鎘脅迫下叢枝菌根真菌對(duì)小麥生理特性和根際土壤酶活性的影響

郭 暉，周 慧，莊靜靜，王曉冰

（1. 新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2. 新鄉(xiāng)學(xué)院 土木工程與建筑學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003 ）

鎘（Cd）是毒性較強(qiáng)的重金屬之一，在環(huán)境中穩(wěn)定、易累積、不易清除。2021年《中國(guó)生態(tài)環(huán)境狀況公報(bào)》顯示，影響我國(guó)農(nóng)用地土壤環(huán)境質(zhì)量的主要污染物是重金屬，其中Cd為首要污染物[1]。Cd進(jìn)入植物體內(nèi)可破壞植物的光合結(jié)構(gòu)、降低葉綠素含量、抑制碳代謝酶活性，從而降低植物的光合速率[2-3]。在較低濃度Cd脅迫下，植物體內(nèi)的過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶活性升高，有效增強(qiáng)植物對(duì)Cd脅迫的抵抗能力[4]，但是植物對(duì)Cd 脅迫的抵抗能力有限，Cd在植物體內(nèi)積累到一定濃度后會(huì)對(duì)植株造成不可逆的損傷。

叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhiza fungi，AMF）能夠與陸地上絕大多數(shù)植物根系形成菌根共生體，進(jìn)而對(duì)宿主植物產(chǎn)生多種積極效應(yīng)，其最基本的效應(yīng)就是緩解逆境脅迫，增強(qiáng)植物的抗逆能力，包括重金屬、鹽堿、干旱、病害、澇害和寒害等[5]。AMF 在重金屬污染條件下可通過(guò)螯合作用與重金屬形成螯合體，或通過(guò)菌絲固持作用將部分重金屬阻滯于根部，降低植株地上部重金屬濃度，有效緩解植株的重金屬脅迫[6-7]。另有研究表明，AMF 可通過(guò)提高根際土壤酶活性、促進(jìn)宿主植物對(duì)礦質(zhì)元素的吸收、擴(kuò)大植物的根系面積、改變根際理化性狀、提高宿主植物體內(nèi)抗氧化酶活性以及改變重金屬化學(xué)形態(tài)等來(lái)緩解重金屬對(duì)宿主植物的毒害[8-9]。

河南是我國(guó)小麥大省，小麥種植面積占全國(guó)近1/4，但是部分地區(qū)農(nóng)田面臨嚴(yán)重的Cd 污染，嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和糧食安全。研究發(fā)現(xiàn)，AMF 可以減輕Cd 對(duì)農(nóng)作物的毒害作用[9-11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在Cd脅迫下，接種AMF 會(huì)對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面作用，但能減少體內(nèi)Cd 積累[12]，說(shuō)明Cd 脅迫下接種AMF 對(duì)植物的影響可能跟宿主種類有關(guān)。在小麥上的研究發(fā)現(xiàn)，接種AMF可以顯著提高小麥的株高和生物量[13]。但目前尚未見(jiàn)接種AMF 對(duì)Cd 脅迫下小麥毒害緩解作用的報(bào)道。為此，設(shè)置不同AMF接種處理，研究Cd 脅迫下AMF 對(duì)小麥光合生理特性、抗氧化酶活性和根際土壤酶活性的影響，探討AMF-小麥共生體系對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)，為農(nóng)田Cd污染鈍化修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥品種為矮抗58，由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

