一株鯉源降血糖賴氨酸芽孢桿菌的篩選鑒定及其培養(yǎng)基優(yōu)化

于珺妃，夏邦華，郝其睿，鄒昊博，王鵬，陳中祥，高磊，吳松，黃麗，覃東立,4*，韓英

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 100070；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141)

糖類物質(zhì)的主要生理功能是為動(dòng)物機(jī)體提供能量，在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中，通常作為廉價(jià)的能量來源添加到飼料當(dāng)中。相較于陸生動(dòng)物，魚類特別是肉食性魚類對(duì)糖類物質(zhì)的利用能力較差[1]，甚至部分魚類先天性地具有糖尿病患者的某些生理特征[2]。飼料中添加過高的糖類物質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致魚類抗病力下降、生長速度減緩、死亡率增加等癥狀[3]。研究表明，鯉Cyprinuscarpio即便在空腹?fàn)顟B(tài)下，胰島素含量也遠(yuǎn)高于陸生哺乳動(dòng)物[4]；在葡萄糖耐受試驗(yàn)中，葡萄糖灌喂后絕大多數(shù)的魚都表現(xiàn)為持久的高血糖癥狀發(fā)生[5]。通常來說，腸促胰島素具有促進(jìn)胰島素分泌和抑制胰高血糖素分泌的功能，從而可以達(dá)到降血糖的作用，但是腸促胰島素易被二肽基肽酶-Ⅳ(DDP-Ⅳ)降解失去活性而無法起效。具有產(chǎn)DDP-Ⅳ抑制劑的菌株能夠抑制二肽基肽酶，延長腸促胰島素胰高血糖素樣肽(GLP-1)和胰島素釋放肽(GIP)的半衰期，從而間接達(dá)到降低血糖的目的[6-10]。

近年來，隨著人們對(duì)水產(chǎn)品需求的日益增加，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，人們更加關(guān)注提高水生生物品質(zhì)及其對(duì)自身健康的影響。魚類因攝食過多糖類，在體內(nèi)無法分解而造成大量糖尿病的情況至今無法徹底解決，而具有產(chǎn)DDP-Ⅳ抑制劑的菌株能夠間接降低血糖含量，從而成為抑制水生生物血糖含量的一種新途徑。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的具有產(chǎn)DDP-Ⅳ抑制劑的細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬Bacillus、假單胞菌屬Pseudomonas、變形桿菌屬Proteus、梭狀芽孢桿菌屬Clostridium、小球菌屬M(fèi)icrococcus、葡萄球菌屬Staphylococcus、八疊球菌屬Sporosarcina、無色桿菌屬Achromobacter、產(chǎn)堿桿菌屬Alcaligenes、黃桿菌屬Flavobacterium、賽氏桿菌屬Serratia、腸細(xì)菌屬Enterobacter和埃希氏桿菌屬Escherichia等[11-16]。

目前，關(guān)于從魚自身篩選出具有產(chǎn)DDP-Ⅳ抑制劑功能的賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillusfusiformis，進(jìn)而達(dá)到降低血糖含量的研究尚未見報(bào)道。

本研究中，利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的脫脂乳固體培養(yǎng)基，在鯉腸道內(nèi)含物中篩選出一株產(chǎn)DDP-Ⅳ抑制劑能力較強(qiáng)的益生菌，同時(shí)利用響應(yīng)面分析法對(duì)該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行改良，以期為賴氨酸芽孢桿菌大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來源：試驗(yàn)用德國鏡鯉由中國水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江水產(chǎn)研究所提供，隨機(jī)選擇健康的3尾1齡鯉(200 g±10 g)為試驗(yàn)樣本，所有試驗(yàn)操作符合動(dòng)物福利(歐洲動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指令2010/63/EU)相關(guān)規(guī)定。

