似度較高，二者較明顯的區(qū)別在于U-box 類連接酶靠鹽橋和氫鍵維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，RING 類連接酶靠半胱氨酸和鋅離子構(gòu)成的鋅指結(jié)構(gòu)維持穩(wěn)定性。Ubox 擁有4 類結(jié)構(gòu)域：ARM、Ser/Thr kinase、WD40和MIF4G。ARM 位于U-box 類型泛素連接酶的C末端，可與其他蛋白互作。Yao 等發(fā)現(xiàn)中國野生華東葡萄泛素連接酶基因經(jīng)低溫誘導(dǎo)后在葡萄原生質(zhì)體中大量表達(dá)，通過酵母雙雜技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與互作，低溫條件下促進(jìn)VpICE1 蛋白積累，抑制VpHOS1 蛋白對VpICE1 蛋白的降解作用。在過表達(dá)的擬南芥中，低溫處理后經(jīng)RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)不止該基因上調(diào)，與低溫脅迫有關(guān)的、、等基因也被上調(diào)。另一種U-box 類E3 泛素連接酶從左山一號被分離出并被命名為，該基因在低溫條件下在各個組織中大量表達(dá)，在擬南芥中過表達(dá)該基因后，發(fā)現(xiàn)與低溫相關(guān)的/、/及等冷相關(guān)基因被上調(diào)，但/基因被下調(diào)，該現(xiàn)象說明響應(yīng)低溫脅迫的同時也會影響其他冷相關(guān)基因的表達(dá)。

3 總結(jié)與展望

提高歐洲葡萄抗寒性的方法多種多樣，具體可劃分為兩類：（1）改變葡萄生存的外部環(huán)境；（2）研究抗寒相關(guān)基因，并通過基因工程的手段改變葡萄自身以適應(yīng)不利生存條件。本文闡述重要抗寒調(diào)控基因和抗寒功能基因的功能及其對植物抗寒性的影響，為研究葡萄抗寒基因并定向改良葡萄抗寒性提供參考。ICEs 類轉(zhuǎn)錄因子在遭受低溫脅迫時率先表達(dá)，作為一種“誘導(dǎo)劑”誘導(dǎo)CBFs 類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，最終該類型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到抗寒相關(guān)基因啟動子區(qū)域的順式作用元件CRT/DRE 上啟動下游基因表達(dá)。脫水素基因表達(dá)的蛋白主要對細(xì)胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)起到保護(hù)作用，起到分子伴侶的功能，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵酶的活性，保護(hù)能力與脫水素的大小呈正相關(guān)關(guān)系；單鋅指蛋白在植物遭受低溫脅迫時，通過調(diào)節(jié)光合作用合成生命活動所必需的物質(zhì)；泛素/26S 蛋白酶體則通過降解蛋白以維持細(xì)胞內(nèi)與抗寒相關(guān)蛋白的含量，提高植物抗寒性。三個類型的基因在低溫條件下都會引起其他大部分冷相關(guān)基因上調(diào)及小部分基因下調(diào)，說明基因的表達(dá)受到一系列小分子/大分子物質(zhì)調(diào)控。目前國內(nèi)外還存在抗寒基因及表達(dá)方式認(rèn)知不足的問題，因此我們還需不斷挖掘抗寒基因，探索它們的表達(dá)方式以緩解低溫給植物生長造成的壓力。