高效液相色譜法測(cè)定巴氏殺菌乳中糠氨酸含量的不確定度評(píng)定

何 瑛，曹學(xué)思，紀(jì)坤發(fā)，楊?lèi)?ài)君，陳 欣，陳春裕

廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司品控中心，廣東廣州510507

0 引言

糠氨酸（ε-N-2-呋喃甲基-L-賴(lài)氨酸）是美拉德反應(yīng)初期產(chǎn)生的Amadori化合物酸水解產(chǎn)生的穩(wěn)定產(chǎn)物[1]，其在牛奶中的含量很大程度取決于牛奶的熱處理強(qiáng)度和儲(chǔ)存條件，可以很好地體現(xiàn)牛奶美拉德反應(yīng)的程度[2]。早在1992年，歐盟各國(guó)政府便將糠氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為評(píng)價(jià)液態(tài)乳品質(zhì)的一個(gè)重要的指標(biāo)。我國(guó)原農(nóng)業(yè)部也在2005年發(fā)布行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)將巴氏奶、超高溫滅菌乳中的糠氨酸含量作為鑒定是否為復(fù)原乳的判定因素之一[3]。

測(cè)量不確定度是根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測(cè)量的量值分散性的非負(fù)參數(shù)[4]。它是測(cè)量結(jié)果質(zhì)量水平的表現(xiàn)，表明測(cè)量結(jié)果的可信程度[5]。實(shí)驗(yàn)室在使用《NY/T939—2016 巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》[3]檢測(cè)牛奶中糠氨酸含量的過(guò)程中，由于實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備、方法和人員等多種因素的影響，在檢測(cè)過(guò)程中難免會(huì)出現(xiàn)誤差，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文依據(jù)《CNAS-GL006：2019化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[6]和《JJF 1059.1—2012測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[4]，對(duì)高效液相色譜法測(cè)定牛奶中糠氨酸含量的不確定度進(jìn)行評(píng)定，了解該方法在檢測(cè)牛奶中糠氨酸過(guò)程中影響結(jié)果可靠性的主要因素，以便在檢測(cè)過(guò)程中予以重視，為牛奶中糠氨酸含量的準(zhǔn)確測(cè)定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備及試劑

高效液相色譜儀（Agilent 1200），美國(guó)Agilent公司；凱氏定氮儀（FOSS KJELTEC 8100），丹麥FOSS公司；十萬(wàn)分之一天平（Mettler Tledo XSR205DU），瑞士Mettler Tledo公司；超純水系統(tǒng)（Milli-Q Reference A+），默克化工；精密干燥箱（FD115型），德國(guó)愛(ài)安姆公司；可調(diào)移液器，德國(guó)Brand公司。

甲醇、三氟乙酸（色譜純），德國(guó)Merck公司；濃鹽酸（優(yōu)級(jí)純），廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)；糠氨酸（肽純度系數(shù)69%），德國(guó)皇家生物科技公司；濃硫酸、氫氧化鈉、硼酸（分析純），廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)；甲基紅、溴甲酚綠（分析純），上海安譜；凱氏定氮催化劑，丹麥福斯公司。本試驗(yàn)中用水符合為GB/T6682—2008中一級(jí)水的規(guī)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

吸取2.00 mL樣品，置于密閉耐熱試管中，加入6.00 mL 10.6 mol/L鹽酸溶液（水∶鹽酸=88∶12，V∶V），混勻，密閉試管，將其置于干燥箱中，在110 ℃下加熱水解20～23 h。加熱約1 h后，輕輕搖動(dòng)試管。加熱結(jié)束后，將試管從干燥箱中取出，冷卻后混勻，用濾紙干過(guò)濾，保留濾液待測(cè)。試樣水解液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：吸取2.00 mL樣品水解液，按《GB 5009.5—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[7]的規(guī)定測(cè)定樣品水解液中的蛋白質(zhì)含量。樣品水解液中糠氨酸含量的測(cè)定：吸取0.50 mL樣品水解液，加入2.50 mL超純水，混勻，過(guò)0.22 μmPVDF針式濾膜，濾液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Waters HSS T3 150 mm×4.6 mm，5.0 μm粒徑；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：28 ℃；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流動(dòng)相A為含0.1%三氟乙酸的5%甲醇水溶液、流動(dòng)相B為含0.085%三氟乙酸的95%甲醇水溶液。檢測(cè)前利用流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的混合液（50∶50）以1 mL/min的流速平衡色譜系統(tǒng)。然后，用初始流動(dòng)相平衡系統(tǒng)直至基線(xiàn)穩(wěn)定。注入10 μL 3 mol/L鹽酸溶液，以檢測(cè)溶劑的純度。洗脫條件：按NY/T939—2016要求進(jìn)行梯度洗脫。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的制作

