高效液相色譜法測定巴氏殺菌乳中糠氨酸含量的不確定度評定

何 瑛，曹學思，紀坤發(fā)，楊愛君，陳 欣，陳春裕

廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司品控中心，廣東廣州510507

0 引言

糠氨酸（ε-N-2-呋喃甲基-L-賴氨酸）是美拉德反應初期產(chǎn)生的Amadori化合物酸水解產(chǎn)生的穩(wěn)定產(chǎn)物[1]，其在牛奶中的含量很大程度取決于牛奶的熱處理強度和儲存條件，可以很好地體現(xiàn)牛奶美拉德反應的程度[2]。早在1992年，歐盟各國政府便將糠氨酸質(zhì)量分數(shù)作為評價液態(tài)乳品質(zhì)的一個重要的指標。我國原農(nóng)業(yè)部也在2005年發(fā)布行業(yè)標準將巴氏奶、超高溫滅菌乳中的糠氨酸含量作為鑒定是否為復原乳的判定因素之一[3]。

測量不確定度是根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測量的量值分散性的非負參數(shù)[4]。它是測量結(jié)果質(zhì)量水平的表現(xiàn)，表明測量結(jié)果的可信程度[5]。實驗室在使用《NY/T939—2016 巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復原乳的鑒定》[3]檢測牛奶中糠氨酸含量的過程中，由于實驗儀器設備、方法和人員等多種因素的影響，在檢測過程中難免會出現(xiàn)誤差，進而影響檢測結(jié)果的準確性。本文依據(jù)《CNAS-GL006：2019化學分析中不確定度的評估指南》[6]和《JJF 1059.1—2012測量不確定度評定與表示》[4]，對高效液相色譜法測定牛奶中糠氨酸含量的不確定度進行評定，了解該方法在檢測牛奶中糠氨酸過程中影響結(jié)果可靠性的主要因素，以便在檢測過程中予以重視，為牛奶中糠氨酸含量的準確測定提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備及試劑

高效液相色譜儀（Agilent 1200），美國Agilent公司；凱氏定氮儀（FOSS KJELTEC 8100），丹麥FOSS公司；十萬分之一天平（Mettler Tledo XSR205DU），瑞士Mettler Tledo公司；超純水系統(tǒng)（Milli-Q Reference A+），默克化工；精密干燥箱（FD115型），德國愛安姆公司；可調(diào)移液器，德國Brand公司。

甲醇、三氟乙酸（色譜純），德國Merck公司；濃鹽酸（優(yōu)級純），廣州化學試劑廠；糠氨酸（肽純度系數(shù)69%），德國皇家生物科技公司；濃硫酸、氫氧化鈉、硼酸（分析純），廣州化學試劑廠；甲基紅、溴甲酚綠（分析純），上海安譜；凱氏定氮催化劑，丹麥福斯公司。本試驗中用水符合為GB/T6682—2008中一級水的規(guī)定。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

吸取2.00 mL樣品，置于密閉耐熱試管中，加入6.00 mL 10.6 mol/L鹽酸溶液（水∶鹽酸=88∶12，V∶V），混勻，密閉試管，將其置于干燥箱中，在110 ℃下加熱水解20～23 h。加熱約1 h后，輕輕搖動試管。加熱結(jié)束后，將試管從干燥箱中取出，冷卻后混勻，用濾紙干過濾，保留濾液待測。試樣水解液中蛋白質(zhì)含量的測定：吸取2.00 mL樣品水解液，按《GB 5009.5—2016 食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》[7]的規(guī)定測定樣品水解液中的蛋白質(zhì)含量。樣品水解液中糠氨酸含量的測定：吸取0.50 mL樣品水解液，加入2.50 mL超純水，混勻，過0.22 μmPVDF針式濾膜，濾液進行HPLC檢測。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Waters HSS T3 150 mm×4.6 mm，5.0 μm粒徑；進樣量：10 μL；柱溫：28 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；流動相A為含0.1%三氟乙酸的5%甲醇水溶液、流動相B為含0.085%三氟乙酸的95%甲醇水溶液。檢測前利用流動相A和流動相B的混合液（50∶50）以1 mL/min的流速平衡色譜系統(tǒng)。然后，用初始流動相平衡系統(tǒng)直至基線穩(wěn)定。注入10 μL 3 mol/L鹽酸溶液，以檢測溶劑的純度。洗脫條件：按NY/T939—2016要求進行梯度洗脫。

