乳及乳制品中牛乳鐵蛋白含量測定方法比較研究

陳柔含，韓奕奕，馬穎清，劉 洋，豐東升

上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心曁農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（上海），上海 201708

0 引言

牛乳鐵蛋白（Bovine Lactoferrin，bLF）是牛初乳中非常重要的鐵結(jié)合型大分子糖蛋白，其分子量為78～80 kDa。由于其氨基酸序列中含有大量的精氨酸與賴氨酸，故其等電點在7.8～8.2，是一種呈堿性的蛋白質(zhì)[1]，主要由動物的乳腺上皮細胞分泌及表達。乳鐵蛋白（LF）與鐵轉(zhuǎn)運和儲存密切相關(guān)，且對免疫功能系統(tǒng)的調(diào)節(jié)具有正向作用，同時擁有廣譜抗菌性、抗病毒、抗癌、抗氧化等強大的生物功能，因此被媒體報道為“奶黃金”。在自然界中，人的母乳中LF的含量較高，在1.0～3.0 mg/mL的范圍內(nèi)[2]，而牛初乳中的含量相對較低。因此商業(yè)上很多乳品企業(yè)通常會在乳基的嬰幼兒配方食品中添加營養(yǎng)強化劑LF，使其營養(yǎng)成分更接近于母乳。國家衛(wèi)生和計劃生育委員會2004年第6號公告首次將LF作為新型食品添加劑，并規(guī)定了適用范圍，且設(shè)定了最大使用量?！禛B 14880—2012 食品安全國家標準 食品營養(yǎng)強化劑使用標準》于2012年3月30日推行，其中明確指出LF可作為食品營養(yǎng)強化劑，可在乳制品及嬰幼兒配方食品中進行強化，并規(guī)定其最高使用量不超過1.0 g/kg。市場上也廣泛存在含bLF強化劑的調(diào)制乳、發(fā)酵乳及含乳飲料等產(chǎn)品。

我國目前尚未出臺食品中bLF測定相關(guān)的國家級標準。2019年天津奶業(yè)協(xié)會發(fā)布了團體標準《T/TDSTIA 006—2019 奶及奶制品中乳鐵蛋白的測定液相色譜法》，中國食品科學技術(shù)學會于2021年頒布了《T/CIFST 006—2021 食品中乳鐵蛋白的測定酶聯(lián)免疫吸附法》，檢測方法的空缺和檢測結(jié)果的不一致性仍是限制bLF作為營養(yǎng)強化劑應用和推廣的主要技術(shù)瓶頸。同時，據(jù)有關(guān)的文獻報道，測定食品中bLF含量的方法除了上述提及的酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA）[3～5]和液相色譜（LC）[6～9]，還有十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）[10]、毛細管電泳技術(shù)（HPCE）[11～14]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[15～17]等。ELISA法盡管步驟簡單，但靈敏度偏低、重現(xiàn)性較差，容易出現(xiàn)假陽性。蛋白質(zhì)的分析常常會用到SDS-PAGE進行條帶分離，但操作復雜，耗時久，相鄰組分的條帶其界面存在混淆不清的現(xiàn)象，難以獲得令人滿意的重復性。HPCE則是包括電泳分離與色譜光譜交叉的新型液相微分離技術(shù)，快速且靈敏，但易受毛細管與電壓等條件的限制導致重現(xiàn)性較差；LC法采用不同的前處理方法溶解、除雜、純化LF，結(jié)果準確，重現(xiàn)性較好。據(jù)報道，肝素具有已知生物大分子的最高負電荷密度，因此對各種蛋白質(zhì)（包括LF）具有很高的特異結(jié)合能力，但對β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和血清白蛋白沒有很高的結(jié)合親和力[18]。不少液相方法的前處理提取純化都是采用肝素親和柱，簡單方便。LC-MS/MS法兼具色譜分離復雜樣品的能力與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度及精確確證等優(yōu)點，在LF的檢測中得到廣泛的應用[19]。該法測定bLF基于蛋白質(zhì)組學的原理，建立在“蛋白-特征肽段”間穩(wěn)定的轉(zhuǎn)換，通過胰蛋白酶將蛋白質(zhì)酶解后產(chǎn)物即肽段，通過色譜分離、質(zhì)譜檢測產(chǎn)生的信號，轉(zhuǎn)換信號為肽段濃度，反推計算出蛋白質(zhì)濃度[20]。