（1）糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制（250 mg/L）：將糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品按標(biāo)準(zhǔn)品證書(shū)提供的肽純度系數(shù)（0.69）換算后，用3 mol/L鹽酸溶液配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

（2）糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：將糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液放至室溫，準(zhǔn)確吸取糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液6 μL、10 μL、20 μL、100 μL、400 μL，用3 mol/L的鹽酸溶液定容至25 mL，配制成濃度為0.06 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、1.00 mg/L、4.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃下可儲(chǔ)存21 天[8]。

1.3 檢測(cè)結(jié)果的計(jì)算

1.3.1 糠氨酸含量

根據(jù)NY/T 939—2016，該方法的計(jì)算數(shù)學(xué)模型為：

式中：F表示試樣中糠氨酸含量，mg/100g蛋白質(zhì)；At表示測(cè)試樣品中糠氨酸峰面積的數(shù)值；Astd表示糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中糠氨酸峰面積的數(shù)值；Cstd表示糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mg/L；D表示測(cè)定時(shí)稀釋倍數(shù)，D=6；m表示樣品水解液中蛋白質(zhì)濃度，g/L。

1.3.2 樣品水解液中蛋白質(zhì)濃度

根據(jù)GB 5009.5—2016，該方法中樣品水解液蛋白質(zhì)濃度計(jì)算數(shù)學(xué)模型為：

式中：m表示樣品水解液中蛋白質(zhì)濃度，g/L；V表示樣品消耗酸體積，mL；V0表示空白消耗酸體積，mL；CHCl表示鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；Vpro表示樣液的體積，mL；0.0140為1.0 mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；k表示氮換算成粗蛋白的系數(shù)，k=6.38。

1.3.3 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度

根據(jù)《GB/T 601—2016化學(xué)試劑 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備》[9]，該方法中鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的濃度計(jì)算數(shù)學(xué)模型為：

式中：CHCl表示鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；mNaOH表示無(wú)水碳酸鈉質(zhì)量，g；PNaOH表示無(wú)水碳酸鈉純度，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示；V1表示無(wú)水碳酸鈉消耗鹽酸溶液體積，mL；V2表示空白試驗(yàn)消耗鹽酸溶液體積，mL；a表示體積補(bǔ)正值，mL；M表示1/2NaCO3的摩爾質(zhì)量，g/mol。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量不確定度來(lái)源分析

根據(jù)檢測(cè)過(guò)程和數(shù)學(xué)模型分析，本方法測(cè)定牛奶中的糠氨酸含量的測(cè)量不確定度來(lái)源主要有以下6 個(gè)方面：（1）樣品重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度（A類(lèi)）；

（2）糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度（B類(lèi)）；（3）高效液相色譜儀引入的不確定度（B類(lèi)）；（4）樣品水解液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定引入的不確定度（A類(lèi)+B類(lèi)）；

（5）加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)引入的不確定度（A類(lèi)）；（6）結(jié)果計(jì)算引入的不確定度（B類(lèi)）。

為清晰地表示檢測(cè)過(guò)程中可能影響檢測(cè)結(jié)果的諸多因素的關(guān)聯(lián)性，將檢測(cè)過(guò)程的測(cè)量不確定度用魚(yú)骨圖表示，詳見(jiàn)圖1。

圖1 檢測(cè)過(guò)程的測(cè)量不確定度來(lái)源

2.2 不確定度分量的量化評(píng)定

2.2.1 樣品重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度

取某品牌巴氏殺菌乳樣品，按1.2試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品平行測(cè)定6 次，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

即樣品重復(fù)性測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

2.2.2 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立分為三步：①標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制，稱(chēng)取糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.00 908 g于燒杯中，用3 mol/L鹽酸溶解，定容至25 mL容量瓶中；②標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制，吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液6 μL、10 μL、20 μL、100 μL、400 μL，用3 mol/L的鹽酸溶液定容至25 mL；③上機(jī)測(cè)定。此過(guò)程的不確定度主要由以下5 個(gè)方面構(gòu)成。