AMF 為 根 內(nèi) 根 孢 囊 霉（Rhizophagus intraradices，Ri）和 摩 西 斗 管 囊 霉（Funneliformis mosseae，F(xiàn)m），均購(gòu)置于長(zhǎng)江大學(xué)根系生物學(xué)研究所。將無(wú)菌土壤、無(wú)菌沙子、無(wú)菌蛭石按照體積比2∶5∶3混合作為培養(yǎng)基，以白三葉草為宿主植物，進(jìn)行AMF盆栽擴(kuò)繁培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用土培試驗(yàn)，所用土壤經(jīng)自然風(fēng)干后磨碎，于高壓滅菌鍋中經(jīng)蒸汽滅菌后裝入盆缽中。盆缽口部直徑23 cm、底部直徑17 cm、深27 cm，每盆裝土10 kg。分別取1 L 0、50、100、200 mg/L的CdCl2溶液加入各盆，即得Cd 含量為0、5、10、20 mg/kg 的Cd污染土壤，記作Cd0、Cd5、Cd10、Cd20，平衡3個(gè)月后備用。在以上Cd 處理下，分別設(shè)置不接種AMF（CK）、接種根內(nèi)根孢囊霉（Ri）、接種摩西斗管囊霉（Fm）、2種AMF 1∶1混合接種（RF）4個(gè)處理，每盆接種菌劑100 g，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

選取籽粒飽滿的小麥種子于5% H2O2中消毒20 min，用蒸餾水洗凈后播種到每個(gè)盆中，出苗后控制每盆9 株幼苗，盆隨機(jī)放置。待小麥長(zhǎng)出3 片真葉后，定期補(bǔ)充1/4 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液以保證營(yíng)養(yǎng)充足，采用稱質(zhì)量-澆水法維持土壤水分，同時(shí)防治病蟲害。于2021 年10 月上旬播種，2022 年4 月下旬旗葉完全抽出后采樣，并進(jìn)行各類指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 光合特性 每盆選擇一株長(zhǎng)勢(shì)良好的小麥，測(cè)定旗葉的比葉重、葉綠素含量和凈光合速率（Net photosynthetic rate，Pn）。比葉重采用打孔稱質(zhì)量法測(cè)定。葉綠素含量采用95%乙醇提取，使用分光光度計(jì)測(cè)定。Pn 使用Li-6400XT 便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定，測(cè)定時(shí)間為9：00—11：00。

1.3.2 抗氧化特性 使用試劑盒測(cè)定旗葉的抗氧化特性[14]。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定（Solarbio，BC0025），POD 和CAT 活性采用H2O2還原法測(cè)定（Solarbio，BC0095 和BC0205），SOD 活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定（Solarbio，BC0175）。

1.3.3 根際土壤酶活性 選擇一株長(zhǎng)勢(shì)良好的小麥，小心將根系挖出后采用“抖根法”收集根際土壤，使用試劑盒測(cè)定根際土壤酶活性[15]。其中，土壤蔗糖酶（Sucrase，SC）活性采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定（Solarbio，BC0245），土壤CAT 活性采用H2O2還原法測(cè)定（Solarbio，BC0105），土壤脲酶（Urease，UE）活性采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定（Solarbio，BC0125），土壤脫氫酶（Dehydrogenase，DHA）活性采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑還原法測(cè)定（Solarbio，BC0395）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016 進(jìn)行整理和繪圖，采用R 4.1.3軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫下接種AMF對(duì)小麥光合特性的影響

由表1 可知，無(wú)論是否接種AMF，小麥比葉重、葉綠素a、葉綠素b 含量及Pn 均隨著土壤中Cd 含量的增加呈減小趨勢(shì)，Cd0 和Cd5 處理間差異不顯著。但二者比葉重均顯著高于Cd10 和Cd20 處理；葉綠素a、葉綠素b含量及Pn在Cd10和Cd20處理間差異也均不顯著，但總體上均顯著低于Cd0和Cd5處理。其中，Cd20-CK、Cd20-Ri、Cd20-Fm、Cd20-RF 處理的比葉重、葉綠素a含量、葉綠素b含量和Pn分別較Cd0-CK、Cd0-Ri、Cd0-Fm、Cd0-RF 降低24.40%、19.10%、21.30%、16.59%，23.08%、19.26%、18.09%、12.47%，24.00%、25.19%、22.06%、16.28% 和27.07%、19.45%、19.92%、14.74%。

