陳柔含,韓奕奕,馬穎清,劉 洋,豐東升
上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心曁農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(上海),上海 201708
牛乳鐵蛋白(Bovine Lactoferrin,bLF)是牛初乳中非常重要的鐵結(jié)合型大分子糖蛋白,其分子量為78~80 kDa。由于其氨基酸序列中含有大量的精氨酸與賴氨酸,故其等電點(diǎn)在7.8~8.2,是一種呈堿性的蛋白質(zhì)[1],主要由動(dòng)物的乳腺上皮細(xì)胞分泌及表達(dá)。乳鐵蛋白(LF)與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存密切相關(guān),且對(duì)免疫功能系統(tǒng)的調(diào)節(jié)具有正向作用,同時(shí)擁有廣譜抗菌性、抗病毒、抗癌、抗氧化等強(qiáng)大的生物功能,因此被媒體報(bào)道為“奶黃金”。在自然界中,人的母乳中LF的含量較高,在1.0~3.0 mg/mL的范圍內(nèi)[2],而牛初乳中的含量相對(duì)較低。因此商業(yè)上很多乳品企業(yè)通常會(huì)在乳基的嬰幼兒配方食品中添加營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑LF,使其營(yíng)養(yǎng)成分更接近于母乳。國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)2004年第6號(hào)公告首次將LF作為新型食品添加劑,并規(guī)定了適用范圍,且設(shè)定了最大使用量。《GB 14880—2012 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》于2012年3月30日推行,其中明確指出LF可作為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑,可在乳制品及嬰幼兒配方食品中進(jìn)行強(qiáng)化,并規(guī)定其最高使用量不超過(guò)1.0 g/kg。市場(chǎng)上也廣泛存在含bLF強(qiáng)化劑的調(diào)制乳、發(fā)酵乳及含乳飲料等產(chǎn)品。
我國(guó)目前尚未出臺(tái)食品中bLF測(cè)定相關(guān)的國(guó)家級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。2019年天津奶業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布了團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《T/TDSTIA 006—2019 奶及奶制品中乳鐵蛋白的測(cè)定液相色譜法》,中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)于2021年頒布了《T/CIFST 006—2021 食品中乳鐵蛋白的測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附法》,檢測(cè)方法的空缺和檢測(cè)結(jié)果的不一致性仍是限制bLF作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑應(yīng)用和推廣的主要技術(shù)瓶頸。同時(shí),據(jù)有關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道,測(cè)定食品中bLF含量的方法除了上述提及的酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)[3~5]和液相色譜(LC)[6~9],還有十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)[10]、毛細(xì)管電泳技術(shù)(HPCE)[11~14]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[15~17]等。ELISA法盡管步驟簡(jiǎn)單,但靈敏度偏低、重現(xiàn)性較差,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。蛋白質(zhì)的分析常常會(huì)用到SDS-PAGE進(jìn)行條帶分離,但操作復(fù)雜,耗時(shí)久,相鄰組分的條帶其界面存在混淆不清的現(xiàn)象,難以獲得令人滿意的重復(fù)性。HPCE則是包括電泳分離與色譜光譜交叉的新型液相微分離技術(shù),快速且靈敏,但易受毛細(xì)管與電壓等條件的限制導(dǎo)致重現(xiàn)性較差;LC法采用不同的前處理方法溶解、除雜、純化LF,結(jié)果準(zhǔn)確,重現(xiàn)性較好。據(jù)報(bào)道,肝素具有已知生物大分子的最高負(fù)電荷密度,因此對(duì)各種蛋白質(zhì)(包括LF)具有很高的特異結(jié)合能力,但對(duì)β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和血清白蛋白沒有很高的結(jié)合親和力[18]。不少液相方法的前處理提取純化都是采用肝素親和柱,簡(jiǎn)單方便。LC-MS/MS法兼具色譜分離復(fù)雜樣品的能力與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度及精確確證等優(yōu)點(diǎn),在LF的檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用[19]。該法測(cè)定bLF基于蛋白質(zhì)組學(xué)的原理,建立在“蛋白-特征肽段”間穩(wěn)定的轉(zhuǎn)換,通過(guò)胰蛋白酶將蛋白質(zhì)酶解后產(chǎn)物即肽段,通過(guò)色譜分離、質(zhì)譜檢測(cè)產(chǎn)生的信號(hào),轉(zhuǎn)換信號(hào)為肽段濃度,反推計(jì)算出蛋白質(zhì)濃度[20]。