（1）標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度

試驗(yàn)中使用的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)（批次號(hào)2051016）給出其純度為99.7%，考慮矩形分布，則糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為[10]：

（2）標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量引入的不確定度

實(shí)驗(yàn)中使用十萬(wàn)分之一天平稱(chēng)取糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，此過(guò)程中的不確定度主要由天平校準(zhǔn)的不確定度和天平的分辨力構(gòu)成，由于實(shí)驗(yàn)使用十萬(wàn)分之一天平，天平的分辨力帶來(lái)的影響很小，可忽略不計(jì)。

天平的檢定證書(shū)（證書(shū)編號(hào)LE202118637）給出其測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度為0.08 mg（K=2），則天平校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為0.08 mg/2=0.04 mg[11]，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容引入的不確定度

實(shí)驗(yàn)中使用25 mL（V1）容量瓶對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行定容，此過(guò)程中的不確定度主要容量瓶的相對(duì)擴(kuò)展不確定度和溫度構(gòu)成。

①25 mL容量瓶校準(zhǔn)證書(shū)（證書(shū)編號(hào)BEHCL-2020070020-3）給出其在20 ℃時(shí)的擴(kuò)展不確定度為0.02 mL（K=2），則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為，0.02mL/2=0.01mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

②溫度對(duì)25 mL容量瓶體積的影響引入的不確定度，由于實(shí)驗(yàn)室的溫度在±4 ℃之間變動(dòng)，該影響引起的不確定度可通過(guò)估算該溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來(lái)進(jìn)行計(jì)算，J J G 1 9 6—2 0 1 6規(guī)定[12]，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃， 體積產(chǎn)生的變化為25 mL×4 ℃×2.1×10-4℃＝0.021 mL，考慮矩形分布將溫度變化分量轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)不確定度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（4）標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制引入的不確定度

實(shí)驗(yàn)中使用10 μL可調(diào)移液器吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液6 μL（V2）、10 μL（V3），使用100 μL可調(diào)移液器吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液20 μL（V4）、100 μL（V5），使用1mL可調(diào)移液器吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液400 μL（V6），最后用25 mL（V7）容量瓶對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行定容，此過(guò)程中的不確定度主要由移液器的相對(duì)擴(kuò)展不確定度和溫度、容量瓶的相對(duì)擴(kuò)展不確定度和溫度構(gòu)成。

移液器的相對(duì)擴(kuò)展不確定度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量由移液器校準(zhǔn)證書(shū)給出的擴(kuò)展不確定度除以2（K=2）再除以移液量得到，溫度對(duì)移液器體積的影響、容量瓶的相對(duì)擴(kuò)展不確定度和溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的計(jì)算方式如2.2.2（3）所示，具體計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可得，標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制各步驟引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程的不確定度評(píng)定

即標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制引入的總相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（5）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合引入的不確定度

使用高效液相色譜儀對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作液每個(gè)濃度上機(jī)測(cè)定6 次，得到糠氨酸色譜峰面積，使用最小二乘法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸方程，具體結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，對(duì)4 個(gè)不同熱處理強(qiáng)度的牛奶樣品，按1.2試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品平行測(cè)定6 次，結(jié)果見(jiàn)表1。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合的標(biāo)準(zhǔn)不確定度可按下列公式計(jì)算：

式中：a表示標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率，a＝37.9963604；b表示標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的截距，b＝0.4413247；n2表示樣品的測(cè)量次數(shù)，n1=6；n2表示標(biāo)準(zhǔn)工作液總共測(cè)量次數(shù)，n2=30；表示樣品中糠氨酸的平均濃度值，=0.1557 mg/L；表示標(biāo)準(zhǔn)工作液中糠氨酸的平均濃度，mg/L；ci表示標(biāo)準(zhǔn)工作液中糠氨酸各點(diǎn)的濃度值，mg/L；Ai表示標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)的峰面積測(cè)定值；SR表示標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差[13]。

根據(jù)表1和表3的數(shù)據(jù)計(jì)算得到：

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性參數(shù)表

即標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

即糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的總相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 高效液相色譜儀測(cè)定引入的不確定度

高效液相色譜儀測(cè)定色譜峰面積引入的不確定度主要由儀器的校準(zhǔn)和樣品的重復(fù)測(cè)量引入的不確定度2部分組成。其中樣品的重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度包含在平行樣品的重復(fù)性測(cè)定帶來(lái)的誤差中，不再單獨(dú)評(píng)定[14，15]。