在相同Cd 含量脅迫條件下，接種AMF 處理比葉重均高于CK，表現(xiàn)為RF＞Fm＞Ri＞CK（表1）。在Cd0 和Cd5 條件下，4 個(gè)處理間差異均不顯著。在Cd10 和Cd20 條件下，RF、Fm 與CK 差異顯著，其中Cd10-RF、Cd20-RF 處理比葉重分別比Cd10-CK、Cd20-CK 提 高12.75%、14.56%；Cd10-Ri 處 理 與Cd10-RF 處理間差異顯著。在相同Cd 含量脅迫條件下，接種AMF 處理葉綠素a、葉綠素b 含量及Pn總體上均高于CK，僅Cd10-RF 處理葉綠素b 含量、Pn 差異顯著，分別較CK 提高20.41%、17.07%；不同接種AMF 處理間差異均不顯著。綜上，接種AMF可以改善小麥光合特性，減緩Cd 脅迫對(duì)小麥的傷害，以RF處理效果最好。

表1 Cd脅迫下接種AMF對(duì)小麥光合特性的影響Tab.1 Effect of AMF on photosynthetic characteristics of wheat under Cd stress

2.2 Cd脅迫下接種AMF對(duì)小麥抗氧化特性的影響

由表2 可知，無(wú)論是否接種AMF，小麥葉片MDA 含量及CAT、SOD、POD 活性均隨著土壤中Cd含量的增加而增加，總體上MDA 含量和CAT 活性表現(xiàn)為不同Cd 處理間差異顯著，SOD、POD 活性表現(xiàn)為Cd20 和Cd10 處理顯著高于Cd5 和Cd0 處理。其中，Cd20-CK、Cd20-Ri、Cd20-Fm、Cd20-RF 處理小麥葉片MDA 含量、CAT 活性、SOD 活性和POD 活性分別較Cd0-CK、Cd0-Ri、Cd0-Fm、Cd0-RF 處理提高103.81%、65.59%、70.77%、60.63%，66.37%、122.42%、118.75%、120.98%，105.23%、153.46%、145.84%、155.84%和114.49%、141.34%、143.18%、140.21%。

由表2可知，在Cd0條件下，接種AMF處理小麥葉片MDA 含量與CK 差異不顯著，且不同接種AMF處理間差異也不顯著；在Cd5、Cd10、Cd20 條件下，不同接種AMF 處理間小麥葉片MDA 含量差異不顯著，但均顯著低于CK，其中Cd20-Ri、Cd20-Fm、Cd20-RF 處理分別較Cd20-CK 降低14.22%、14.54%、17.30%。在Cd0、Cd5 條件下，接種AMF 處理小麥葉片CAT、SOD、POD 活性與CK 差異均不顯著，且不同接種AMF 處理間差異也均不顯著。在Cd10 條件下，Ri、Fm 處理間小麥葉片CAT、SOD、POD 活性差異不顯著，但均顯著高于CK。在Cd20條件下，不同接種AMF 處理間小麥葉片CAT、SOD和POD活性差異不顯著，但均顯著高于CK，Ri、Fm、RF 處理分別較CK 提高33.69%、32.08%、33.42%，22.14%、17.82%、24.54% 和 14.93%、14.48%、14.99%。綜上，接種AMF 可以提高小麥抗氧化能力，減緩Cd脅迫對(duì)小麥的傷害。

表2 Cd脅迫下接種AMF對(duì)小麥抗氧化特性的影響Tab.2 Effect of AMF on antioxidant properties of wheat under Cd stress

續(xù)表2 Cd脅迫下接種AMF對(duì)小麥抗氧化特性的影響Tab.2（Continued） Effect of AMF on antioxidant properties of wheat under Cd stress