1.2.3 標準工作曲線的制作

（1）糠氨酸標準儲備液的配制（250 mg/L）：將糠氨酸標準品按標準品證書提供的肽純度系數(shù)（0.69）換算后，用3 mol/L鹽酸溶液配制成標準儲備液。

（2）糠氨酸標準工作液的配制：將糠氨酸標準儲備液放至室溫，準確吸取糠氨酸標準儲備液6 μL、10 μL、20 μL、100 μL、400 μL，用3 mol/L的鹽酸溶液定容至25 mL，配制成濃度為0.06 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、1.00 mg/L、4.00 mg/L的標準工作液，4 ℃下可儲存21 天[8]。

1.3 檢測結(jié)果的計算

1.3.1 糠氨酸含量

根據(jù)NY/T 939—2016，該方法的計算數(shù)學模型為：

式中：F表示試樣中糠氨酸含量，mg/100g蛋白質(zhì)；At表示測試樣品中糠氨酸峰面積的數(shù)值；Astd表示糠氨酸標準溶液中糠氨酸峰面積的數(shù)值；Cstd表示糠氨酸標準溶液的濃度，mg/L；D表示測定時稀釋倍數(shù)，D=6；m表示樣品水解液中蛋白質(zhì)濃度，g/L。

1.3.2 樣品水解液中蛋白質(zhì)濃度

根據(jù)GB 5009.5—2016，該方法中樣品水解液蛋白質(zhì)濃度計算數(shù)學模型為：

式中：m表示樣品水解液中蛋白質(zhì)濃度，g/L；V表示樣品消耗酸體積，mL；V0表示空白消耗酸體積，mL；CHCl表示鹽酸標準滴定溶液的濃度，mol/L；Vpro表示樣液的體積，mL；0.0140為1.0 mL鹽酸標準滴定溶液相當?shù)牡馁|(zhì)量，g；k表示氮換算成粗蛋白的系數(shù)，k=6.38。

1.3.3 鹽酸標準滴定溶液的濃度

根據(jù)《GB/T 601—2016化學試劑 標準滴定溶液的制備》[9]，該方法中鹽酸標準滴定液的濃度計算數(shù)學模型為：

式中：CHCl表示鹽酸標準滴定溶液的濃度，mol/L；mNaOH表示無水碳酸鈉質(zhì)量，g；PNaOH表示無水碳酸鈉純度，以質(zhì)量分數(shù)表示；V1表示無水碳酸鈉消耗鹽酸溶液體積，mL；V2表示空白試驗消耗鹽酸溶液體積，mL；a表示體積補正值，mL；M表示1/2NaCO3的摩爾質(zhì)量，g/mol。

2 結(jié)果與分析

2.1 測量不確定度來源分析

根據(jù)檢測過程和數(shù)學模型分析，本方法測定牛奶中的糠氨酸含量的測量不確定度來源主要有以下6 個方面：（1）樣品重復性測定引入的不確定度（A類）；

（2）糠氨酸標準物質(zhì)引入的不確定度（B類）；（3）高效液相色譜儀引入的不確定度（B類）；（4）樣品水解液中蛋白質(zhì)含量測定引入的不確定度（A類+B類）；

（5）加標回收實驗引入的不確定度（A類）；（6）結(jié)果計算引入的不確定度（B類）。

為清晰地表示檢測過程中可能影響檢測結(jié)果的諸多因素的關(guān)聯(lián)性，將檢測過程的測量不確定度用魚骨圖表示，詳見圖1。

圖1 檢測過程的測量不確定度來源

2.2 不確定度分量的量化評定

2.2.1 樣品重復性測定引入的不確定度

取某品牌巴氏殺菌乳樣品，按1.2試驗方法進行檢測，每個樣品平行測定6 次，結(jié)果見表1。

表1 樣品重復性測定結(jié)果

即樣品重復性測定引入的相對標準不確定度分別為：

2.2.2 糠氨酸標準物質(zhì)引入的不確定度

糠氨酸標準曲線的建立分為三步：①標準儲備液的配制，稱取糠氨酸標準品0.00 908 g于燒杯中，用3 mol/L鹽酸溶解，定容至25 mL容量瓶中；②標準工作液的配制，吸取標準儲備液6 μL、10 μL、20 μL、100 μL、400 μL，用3 mol/L的鹽酸溶液定容至25 mL；③上機測定。此過程的不確定度主要由以下5 個方面構(gòu)成。