2%脫脂乳固體培養(yǎng)基(SKM，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)：先配制20 mL 10%脫脂乳培養(yǎng)基，再準(zhǔn)確稱取1.4 g的瓊脂溶于80 mL蒸餾水中，兩種溶液于115 ℃條件下滅菌15 min，冷卻至60 ℃后在無菌條件下將兩種溶液混合均勻。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：將100 g剛剛長出嫩芽的新鮮黃豆芽，加蒸餾水100 mL，置于燒杯中加熱煮沸30 min，采用多層紗布過濾。用無菌水標(biāo)定，再加入蔗糖50 g，充分溶解，在高壓滅菌鍋中115 ℃下滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 將鯉用MS-222麻醉劑(250 mg/L)麻醉，使用無水乙醇擦拭鯉的體表，在超凈工作臺(tái)中用滅菌后的剪刀和鑷子進(jìn)行解剖，取出鯉的整條腸道，輕輕擠出內(nèi)含物，置于無菌棕色玻璃瓶中。

1.2.2 產(chǎn)DDP-Ⅳ抑制劑菌株的初篩 將鯉腸道內(nèi)含物，置于含玻璃珠和50 mL無菌水的錐形瓶中，以180 r/min室溫振蕩30 min，吸取0.5 mL的懸液放入盛有4.5 mL無菌水的試管中，振蕩均勻。依次從前一個(gè)試管中吸取0.5 mL的懸液加入后一個(gè)裝有4.5 mL無菌水的試管中，將懸液稀釋成10-3、10-4和10-53個(gè)梯度，從各梯度中分別取100 μL涂布于SKM培養(yǎng)基平板上，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于28 ℃下培養(yǎng) 24～48 h。采用乳蛋白水解圈方法篩選，挑取產(chǎn)生透明圈的分離物進(jìn)行純化[17]。

1.2.3 DDP-Ⅳ抑制活性的測(cè)定 對(duì)出現(xiàn)明顯乳蛋白水解圈的菌株進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)：在96孔板中，準(zhǔn)確滴加25 μL 1.6 mmol/L的甘氨酰(Gly)-脯氨酰(Pro)-對(duì)硝基苯胺(pNA)和25 μL細(xì)胞代謝物(CFS)或細(xì)胞內(nèi)容物(CFE)；在37 ℃下反應(yīng)15 min，再加入50 μL 0.01 U/mL DDP-Ⅳ，在37 ℃下繼續(xù)反應(yīng)1 h；最后加入100 μL 1 mol/L醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.0)終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在405 nm處檢測(cè)反應(yīng)溶液的吸光值[18]。

DDP-Ⅳ抑制率計(jì)算公式為

其中：A待測(cè)樣品為25 μL樣品+25 μL Gly-Pro-pNA+50 μL DDP-Ⅳ+100 μL醋酸鈉；A空白樣品為25 μL樣品+50 μL Tris-HCl+25 μL Gly-Pro-pNA+100 μL醋酸鈉；A陰性對(duì)照為25 μL Tris-HCl+25 μL Gly-Pro-pNA+50 μL DDP-Ⅳ+100 μL醋酸鈉；A陰性空白為75 μL Tris-HCl+25 μL Gly-Pro-pNA+100 μL醋酸鈉。

1.2.4 產(chǎn)DDP-Ⅳ抑制劑菌株的鑒定

16S rRNA鑒定：選用北京索萊寶生物科技公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，提取分離純化后的菌株DNA。采用細(xì)菌通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系(共25 μL)：10×緩沖液2.5 μL，Taq酶0.5 μL，引物27F 0.5 μL，引物1492R 0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性50 s，56 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1.5 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后再在72 ℃下延伸10 min，4 ℃下保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往RuiBiotech公司測(cè)序。通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)菌株16S rRNA的測(cè)序結(jié)果，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

生理生化鑒定：取保存的菌株在固體LB培養(yǎng)基平板上三區(qū)劃線，分離出單菌落并對(duì)其形態(tài)進(jìn)行描述，根據(jù)《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[19]對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色及生理生化鑒定。

1.2.5 培養(yǎng)基優(yōu)化 將活化好的菌種接種到LB培養(yǎng)基中，37 ℃下以180 r/min搖床培養(yǎng)10 h，制成種子液。

1)單因素試驗(yàn)。最佳碳源的篩選：在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的蔗糖、阿拉伯糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉和玉米粉，按0.5%的接種量接入種子液，在180 r/min、37 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)15 h，測(cè)定發(fā)酵液中OD600 nm吸光值。