2.3 Cd脅迫下接種AMF對(duì)小麥根際土壤酶活性的影響

由表3 可知，小麥根際土壤SC、CAT、UE、DHA活性均隨著土壤中Cd 含量的增加而降低。對(duì)于CK，Cd0、Cd5、Cd10 處理間SC、CAT 活性差異均不顯著，Cd0、Cd5 處理顯著高于Cd20 處理；對(duì)于接種AMF 處理，Cd0、Cd5 處理間和Cd10、Cd20 處理間SC、CAT 活性差異均不顯著，但Cd10、Cd20 處理顯著低于Cd0、Cd5 處理。對(duì)于CK，Cd5 與Cd10 及Cd10 與Cd20 處理間UE 活性差異不顯著，Cd0、Cd5處理顯著高于Cd20處理；對(duì)于接種AMF處理，Cd0、Cd5、Cd10、Cd20 處理間UE 活性差異顯著。對(duì)于CK，Cd0、Cd5 處理間DHA 活性差異不顯著，Cd10、Cd20 處理間差異也不顯著；對(duì)于接種AMF 處理，總體上Cd0 處理DHA 活性顯著高于Cd5 處理，且兩者均顯著高于Cd10、Cd20 處理。Cd20-CK、Cd20-Ri、Cd20-Fm、Cd20-RF 處理小麥根際SC、CAT、UE 和DHA 活性分別較Cd0-CK、Cd0-Ri、Cd0-Fm、Cd0-RF 處 理 降 低57.29%、53.96%、55.30%、53.89%，48.74%、49.13%、48.57%、50.73%，57.34%、59.78%、59.13%、60.14% 和 54.55%、44.23%、40.43%、42.00%。

表3 Cd脅迫下接種AMF對(duì)小麥根際土壤酶活性的影響Tab.3 Effect of AMF on rhizosphere soil enzyme activities of wheat under Cd stress U/g

由表3 可知，在相同Cd 含量脅迫條件下，接種AMF 處理小麥根際SC、CAT、UE、DHA 活性均高于CK，不同接種AMF 處理間差異不顯著。對(duì)于SC 活性，Cd0 條 件 下Ri、Fm、RF 處 理 較CK 分 別 提 高168.91%、177.67%、166.28%，Cd5 條件下分別提高192.61%、200.54%、197.84%，Cd10 條件下分別提高193.09%、187.51%、188.63%，Cd20 條件下分別提高189.84%、190.56%、187.48%。對(duì)于CAT 活性，Cd0條件下Ri、Fm、RF 處理較CK 分別提高187.81%、176.79%、191.68%，Cd5 條件下分別提高192.99%、179.18%、182.89%，Cd10 條件下分別提高196.57%、202.90%、190.77%，Cd20 條件下分別提高185.66%、177.74%、180.38%。對(duì)于UE 活性，Cd0 條件下Ri、Fm、RF 處理較CK 分別提高211.19%、190.91%、210.49%，Cd5 條件下分別提高190.38%、179.81%、191.35%，Cd10 條件下分別提高192.50%、201.25%、193.75%，Cd20 條件下分別提高193.44%、178.69%、190.16%。對(duì)于DHA活性，Cd0條件下Ri、Fm、RF處理較CK 分別提高136.36%、113.64%、127.27%，Cd5條件下分別提高152.94%、141.18%、147.06%，Cd10條件下分別提高161.54%、146.15%、161.54%，Cd20條件下分別提高190.00%、180.00%、190.00%。

3 結(jié)論與討論

植物進(jìn)行光合作用是一個(gè)高度自我調(diào)節(jié)的過(guò)程。植物葉片所積累的有機(jī)物的量在一定程度上可反映植物光合作用合成同化物的能力。比葉重和葉綠素含量反映了葉片的結(jié)構(gòu)和生理特性，且在一定程度上可以作為環(huán)境脅迫下植物光合能力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的Cd 污染會(huì)造成葉片葉綠素含量降低、葉綠體膨脹和變形、線粒體基粒片層松散、葉鞘細(xì)胞葉綠體類囊體解體，從而影響線粒體的電子傳遞及光合作用[3，18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤Cd 含量增加，小麥葉片比葉重、葉綠素含量和Pn 等光合指標(biāo)均明顯下降，接種AMF 可以有效緩解下降程度。這可能是由于接種AMF 影響葉片結(jié)構(gòu)，使葉片細(xì)胞排列更加緊密，植物葉片厚度、柵欄組織厚度均增加[20]。但在低Cd含量（Cd5）脅迫下，小麥葉片比葉重、葉綠素含量和Pn等光合指標(biāo)與Cd0 處理差異不顯著，說(shuō)明小麥自身對(duì)Cd 具有一定耐受性，此Cd 含量脅迫尚未對(duì)小麥光合系統(tǒng)造成影響。另有研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬脅迫下，接種AMF 可顯著提高葉片葉綠素含量、增加氣孔導(dǎo)度和水分利用效率，進(jìn)而提高光合能力[21]，本研究結(jié)果與其部分結(jié)果一致。