（1）標準品純度引入的不確定度

試驗中使用的糠氨酸標準品，標準物質(zhì)證書（批次號2051016）給出其純度為99.7%，考慮矩形分布，則糠氨酸標準品純度引入的標準不確定度分量為，相對標準不確定度為[10]：

（2）標準品稱量引入的不確定度

實驗中使用十萬分之一天平稱取糠氨酸標準品，此過程中的不確定度主要由天平校準的不確定度和天平的分辨力構(gòu)成，由于實驗使用十萬分之一天平，天平的分辨力帶來的影響很小，可忽略不計。

天平的檢定證書（證書編號LE202118637）給出其測量結(jié)果擴展不確定度為0.08 mg（K=2），則天平校準引入的標準不確定度分量為0.08 mg/2=0.04 mg[11]，相對標準不確定度為：

（3）標準儲備液定容引入的不確定度

實驗中使用25 mL（V1）容量瓶對標準儲備液進行定容，此過程中的不確定度主要容量瓶的相對擴展不確定度和溫度構(gòu)成。

①25 mL容量瓶校準證書（證書編號BEHCL-2020070020-3）給出其在20 ℃時的擴展不確定度為0.02 mL（K=2），則其標準不確定度分量為，0.02mL/2=0.01mL，相對標準不確定度：

②溫度對25 mL容量瓶體積的影響引入的不確定度，由于實驗室的溫度在±4 ℃之間變動，該影響引起的不確定度可通過估算該溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來進行計算，J J G 1 9 6—2 0 1 6規(guī)定[12]，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃， 體積產(chǎn)生的變化為25 mL×4 ℃×2.1×10-4℃＝0.021 mL，考慮矩形分布將溫度變化分量轉(zhuǎn)化為標準不確定度，相對標準不確定度為：

則標準儲備液定容引入的相對標準不確定度為：

（4）標準工作液的配制引入的不確定度

實驗中使用10 μL可調(diào)移液器吸取標準儲備液6 μL（V2）、10 μL（V3），使用100 μL可調(diào)移液器吸取標準儲備液20 μL（V4）、100 μL（V5），使用1mL可調(diào)移液器吸取標準儲備液400 μL（V6），最后用25 mL（V7）容量瓶對標準工作液進行定容，此過程中的不確定度主要由移液器的相對擴展不確定度和溫度、容量瓶的相對擴展不確定度和溫度構(gòu)成。

移液器的相對擴展不確定度引入的標準不確定度分量由移液器校準證書給出的擴展不確定度除以2（K=2）再除以移液量得到，溫度對移液器體積的影響、容量瓶的相對擴展不確定度和溫度引入的標準不確定度分量的計算方式如2.2.2（3）所示，具體計算結(jié)果見表2。

由表2可得，標準工作液的配制各步驟引入的相對標準不確定度分別為：

表2 標準工作液配制過程的不確定度評定

即標準工作液的配制引入的總相對標準不確定度為：

（5）標準曲線擬合引入的不確定度

使用高效液相色譜儀對標準工作液每個濃度上機測定6 次，得到糠氨酸色譜峰面積，使用最小二乘法進行標準曲線擬合，得到標準曲線的線性回歸方程，具體結(jié)果見表3。根據(jù)得到的標準曲線，對4 個不同熱處理強度的牛奶樣品，按1.2試驗方法進行檢測，每個樣品平行測定6 次，結(jié)果見表1。標準曲線擬合的標準不確定度可按下列公式計算：

式中：a表示標準曲線的斜率，a＝37.9963604；b表示標準曲線的截距，b＝0.4413247；n2表示樣品的測量次數(shù)，n1=6；n2表示標準工作液總共測量次數(shù)，n2=30；表示樣品中糠氨酸的平均濃度值，=0.1557 mg/L；表示標準工作液中糠氨酸的平均濃度，mg/L；ci表示標準工作液中糠氨酸各點的濃度值，mg/L；Ai表示標準溶液各點的峰面積測定值；SR表示標準溶液峰面積殘差的標準差[13]。

根據(jù)表1和表3的數(shù)據(jù)計算得到：

表3 標準曲線線性參數(shù)表

即標準曲線擬合的相對標準不確定度為：

即糠氨酸標準物質(zhì)引入的總相對標準不確定度為：

2.2.3 高效液相色譜儀測定引入的不確定度

高效液相色譜儀測定色譜峰面積引入的不確定度主要由儀器的校準和樣品的重復測量引入的不確定度2部分組成。其中樣品的重復性測量引入的不確定度包含在平行樣品的重復性測定帶來的誤差中，不再單獨評定[14，15]。