最佳有機(jī)氮源的篩選：在添加最佳碳源的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蛋白胨、酵母粉、豆粕作為氮源，發(fā)酵條件同上。

最佳無機(jī)氮源的篩選：在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的尿素、(NH4)2SO4、NH4NO3和NH4Cl，同時(shí)加入相應(yīng)的最佳碳源和最佳有機(jī)氮源，發(fā)酵條件同上。

最佳無機(jī)鹽篩選：在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的MgSO4、KH2PO4、K2HPO4和CaCO3，同時(shí)加入相應(yīng)的最佳碳源及最佳有機(jī)與無機(jī)氮源，發(fā)酵條件同上。

2)響應(yīng)面分析?；趩我蛩睾Y選的最佳碳源、氮源及無機(jī)鹽的試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面分析軟件，以發(fā)酵液的OD600 nm值為優(yōu)化指標(biāo)，進(jìn)行條件優(yōu)化，從而獲得最優(yōu)培養(yǎng)基配方，并對(duì)配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按0.5%的接種量將菌株接種到響應(yīng)面優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，在180 r/min、37 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)15 h，測(cè)定發(fā)酵液中OD600 nm的吸光值，通過比較預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值驗(yàn)證模型的有效性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)，對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 12.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)DDP-Ⅳ抑制劑菌株的初篩

從鯉腸道內(nèi)含物樣品中分離得到具有產(chǎn)DDP-Ⅳ抑制劑的細(xì)菌共15個(gè)。選取蛋白分解能力較強(qiáng)的一株益生菌標(biāo)記為CR-3。在SKM固體培養(yǎng)基中，CR-3菌株的水解圈直徑(D)為0.30 mm，菌落直徑(d)為0.98 mm，D/d為3.27(圖1)。

圖1 CR-3菌株在SKM培養(yǎng)基中的乳蛋白水解圈Fig.1 Lactoprotein hydrolysis circles of CR-3 on SKM medium

2.2 DDP-Ⅳ抑制活性的測(cè)定

按照“1.2.3節(jié)”的方法測(cè)得，CR-3菌株在37 ℃時(shí)的DDP-Ⅳ抑制劑產(chǎn)率高達(dá)62.35%。

2.3 CR-3菌株鑒定

2.3.1 生理生化試驗(yàn) CR-3菌株在LB固體培養(yǎng)基中的菌落特征：菌落為圓形，無色透明狀，邊緣整齊，中間突起，有黏性，經(jīng)革蘭氏染色為革蘭氏陽性菌。CR-3菌株的部分生理生化指標(biāo)見表1，CR-3菌株與賴氨酸芽孢桿菌模式種的生理生化具有相同特征，由各項(xiàng)生理生化結(jié)果，推斷CR-3菌株可能為賴氨酸芽孢桿菌。

表1 CR-3菌株的生理生化特性Tab.1 Physiological and biochemical properties of strain CR-3

2.3.2 16S rRNA鑒定 對(duì)CR-3菌株的16S rRNA序列進(jìn)行測(cè)序后，在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CR-3菌株的16S rRNA基因序列與賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillusfusiformis(KP872951.1)一致性為99%。通過構(gòu)建CR-3菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，可以看出，CR-3與賴氨酸芽孢桿菌(KP872951.1)同處最小的一個(gè)分支，說明進(jìn)化距離較近。綜合生理生化試驗(yàn)、16S rRNA序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，將CR-3菌株鑒定為賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillusfusiformis(圖2)。

圖2 CR-3菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain CR-3

2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗(yàn) 細(xì)菌發(fā)酵液在OD600 nm處的數(shù)值可以作為衡量細(xì)菌生長程度的判別指標(biāo)。表2為賴氨酸芽孢桿菌CR-3在不同碳源培養(yǎng)基下發(fā)酵液的OD600 nm值，不同碳源培養(yǎng)基發(fā)酵液的OD600 nm值依次為蔗糖>乳糖>阿拉伯糖>麥芽糖>玉米粉>可溶性淀粉，故選擇蔗糖作為CR-3菌株的最佳碳源。

表2 CR-3菌株培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化Tab.2 Optimisation of carbon source for CR-3 strain medium