儀器的檢定證書(shū)（證書(shū)編號(hào)NG202101841）顯示二級(jí)管陣列檢測(cè)器的定量重復(fù)性誤差為0.4%，考慮矩形分布[16]，液相色譜儀峰面積測(cè)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.4 樣品水解液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定引入的不確定度

樣品水解液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定過(guò)程為：吸取2.00 mL樣品水解液，按GB 5009.5—2016的規(guī)定測(cè)定，根據(jù)0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的消耗量來(lái)計(jì)算樣品水解液中的蛋白質(zhì)含量。此過(guò)程中的不確定度來(lái)源主要由樣品水解液的移取、0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度、酸式滴定和重復(fù)性測(cè)定構(gòu)成。其中樣品水解液重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度包含在平行樣品的重復(fù)性測(cè)定帶來(lái)的誤差中，不再單獨(dú)評(píng)定。

（1）樣品水解液的移取

樣品水解液的移取過(guò)程為：使用5 mL可調(diào)移液器吸取2.00 mL（V8）樣品水解液。此過(guò)程的不確定度主要由移液器的相對(duì)擴(kuò)展不確定度和溫度構(gòu)成，移取體積的變動(dòng)性包括在重復(fù)性測(cè)定帶來(lái)的誤差中，不再單獨(dú)評(píng)定。

①5 mL可調(diào)移液器的校準(zhǔn)證書(shū)（證書(shū)編號(hào)BSHCL-2020080029-4）指出該移液器的擴(kuò)展不確定度為4.3 μL（K=2），即5mL可調(diào)移液器的不確定度分量為4.3μL/2=2.15μL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

②溫度對(duì)5 mL可調(diào)移液器體積的影響引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量，按照2.2.2（3）所示進(jìn)行計(jì)算，為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

即樣品水解液移取引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度測(cè)定

鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度測(cè)定過(guò)程為：使用萬(wàn)分之一天平稱(chēng)取約0.2 g無(wú)水碳酸鈉，定容到50 mL，用酸堿滴定管裝入配制的鹽酸溶液滴定至終點(diǎn)。此過(guò)程的不確定度來(lái)源主要由無(wú)水碳酸鈉的摩爾質(zhì)量、純度和質(zhì)量、滴定體積和重復(fù)性測(cè)定構(gòu)成。其中無(wú)水碳酸鈉的摩爾質(zhì)量引入不不確定度很小，可忽略不計(jì)。

a 重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度

對(duì)同一個(gè)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液按GB/T 601—2016的方法進(jìn)行雙人八平行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的標(biāo)定結(jié)果

即鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液重復(fù)性測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

b 無(wú)水碳酸鈉純度引入的不確定度

無(wú)水碳酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)（批次號(hào)201711）給出其純度為99.98%，擴(kuò)展不確定度為0.05%（K=2），則無(wú)水碳酸鈉準(zhǔn)品純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

c 無(wú)水碳酸鈉稱(chēng)量引入的不確定度

實(shí)驗(yàn)中使用萬(wàn)分之一天平稱(chēng)取無(wú)水碳酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，需進(jìn)行2 次測(cè)量，一次為空瓶，一次為總重，此過(guò)程中的不確定度主要由和天平的分辨力構(gòu)成，由于實(shí)驗(yàn)使用萬(wàn)分之一天平，天平的分辨力帶來(lái)的影響很小，可忽略不計(jì)。

天平的檢定證書(shū)（證書(shū)編號(hào)LE202134727）給出其測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度為0.5 mg（K=2），則天平校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為0.5mg/2=0.25mg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

d 滴定體積引入的不確定度

鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定過(guò)程使用酸堿滴定管分別對(duì)樣品和空白進(jìn)行滴定，空白試驗(yàn)消耗體積數(shù)值很小，可忽略不計(jì)。此過(guò)程中的不確定度主要由具塞滴定管校準(zhǔn)和溫度、滴定終點(diǎn)判斷和重復(fù)性測(cè)定構(gòu)成。滴定體積的重復(fù)性誤差包括在重復(fù)性測(cè)定帶來(lái)的誤差中，不再單獨(dú)評(píng)定。

①5 0 m L具塞滴定管校準(zhǔn)證書(shū)（證書(shū)編號(hào)LE202118637）給出其擴(kuò)展不確定度為0.030 mL（K=2），則滴定管校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為0.030 mL/2=0.015 mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