細(xì)胞膜是Cd 毒害植物的重要位點(diǎn)，在Cd 脅迫下，植物器官會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，導(dǎo)致植物體內(nèi)膜脂過(guò)氧化作用進(jìn)程加快，對(duì)植物產(chǎn)生毒害[22]。MDA 是膜脂過(guò)氧化作用的重要產(chǎn)物，其含量常作為衡量植物受損傷程度的標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是否接種AMF，小麥葉片MDA 含量均隨土壤中Cd 含量的增加而增加，但是接種AMF 能顯著降低Cd 脅迫下MDA 含量，這與前人[23]研究結(jié)果一致，說(shuō)明在Cd 脅迫下，接種AMF 可以有效緩解Cd 對(duì)植物細(xì)胞的毒害。

Cd 等重金屬進(jìn)入植物體內(nèi)會(huì)促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生，抗氧化酶能夠清除多余的活性氧，恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[24]。CAT、SOD 和POD 是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活性可以反映植物對(duì)逆境的耐受能力。研究發(fā)現(xiàn)，接種AMF 可顯著提高植物體內(nèi)抗氧化酶活性，增強(qiáng)植物對(duì)重金屬的耐受性[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，小麥葉片CAT、SOD 和POD 活性均隨著土壤中Cd 含量的增加而提高，在Cd0 和Cd5 條件下，接種AMF處理小麥葉片CAT、SOD 和POD 活性與CK 差異不顯著；在Cd20 條件下，接種AMF 處理小麥葉片CAT、SOD 和POD 活性顯著高于CK，這與前人[25]研究結(jié)果相似。表明接種AMF 可有效提高小麥在Cd脅迫條件下的抗氧化能力，且在Cd含量較高時(shí)作用更顯著。

土壤酶活性是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量和肥力的重要輔助指標(biāo)[26]，對(duì)于遭受重金屬污染的土壤，土壤酶活性可反映土壤的健康狀況。AMF 可以通過(guò)提高根際土壤酶活性，促進(jìn)植物根系對(duì)養(yǎng)分的吸收，進(jìn)而增強(qiáng)植物對(duì)重金屬的耐受性[27]。亓琳等[28]研究發(fā)現(xiàn)，接種AMF 可顯著提高鍶污染土壤中磷酸酶和轉(zhuǎn)化酶活性。付曉峰等[29]研究發(fā)現(xiàn)，接種AMF 可改善植物根際土壤環(huán)境，提高土壤微生物數(shù)量和土壤酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)，小麥根際土壤SC、CAT、UE、DHA活性均隨著土壤中Cd 含量的增加而降低，接種AMF 可顯著提高土壤SC、CAT、UE、DHA 活性，與前人[28-29]研究結(jié)果相似。綜上，在重金屬脅迫下，AMF可以通過(guò)多種機(jī)制改善植物根際土壤環(huán)境，并緩解重金屬對(duì)土壤酶活性的抑制作用，從而降低重金屬對(duì)土壤環(huán)境和植物的危害。

本研究所用AMF 均為常見(jiàn)菌種，同一Cd 脅迫下接種不同的AMF，小麥光合能力、膜脂過(guò)氧化程度、抗氧化特性和根際土壤酶活性總體上均未出現(xiàn)顯著差異，說(shuō)明所選AMF 真菌緩解Cd 污染的能力相近。但是否存在對(duì)重金屬污染有特異作用的AMF有待進(jìn)一步研究和篩選。