儀器的檢定證書（證書編號NG202101841）顯示二級管陣列檢測器的定量重復性誤差為0.4%，考慮矩形分布[16]，液相色譜儀峰面積測量引入的相對標準不確定度為：

2.2.4 樣品水解液中蛋白質(zhì)含量測定引入的不確定度

樣品水解液中蛋白質(zhì)含量測定過程為：吸取2.00 mL樣品水解液，按GB 5009.5—2016的規(guī)定測定，根據(jù)0.1 mol/L鹽酸標準滴定溶液的消耗量來計算樣品水解液中的蛋白質(zhì)含量。此過程中的不確定度來源主要由樣品水解液的移取、0.1 mol/L鹽酸標準滴定溶液的濃度、酸式滴定和重復性測定構(gòu)成。其中樣品水解液重復性測量引入的不確定度包含在平行樣品的重復性測定帶來的誤差中，不再單獨評定。

（1）樣品水解液的移取

樣品水解液的移取過程為：使用5 mL可調(diào)移液器吸取2.00 mL（V8）樣品水解液。此過程的不確定度主要由移液器的相對擴展不確定度和溫度構(gòu)成，移取體積的變動性包括在重復性測定帶來的誤差中，不再單獨評定。

①5 mL可調(diào)移液器的校準證書（證書編號BSHCL-2020080029-4）指出該移液器的擴展不確定度為4.3 μL（K=2），即5mL可調(diào)移液器的不確定度分量為4.3μL/2=2.15μL，相對標準不確定度為：

②溫度對5 mL可調(diào)移液器體積的影響引入的標準不確定度分量，按照2.2.2（3）所示進行計算，為相對標準不確定度為：

即樣品水解液移取引入的相對標準不確定度為：

（2）鹽酸標準滴定溶液的濃度測定

鹽酸標準滴定溶液的濃度測定過程為：使用萬分之一天平稱取約0.2 g無水碳酸鈉，定容到50 mL，用酸堿滴定管裝入配制的鹽酸溶液滴定至終點。此過程的不確定度來源主要由無水碳酸鈉的摩爾質(zhì)量、純度和質(zhì)量、滴定體積和重復性測定構(gòu)成。其中無水碳酸鈉的摩爾質(zhì)量引入不不確定度很小，可忽略不計。

a 重復性測定引入的不確定度

對同一個鹽酸標準滴定溶液按GB/T 601—2016的方法進行雙人八平行測定，結(jié)果見表4。

表4 鹽酸標準滴定溶液的標定結(jié)果

即鹽酸標準滴定溶液重復性測定引入的相對標準不確定度為：

b 無水碳酸鈉純度引入的不確定度

無水碳酸鈉的標準物質(zhì)證書（批次號201711）給出其純度為99.98%，擴展不確定度為0.05%（K=2），則無水碳酸鈉準品純度引入的標準不確定度分量為相對標準不確定度為：

c 無水碳酸鈉稱量引入的不確定度

實驗中使用萬分之一天平稱取無水碳酸鈉標準品，需進行2 次測量，一次為空瓶，一次為總重，此過程中的不確定度主要由和天平的分辨力構(gòu)成，由于實驗使用萬分之一天平，天平的分辨力帶來的影響很小，可忽略不計。

天平的檢定證書（證書編號LE202134727）給出其測量結(jié)果擴展不確定度為0.5 mg（K=2），則天平校準引入的標準不確定度分量為0.5mg/2=0.25mg，相對標準不確定度為：

d 滴定體積引入的不確定度

鹽酸標準滴定溶液滴定過程使用酸堿滴定管分別對樣品和空白進行滴定，空白試驗消耗體積數(shù)值很小，可忽略不計。此過程中的不確定度主要由具塞滴定管校準和溫度、滴定終點判斷和重復性測定構(gòu)成。滴定體積的重復性誤差包括在重復性測定帶來的誤差中，不再單獨評定。

①5 0 m L具塞滴定管校準證書（證書編號LE202118637）給出其擴展不確定度為0.030 mL（K=2），則滴定管校準引入的標準不確定度分量為0.030 mL/2=0.015 mL，相對標準不確定度為：