本文擬通過對比高效液相色譜（H i g h Performance Liquid Chromatography，HPLC）法和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC- MS/MS）法兩種不同原理的檢測方法，測定乳與乳制品中bLF的含量，探討兩種方法差異及優(yōu)缺點，以期對食品安全國家標準及相關(guān)研究人員提供技術(shù)參考和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Hi TrapTM Heparin HP肝素親和柱（1mL），美國Cytiva公司；塑料離心管（50 mL/15 mL），CNW，美國；低蛋白吸附槍頭（0.1 mL/1 mL），德國Brand公司；低蛋白吸附離心管（1.5 mL），德國Eppendorf公司；低蛋白吸附進樣瓶，德國CNW公司；低蛋白吸附濾膜（0.22 μm），美國CNW公司。

氯化鈉（NaCl，≥99%）、磷酸（H3PO4，≥99%）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4，≥99%）、碳酸氫銨（NH4HCO3，≥99%）、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT，≥99%）、碘代乙酰胺（Iodoacetamide，IAA，≥99%），美國默克公司；牛胰蛋白酶（測序級），美國Promega公司；三氟乙酸（CF3CO2H，≥99%）、乙腈（CH3CN，≥99%，色譜純）、甲酸（HCOOH，≥98%，色譜純），美國Fluka公司；bLF（≥98%），美國Sigma公司，取0.002 g溶于10 mL水中配制成200 μg/mL標準蛋白儲備液；內(nèi)標肽段VDSAL（13C9，15N）YLGSR，上海吉爾生化有限公司，用水配制成濃度50 μg/mL的內(nèi)標標準工作液；雞蛋蛋清蛋白粉、奶粉、調(diào)制乳、含乳飲料（市售）。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Agilent 1260，配有紫外檢測器），美國Agilent公司；超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：超高效液相色譜（Acquity HClass UPLC），美國Waters公司；三重四極桿質(zhì)譜（Triple QuadTM 6500），美國SCIEX公司；天平（萬分之一）、pH計，美國Metteler公司；冷凍離心機（Thermo Heraeus X1R），小型冷凍離心機（Thermo Fresco 21），渦旋振蕩器，美國Thermo公司；振蕩水浴鍋（DRHH-D6），常州丹瑞公司；Millipore超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 HPLC法

（1） 樣品提取

固體及半固體樣品：稱取5 g（精確至0.01 g）試樣于燒杯中，加預熱過（溫度低于50 ℃）的磷酸氫二鈉溶液（0.20 mol/L），攪拌溶解樣品，分次將樣品轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用磷酸氫二鈉溶液（0.20 mol/L）定容，渦旋混勻后轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，取中間層澄清樣液待凈化。

液體樣品：稱取5 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL塑料離心管中，加入適量磷酸氫二鈉溶液（0.20 mol/L）混勻，將樣品轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，分次用磷酸氫二鈉溶液（0.20 mol/L）將離心管管壁沖洗干凈轉(zhuǎn)入容量瓶中，并定容，充分混勻后轉(zhuǎn)入離心管，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，取中間層澄清樣液待凈化。

（2） 樣品凈化

肝素親和柱凈化前，先加入5.0 mL磷酸氫二鈉溶液（0.20 mol/L）平衡。隨后，準確移取10.0 mL樣液，加入肝素柱，控制樣液緩慢穩(wěn)定下滴，避免由于樣液流出過快，導致目標物無法和肝素柱有效結(jié)合。待液面下降至柱填充物的上平面時，用10.0 mL磷酸氫二鈉溶液（0.20 mol/L）淋洗雜質(zhì)，棄去所有液體，并排空柱內(nèi)液體。緊接著，用5.0 mL磷酸氫二鈉（50 mmol/L）-氯化鈉（1 mol/L）緩沖溶液對目標物進行洗脫，收集全部流出液，用磷酸氫二鈉（50 mmol/L）-氯化鈉（1 mol/L）緩沖溶液定容至5.00 mL，過膜，供HPLC檢測分析。