本文擬通過(guò)對(duì)比高效液相色譜(H i g h Performance Liquid Chromatography,HPLC)法和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry,UPLC- MS/MS)法兩種不同原理的檢測(cè)方法,測(cè)定乳與乳制品中bLF的含量,探討兩種方法差異及優(yōu)缺點(diǎn),以期對(duì)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)研究人員提供技術(shù)參考和數(shù)據(jù)支持。
Hi TrapTM Heparin HP肝素親和柱(1mL),美國(guó)Cytiva公司;塑料離心管(50 mL/15 mL),CNW,美國(guó);低蛋白吸附槍頭(0.1 mL/1 mL),德國(guó)Brand公司;低蛋白吸附離心管(1.5 mL),德國(guó)Eppendorf公司;低蛋白吸附進(jìn)樣瓶,德國(guó)CNW公司;低蛋白吸附濾膜(0.22 μm),美國(guó)CNW公司。
氯化鈉(NaCl,≥99%)、磷酸(H3PO4,≥99%)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4,≥99%)、碳酸氫銨(NH4HCO3,≥99%)、二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT,≥99%)、碘代乙酰胺(Iodoacetamide,IAA,≥99%),美國(guó)默克公司;牛胰蛋白酶(測(cè)序級(jí)),美國(guó)Promega公司;三氟乙酸(CF3CO2H,≥99%)、乙腈(CH3CN,≥99%,色譜純)、甲酸(HCOOH,≥98%,色譜純),美國(guó)Fluka公司;bLF(≥98%),美國(guó)Sigma公司,取0.002 g溶于10 mL水中配制成200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲(chǔ)備液;內(nèi)標(biāo)肽段VDSAL(13C9,15N)YLGSR,上海吉爾生化有限公司,用水配制成濃度50 μg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液;雞蛋蛋清蛋白粉、奶粉、調(diào)制乳、含乳飲料(市售)。
高效液相色譜儀(Agilent 1260,配有紫外檢測(cè)器),美國(guó)Agilent公司;超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀:超高效液相色譜(Acquity HClass UPLC),美國(guó)Waters公司;三重四極桿質(zhì)譜(Triple QuadTM 6500),美國(guó)SCIEX公司;天平(萬(wàn)分之一)、pH計(jì),美國(guó)Metteler公司;冷凍離心機(jī)(Thermo Heraeus X1R),小型冷凍離心機(jī)(Thermo Fresco 21),渦旋振蕩器,美國(guó)Thermo公司;振蕩水浴鍋(DRHH-D6),常州丹瑞公司;Millipore超純水系統(tǒng),美國(guó)Millipore公司。
1.3.1 HPLC法
(1) 樣品提取
固體及半固體樣品:稱取5 g(精確至0.01 g)試樣于燒杯中,加預(yù)熱過(guò)(溫度低于50 ℃)的磷酸氫二鈉溶液(0.20 mol/L),攪拌溶解樣品,分次將樣品轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,用磷酸氫二鈉溶液(0.20 mol/L)定容,渦旋混勻后轉(zhuǎn)移至塑料離心管中,4 ℃,10 000 r/min離心10 min,取中間層澄清樣液待凈化。
液體樣品:稱取5 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL塑料離心管中,加入適量磷酸氫二鈉溶液(0.20 mol/L)混勻,將樣品轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,分次用磷酸氫二鈉溶液(0.20 mol/L)將離心管管壁沖洗干凈轉(zhuǎn)入容量瓶中,并定容,充分混勻后轉(zhuǎn)入離心管,4 ℃,10 000 r/min離心10 min,取中間層澄清樣液待凈化。
(2) 樣品凈化