②不考慮指示劑消耗滴定液的因素及滴定終點與等當點之間可能存在的系統(tǒng)誤差。通過反復試驗，終點判斷的最大體積誤差為1 滴即±0.03 mL[17]，考慮兩點分布（K=1）[18]，滴定終點判斷引入的不確定度分量為0.03 mL/1=0.03 mL，相對標準不確定度為：

③溫度對滴定管體積的影響引入的不確定度，按照2.2.2（3）計算，為相對標準不確定度為：

即滴定體積引入的相對標準不確定度為：

鹽酸標準滴定溶液的濃度測定過程引入的總相對標準不確定度為：

（3）酸式滴定

樣品水解液酸式滴定過程：使用數(shù)字滴定器分別對樣品和空白進行滴定。此過程中的不確定度主要由數(shù)字滴定器校準、滴定終點判斷和重復性測定構(gòu)成。滴定體積的重復性誤差包括在重復性測定帶來的誤差中，不再單獨評定。

①50mL數(shù)字滴定器的校準證書（證書編號LE202106970）給出其測量結(jié)果相對擴展不確定度為0.2%（K=2），則數(shù)字滴定器校準引入的標準不確定度分量為0.002mL/2=0.001mL，相對標準不確定度為：

②50mL數(shù)字滴定器的刻度為0.01mL，通過反復試驗，終點判斷的最大體積誤差為1滴即±0.01mL，考慮兩點分布（K=1），滴定終點判斷引入的標準不確定度分量為0.01mL/1=0.01mL，相對標準不確定度為：

即酸式滴定過程引入的相對標準不確定度為：

樣品水解液中蛋白質(zhì)含量測定過程總相對標準不確定度為：

2.2.5 加標回收試驗引入的不確定度

分別吸取一定量的糠氨酸標準儲備液，配制成加標濃度5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、30 mg/L的加標樣品，充分混勻后按1.2的試驗方法進行檢測，每個樣品平行測定6 次，取平均值計算回收率，實驗結(jié)果見表5。

表5 糠氨酸加標回收試驗結(jié)果

用t檢驗來確定平均回收率是否與1.0有顯著性差異。檢驗統(tǒng)計量t為：

該值與95%置信度，n-1=23自由度下的雙側(cè)臨界值tcrit比較，t＞tcrit=2.069，說明平均回收率與1有顯著性差異，平均回收率應被明確地包含在結(jié)果的計算中。

即回收率引入的相對標準不確定度為：

2.2.6 結(jié)果計算引入的不確定度

NY/T939—2016規(guī)定，計算結(jié)果保留至小數(shù)點后一位，采用四舍五入法進行修約時，糠數(shù)值修約的半寬為0.05 mg/100g蛋白質(zhì)，考慮矩形分布[19]，結(jié)果修約引入的標準不確定度分量為相對標準不確定度為：

綜上所述，高效液相色譜法測定牛奶中糠氨酸含量的試驗過程中不確定度來源詳見表6。

2.3 合成標準不確定度評定

根據(jù)表6列出的各不確定度來源及其相對標準不確定度，合成標準不確定度為：

表6 相對不確定度分量一覽表

2.4 擴展不確定度計算和結(jié)果表示

取置信水平為95%，包含因子k=2，則擴展不確定度：

因此，高效液相色譜法測定巴氏殺菌乳中糠氨酸的檢測結(jié)果為：

3 結(jié)論

本文使用高效液相色譜法測定巴氏殺菌乳中糠氨酸的含量，并對方法的不確定度進行評定。根據(jù)評定結(jié)果可知，方法中測量不確定度的主要來源包括糠氨酸標準物質(zhì)（標準品稱量、標準工作液的配制、標準曲線的擬合等）和樣品水解液中蛋白質(zhì)含量測定（酸式滴定終點判定）。因此，在實際檢測過程中，為確保檢測結(jié)果的準確性，可通過使用精度較高的稱量設備、玻璃量具和滴定設備，做好儀器設備的定期校準和維護保養(yǎng)，減少標準溶液稀釋步驟等來降低測量過程的不確定度；在蛋白質(zhì)滴定時可以選擇 pH計進行終點顏色判定[14]，避免肉眼判定的誤差；此外，在確保樣品定量準確度的情況下，可適量減少標準工作液的濃度梯度并增加標準工作液平行測定次數(shù)以降低不確定度，一般選擇3～5 個濃度梯度的標準溶液進行標準曲線擬合[10]。