（3）標準曲線制備

用磷酸氫二鈉（50 mmol/L）-氯化鈉（1 mol/L）緩沖溶液逐級稀釋定容LF儲備液，配制成LF濃度分別為0.010 mg/mL、0.020 mg/mL、0.050 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20mg/mL和0.50 mg/mL的標準工作液，供儀器檢測。

（4） HPLC條件

采用Agilent-C4 反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent 美國）。流動相A為0.1%（v/v）三氟乙酸水溶液，流動相B為純乙腈。洗脫梯度如下：0～20 min，85%～15% A；20～22 min，15%～85% A；22～25 min，85% A。流速：1.0 mL/min。進樣體積：50 μL；柱溫：30 ℃。檢測波長：280 nm。

1.3.2 UPLC-MS/MS法

（1）樣品溶解

固體樣品：稱取1 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL塑料離心管，加入適量溫熱的水進行溶解，待冷卻后，分次將樣品轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，準確定容，充分混勻后轉(zhuǎn)入離心管。

半固體及液體樣品：無需溶解處理。

（2） 樣品酶解

吸取200 μL樣液于1.5 mL離心管中，添加LF同位素內(nèi)標工作溶液50 μL，再加150 μL100 mmol/L的NH4HCO3溶液，混勻后，加入10 μL二硫蘇糖醇（500 mmol/L），混勻。在57 ℃下恒溫水浴振蕩1 h。取出冷卻至室溫，加入30 μL 500 mmol/L的碘代乙酰胺，暗處靜置0.5 h，加入50 μL 400 μg/mL的牛胰蛋白酶溶液，渦旋混勻后置于37 ℃恒溫水浴酶解至少10 h。取出后加入10 μL甲酸使反應終止，于室溫下靜置30 min，隨后用水定容至1.0 mL，混勻后于12 000 r/min下離心15 min，移取上清液，或過0.22 μm濾膜，供超UPLC-MS/MS檢測。

（3） 標準曲線制備

以雞蛋清蛋白粉作為空白基質(zhì)，將標準蛋白儲備液逐級稀釋至1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，每個濃度溶液中加入50 μL同位素內(nèi)標，酶解后供儀器檢測。

（4） UPLC-MS/MS條件

色譜條件：采用UPLC peptide BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，300 ■，Waters，美國）；流動相A為0.1%（v/v）甲酸水溶液，流動相B為純乙腈；流速：0.3 mL/min。洗脫梯度程序：0～0.5 min，95%A；0.5～4.5 min， 95%～30%A；4.5～5.5 min，30% A；5.5～6.0min， 30%～95%A；6.0～8.0 min，95%A。柱溫：40 ℃。進樣體積：10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧ESI源，正離子模式；離子化電壓（IS）：5 500 V；噴撞氣（CAD）：Medium；氣簾氣（CUR）：30 psi；溫度（TEM）：550 ℃；噴霧氣（GS1）：55 psi； 輔助加熱氣（GS2）：55 psi。質(zhì)譜檢測參數(shù)：特征肽段定量離子對m/z 540.6＞595.3，定性離子對m/z 540.6＞319.3，內(nèi)標肽段定量離子對 m/z 547.5＞602.3，定性離子對m/z 547.5＞319.3。

2 結(jié)果與討論

2.1 準確度和精密度試驗結(jié)果

選取不同的乳及乳制品作為添加回收的基質(zhì)。考慮到bLF是營養(yǎng)強化劑，參考了實際樣品中目標物的含量范圍選擇不同的添加濃度水平。其中生鮮乳選擇0.005 mg/kg、0.01 mg/kg、0.05 mg/kg三個濃度水平，調(diào)制乳和含乳飲料選擇0.01 mg/kg、

0.02 mg/kg、0.1 mg/kg，奶粉選擇添加三個濃度水平的bLF：0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.5 mg/kg，分別加入至不同樣品基質(zhì)中。采用HPLC法和UPLC-MS/MS法進行測定分析，每種濃度測6 次。檢測結(jié)果見表1。結(jié)果表明，兩種方法從方法學上均能提供有效、準確的定量結(jié)果。其中，HPLC法平均回收率在89.27%～106.83%之間，精密度≤9.71%；UPLC-MS/MS法平均回收率在89.37%～102.77%之間，精密度≤8.45%。