肝素親和柱凈化前,先加入5.0 mL磷酸氫二鈉溶液(0.20 mol/L)平衡。隨后,準(zhǔn)確移取10.0 mL樣液,加入肝素柱,控制樣液緩慢穩(wěn)定下滴,避免由于樣液流出過(guò)快,導(dǎo)致目標(biāo)物無(wú)法和肝素柱有效結(jié)合。待液面下降至柱填充物的上平面時(shí),用10.0 mL磷酸氫二鈉溶液(0.20 mol/L)淋洗雜質(zhì),棄去所有液體,并排空柱內(nèi)液體。緊接著,用5.0 mL磷酸氫二鈉(50 mmol/L)-氯化鈉(1 mol/L)緩沖溶液對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行洗脫,收集全部流出液,用磷酸氫二鈉(50 mmol/L)-氯化鈉(1 mol/L)緩沖溶液定容至5.00 mL,過(guò)膜,供HPLC檢測(cè)分析。
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
用磷酸氫二鈉(50 mmol/L)-氯化鈉(1 mol/L)緩沖溶液逐級(jí)稀釋定容LF儲(chǔ)備液,配制成LF濃度分別為0.010 mg/mL、0.020 mg/mL、0.050 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20mg/mL和0.50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液,供儀器檢測(cè)。
(4) HPLC條件
采用Agilent-C4 反相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,Agilent 美國(guó))。流動(dòng)相A為0.1%(v/v)三氟乙酸水溶液,流動(dòng)相B為純乙腈。洗脫梯度如下:0~20 min,85%~15% A;20~22 min,15%~85% A;22~25 min,85% A。流速:1.0 mL/min。進(jìn)樣體積:50 μL;柱溫:30 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。
1.3.2 UPLC-MS/MS法
(1)樣品溶解
固體樣品:稱取1 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL塑料離心管,加入適量溫?zé)岬乃M(jìn)行溶解,待冷卻后,分次將樣品轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶,準(zhǔn)確定容,充分混勻后轉(zhuǎn)入離心管。
半固體及液體樣品:無(wú)需溶解處理。
(2) 樣品酶解
吸取200 μL樣液于1.5 mL離心管中,添加LF同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液50 μL,再加150 μL100 mmol/L的NH4HCO3溶液,混勻后,加入10 μL二硫蘇糖醇(500 mmol/L),混勻。在57 ℃下恒溫水浴振蕩1 h。取出冷卻至室溫,加入30 μL 500 mmol/L的碘代乙酰胺,暗處?kù)o置0.5 h,加入50 μL 400 μg/mL的牛胰蛋白酶溶液,渦旋混勻后置于37 ℃恒溫水浴酶解至少10 h。取出后加入10 μL甲酸使反應(yīng)終止,于室溫下靜置30 min,隨后用水定容至1.0 mL,混勻后于12 000 r/min下離心15 min,移取上清液,或過(guò)0.22 μm濾膜,供超UPLC-MS/MS檢測(cè)。
(3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
以雞蛋清蛋白粉作為空白基質(zhì),將標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋至1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL,每個(gè)濃度溶液中加入50 μL同位素內(nèi)標(biāo),酶解后供儀器檢測(cè)。
(4) UPLC-MS/MS條件
色譜條件:采用UPLC peptide BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,300 ■,Waters,美國(guó));流動(dòng)相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動(dòng)相B為純乙腈;流速:0.3 mL/min。洗脫梯度程序:0~0.5 min,95%A;0.5~4.5 min, 95%~30%A;4.5~5.5 min,30% A;5.5~6.0min, 30%~95%A;6.0~8.0 min,95%A。柱溫:40 ℃。進(jìn)樣體積:10 μL。
質(zhì)譜條件:電噴霧ESI源,正離子模式;離子化電壓(IS):5 500 V;噴撞氣(CAD):Medium;氣簾氣(CUR):30 psi;溫度(TEM):550 ℃;噴霧氣(GS1):55 psi; 輔助加熱氣(GS2):55 psi。質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù):特征肽段定量離子對(duì)m/z 540.6>595.3,定性離子對(duì)m/z 540.6>319.3,內(nèi)標(biāo)肽段定量離子對(duì) m/z 547.5>602.3,定性離子對(duì)m/z 547.5>319.3。