②不考慮指示劑消耗滴定液的因素及滴定終點(diǎn)與等當(dāng)點(diǎn)之間可能存在的系統(tǒng)誤差。通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，終點(diǎn)判斷的最大體積誤差為1 滴即±0.03 mL[17]，考慮兩點(diǎn)分布（K=1）[18]，滴定終點(diǎn)判斷引入的不確定度分量為0.03 mL/1=0.03 mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

③溫度對(duì)滴定管體積的影響引入的不確定度，按照2.2.2（3）計(jì)算，為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

即滴定體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度測(cè)定過(guò)程引入的總相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）酸式滴定

樣品水解液酸式滴定過(guò)程：使用數(shù)字滴定器分別對(duì)樣品和空白進(jìn)行滴定。此過(guò)程中的不確定度主要由數(shù)字滴定器校準(zhǔn)、滴定終點(diǎn)判斷和重復(fù)性測(cè)定構(gòu)成。滴定體積的重復(fù)性誤差包括在重復(fù)性測(cè)定帶來(lái)的誤差中，不再單獨(dú)評(píng)定。

①50mL數(shù)字滴定器的校準(zhǔn)證書(shū)（證書(shū)編號(hào)LE202106970）給出其測(cè)量結(jié)果相對(duì)擴(kuò)展不確定度為0.2%（K=2），則數(shù)字滴定器校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為0.002mL/2=0.001mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

②50mL數(shù)字滴定器的刻度為0.01mL，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，終點(diǎn)判斷的最大體積誤差為1滴即±0.01mL，考慮兩點(diǎn)分布（K=1），滴定終點(diǎn)判斷引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為0.01mL/1=0.01mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

即酸式滴定過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

樣品水解液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定過(guò)程總相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)引入的不確定度

分別吸取一定量的糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成加標(biāo)濃度5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、30 mg/L的加標(biāo)樣品，充分混勻后按1.2的試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品平行測(cè)定6 次，取平均值計(jì)算回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 糠氨酸加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

用t檢驗(yàn)來(lái)確定平均回收率是否與1.0有顯著性差異。檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量t為：

該值與95%置信度，n-1=23自由度下的雙側(cè)臨界值tcrit比較，t＞tcrit=2.069，說(shuō)明平均回收率與1有顯著性差異，平均回收率應(yīng)被明確地包含在結(jié)果的計(jì)算中。

即回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.6 結(jié)果計(jì)算引入的不確定度

NY/T939—2016規(guī)定，計(jì)算結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后一位，采用四舍五入法進(jìn)行修約時(shí)，糠數(shù)值修約的半寬為0.05 mg/100g蛋白質(zhì)，考慮矩形分布[19]，結(jié)果修約引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜上所述，高效液相色譜法測(cè)定牛奶中糠氨酸含量的試驗(yàn)過(guò)程中不確定度來(lái)源詳見(jiàn)表6。

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

根據(jù)表6列出的各不確定度來(lái)源及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表6 相對(duì)不確定度分量一覽表

2.4 擴(kuò)展不確定度計(jì)算和結(jié)果表示

取置信水平為95%，包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度：

因此，高效液相色譜法測(cè)定巴氏殺菌乳中糠氨酸的檢測(cè)結(jié)果為：

3 結(jié)論

本文使用高效液相色譜法測(cè)定巴氏殺菌乳中糠氨酸的含量，并對(duì)方法的不確定度進(jìn)行評(píng)定。根據(jù)評(píng)定結(jié)果可知，方法中測(cè)量不確定度的主要來(lái)源包括糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合等）和樣品水解液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定（酸式滴定終點(diǎn)判定）。因此，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，為確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，可通過(guò)使用精度較高的稱(chēng)量設(shè)備、玻璃量具和滴定設(shè)備，做好儀器設(shè)備的定期校準(zhǔn)和維護(hù)保養(yǎng)，減少標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋步驟等來(lái)降低測(cè)量過(guò)程的不確定度；在蛋白質(zhì)滴定時(shí)可以選擇 pH計(jì)進(jìn)行終點(diǎn)顏色判定[14]，避免肉眼判定的誤差；此外，在確保樣品定量準(zhǔn)確度的情況下，可適量減少標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度梯度并增加標(biāo)準(zhǔn)工作液平行測(cè)定次數(shù)以降低不確定度，一般選擇3～5 個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合[10]。