表1 方法準確度和精密度（n=6）

2.2 實際樣品測定結(jié)果

采用HPLC法和UPLC-MS/MS法分別測定4批次生鮮乳、3批次調(diào)制乳、7批次奶粉、3批次巴氏殺菌乳、2批新型巴氏殺菌乳（ESL）和7批次超高溫瞬時滅菌乳（UHT）中bLF的含量，每批樣品都進行2個平行樣的測定，檢測結(jié)果見表2。試驗結(jié)果表明，兩種方法在定量生鮮乳中bLF含量的差異性較??；在定量調(diào)制乳、UHT乳和ESL乳等經(jīng)高溫殺菌過的液態(tài)奶中bLF含量存在一定差異，UPLC-MS/MS法定量結(jié)果高于HPLC法；在定量奶粉中bLF含量上，HPLC法測定奶粉的結(jié)果與標簽明示值相似，也就是說，液相方法更接近理論添加值，而UPLC-MS/MS法偏高。這主要原因，歸結(jié)于在HPLC法中，前處理是采用肝素親和柱提取、純化和富集樣品中目標物質(zhì)。肝素親和柱以肝素作為配體，共價偶聯(lián)瓊脂糖形成固定相填料。肝素是由己糖醛酸與D-葡糖胺殘疾相互交聯(lián)形成的一種硫酸化的糖胺聚糖。由于肝素中大部分基團高度硫化[21]，呈酸性的多陰離子結(jié)構(gòu)，因此陰電密度特別高。肝素可作為一方面可以作為親和配體，具有族特異性親和作用，可通過糖苷鍵與LF發(fā)生相互作用；另一方面由于肝素表面的硫酸基團，具備大量負電荷，可與帶正電的蛋白質(zhì)發(fā)生離子結(jié)合，從而對LF具備高選擇性[22]。LF作為一種結(jié)構(gòu)糖蛋白，在適當?shù)木彌_溶液條件下，可以通過親和層析結(jié)合肝素，通過磷酸鹽淋洗和鹽溶液洗脫，實現(xiàn)LF的分離[23，24]。UPLC-MS/MS法測定bLF則是將LF通過胰蛋白酶酶解為肽段，在數(shù)據(jù)庫中進行肽鑒定進而選擇bLF特征性肽段，經(jīng)過質(zhì)譜精確確證，實現(xiàn)“蛋白-肽段-蛋白”的定量轉(zhuǎn)換[25]。

表2 不同方法檢測乳及乳制品中bLF的含量（n=2）

為考察兩個方法差異性來源，選取5 種不同基質(zhì)，包括生鮮乳、巴氏殺菌乳、ESL乳、UHT乳和奶粉，將HPLC法中過肝素親和柱后棄去的液體用UPLC-MS/MS法經(jīng)酶解處理后上機，得到結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，HPLC法的測定結(jié)果與過肝素柱后棄去液的結(jié)果加和，約等于UPLC-MS/MS法的測定結(jié)果。值得注意的是，未經(jīng)熱加工處理的生鮮乳經(jīng)肝素柱凈化后，棄去液中不含bLF，這表明熱加工處理會導致bLF和肝素親和柱的結(jié)合效果。然而，熱處理只會破壞bLF中蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，導致部分活性功能的喪失，但不會破壞蛋白質(zhì)的氨基酸組成，因此對UPLC-MS/MS檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。

表3 兩種方法差異性來源考察（n=2）

3 結(jié)論

對比了HPLC法及UPLC-MS/MS法檢測乳及乳制品中的bLF，兩種方法回收率高、重現(xiàn)性好，均能提供準確、精確的測定結(jié)果，滿足乳與乳制品中bLF的定量檢測需求，但兩者方法測定結(jié)果具有一定差異性。基于HPLC法測定乳及乳制品中bLF的含量，是通過肝素親和柱純化富集，獲得非熱變性bLF的含量；基于UPLC-MS/MS法測定bLF的含量，通過將大分子蛋白酶解獲得肽段，針對特征性肽段，建立內(nèi)標法測定熱變性和非熱變性bLF白的含量，不受熱處理加工工藝的影響?？舍槍Σ煌瑱z測目的選擇不同方法進行定量研究。