選取不同的乳及乳制品作為添加回收的基質(zhì)??紤]到bLF是營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑,參考了實(shí)際樣品中目標(biāo)物的含量范圍選擇不同的添加濃度水平。其中生鮮乳選擇0.005 mg/kg、0.01 mg/kg、0.05 mg/kg三個(gè)濃度水平,調(diào)制乳和含乳飲料選擇0.01 mg/kg、
0.02 mg/kg、0.1 mg/kg,奶粉選擇添加三個(gè)濃度水平的bLF:0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.5 mg/kg,分別加入至不同樣品基質(zhì)中。采用HPLC法和UPLC-MS/MS法進(jìn)行測(cè)定分析,每種濃度測(cè)6 次。檢測(cè)結(jié)果見表1。結(jié)果表明,兩種方法從方法學(xué)上均能提供有效、準(zhǔn)確的定量結(jié)果。其中,HPLC法平均回收率在89.27%~106.83%之間,精密度≤9.71%;UPLC-MS/MS法平均回收率在89.37%~102.77%之間,精密度≤8.45%。
表1 方法準(zhǔn)確度和精密度(n=6)
采用HPLC法和UPLC-MS/MS法分別測(cè)定4批次生鮮乳、3批次調(diào)制乳、7批次奶粉、3批次巴氏殺菌乳、2批新型巴氏殺菌乳(ESL)和7批次超高溫瞬時(shí)滅菌乳(UHT)中bLF的含量,每批樣品都進(jìn)行2個(gè)平行樣的測(cè)定,檢測(cè)結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明,兩種方法在定量生鮮乳中bLF含量的差異性較??;在定量調(diào)制乳、UHT乳和ESL乳等經(jīng)高溫殺菌過(guò)的液態(tài)奶中bLF含量存在一定差異,UPLC-MS/MS法定量結(jié)果高于HPLC法;在定量奶粉中bLF含量上,HPLC法測(cè)定奶粉的結(jié)果與標(biāo)簽明示值相似,也就是說(shuō),液相方法更接近理論添加值,而UPLC-MS/MS法偏高。這主要原因,歸結(jié)于在HPLC法中,前處理是采用肝素親和柱提取、純化和富集樣品中目標(biāo)物質(zhì)。肝素親和柱以肝素作為配體,共價(jià)偶聯(lián)瓊脂糖形成固定相填料。肝素是由己糖醛酸與D-葡糖胺殘疾相互交聯(lián)形成的一種硫酸化的糖胺聚糖。由于肝素中大部分基團(tuán)高度硫化[21],呈酸性的多陰離子結(jié)構(gòu),因此陰電密度特別高。肝素可作為一方面可以作為親和配體,具有族特異性親和作用,可通過(guò)糖苷鍵與LF發(fā)生相互作用;另一方面由于肝素表面的硫酸基團(tuán),具備大量負(fù)電荷,可與帶正電的蛋白質(zhì)發(fā)生離子結(jié)合,從而對(duì)LF具備高選擇性[22]。LF作為一種結(jié)構(gòu)糖蛋白,在適當(dāng)?shù)木彌_溶液條件下,可以通過(guò)親和層析結(jié)合肝素,通過(guò)磷酸鹽淋洗和鹽溶液洗脫,實(shí)現(xiàn)LF的分離[23,24]。UPLC-MS/MS法測(cè)定bLF則是將LF通過(guò)胰蛋白酶酶解為肽段,在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行肽鑒定進(jìn)而選擇bLF特征性肽段,經(jīng)過(guò)質(zhì)譜精確確證,實(shí)現(xiàn)“蛋白-肽段-蛋白”的定量轉(zhuǎn)換[25]。
表2 不同方法檢測(cè)乳及乳制品中bLF的含量(n=2)
為考察兩個(gè)方法差異性來(lái)源,選取5 種不同基質(zhì),包括生鮮乳、巴氏殺菌乳、ESL乳、UHT乳和奶粉,將HPLC法中過(guò)肝素親和柱后棄去的液體用UPLC-MS/MS法經(jīng)酶解處理后上機(jī),得到結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明,HPLC法的測(cè)定結(jié)果與過(guò)肝素柱后棄去液的結(jié)果加和,約等于UPLC-MS/MS法的測(cè)定結(jié)果。值得注意的是,未經(jīng)熱加工處理的生鮮乳經(jīng)肝素柱凈化后,棄去液中不含bLF,這表明熱加工處理會(huì)導(dǎo)致bLF和肝素親和柱的結(jié)合效果。然而,熱處理只會(huì)破壞bLF中蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu),導(dǎo)致部分活性功能的喪失,但不會(huì)破壞蛋白質(zhì)的氨基酸組成,因此對(duì)UPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。
表3 兩種方法差異性來(lái)源考察(n=2)
對(duì)比了HPLC法及UPLC-MS/MS法檢測(cè)乳及乳制品中的bLF,兩種方法回收率高、重現(xiàn)性好,均能提供準(zhǔn)確、精確的測(cè)定結(jié)果,滿足乳與乳制品中bLF的定量檢測(cè)需求,但兩者方法測(cè)定結(jié)果具有一定差異性?;贖PLC法測(cè)定乳及乳制品中bLF的含量,是通過(guò)肝素親和柱純化富集,獲得非熱變性bLF的含量;基于UPLC-MS/MS法測(cè)定bLF的含量,通過(guò)將大分子蛋白酶解獲得肽段,針對(duì)特征性肽段,建立內(nèi)標(biāo)法測(cè)定熱變性和非熱變性bLF白的含量,不受熱處理加工工藝的影響。可針對(duì)不同檢測(cè)目的選擇不同方法進(jìn)行定量研究。