在添加最佳碳源的初始培養(yǎng)基中，分別添加不同種類的有機(jī)氮源和無機(jī)氮源，發(fā)酵液發(fā)酵15 h后進(jìn)行OD600 nm測(cè)定。從表3可知，不同有機(jī)氮源發(fā)酵液的OD600 nm值依次為酵母粉>豆粕>蛋白胨，從而確定CR-3菌株培養(yǎng)基的最佳有機(jī)氮源為酵母粉，但由于CR-3菌株在豆粕和酵母粉中的OD600 nm值差距較小，同時(shí)考慮到生產(chǎn)成本，故最后選擇豆粕作為最佳有機(jī)氮源；而在發(fā)酵培養(yǎng)基無機(jī)氮源的篩選中，NH4Cl的OD600 nm值要遠(yuǎn)高于其他無機(jī)氮源，故確定CR-3菌株的最佳無機(jī)氮源為NH4Cl。

表3 CR-3菌株培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化Tab.3 Optimisation of the nitrogen source for CR-3 strain medium

在添加最佳碳源和氮源初始培養(yǎng)基中，分別添加不同種類的無機(jī)鹽，從而對(duì)無機(jī)鹽的種類進(jìn)行篩選。從表4可見，添加不同無機(jī)鹽的發(fā)酵液OD600 nm值依次為CaCO3>K2HPO4>KH2PO4>MgSO4，從而確定賴氨酸芽孢桿菌CR-3的最佳無機(jī)鹽為CaCO3。

表4 CR-3菌株培養(yǎng)基無機(jī)鹽的優(yōu)化Tab.4 Optimisation of inorganic salts in CR-3 strain medium

2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的賴氨酸芽孢桿菌CR-3最佳碳源、有機(jī)氮源、無機(jī)氮源和無機(jī)鹽，選取蔗糖、CaCO3、NH4Cl和豆粕，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案，共設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)組，采用酶標(biāo)儀對(duì)發(fā)酵液OD600 nm進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表5所示，響應(yīng)面分析結(jié)果及方差分析結(jié)果如表6、表7所示。

表5 響應(yīng)面分析因素與水平Tab.5 Factors and levels in response surface analysis w/%

表6 響應(yīng)面分析結(jié)果Tab.6 Results of response surface analysis

表7 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Tab.7 ANOVA of Box-Behnken test results

響應(yīng)面是由試驗(yàn)因子的響應(yīng)值所構(gòu)成的3D空間曲面圖，能夠清晰地反映出最佳的優(yōu)化條件及各個(gè)因素間的交互作用。響應(yīng)面的圖形越陡峭，說明因素間的交互作用越顯著，相反,則說明因素間的交互作用比較微弱[20]。從圖3可見，蔗糖與 CaCO3的響應(yīng)面曲線最陡(圖3A)，且等高線呈橢圓，說明它們之間的交互作用顯著，而其他因素之間的響應(yīng)面曲線較為平緩，說明他們之間的交互作用不明顯。

圖3 各因素間交互作用對(duì)賴氨酸芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基OD600 nm影響的3D響應(yīng)面圖Fig.3 3D response surface plot of the effect of interaction between factors on OD600 nm of Lysinibacillus fusiformis fermentation medium

利用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到發(fā)酵培養(yǎng)基OD600 nm值(Y)的回歸擬合方程如下：

Y=1.31-3.125×10-3A+0.035B-0.021C+ 9.55×10-3D-0.038AB-3.975×10-3AD-7.5×10-5BD-0.065A2-0.10B2-0.15C2-0.050D2。

對(duì)上述二次回歸方程進(jìn)行方差分析，由表7可知，模型極顯著(P<0.01)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，說明所建立的模型可用于賴氨酸芽孢桿菌CR-3的培養(yǎng)基優(yōu)化。根據(jù)F值大小，各因素對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基OD600 nm值的影響程度依次為蔗糖>CaCO3>NH4Cl>豆粕，其中蔗糖、CaCO3和NH4Cl對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著(P<0.05)。對(duì)二次回歸方程進(jìn)行求解，進(jìn)而得到賴氨酸芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方為蔗糖1.46%、CaCO30.55%、NH4Cl 0.48%和豆粕2.10%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，此時(shí)預(yù)測(cè)OD600 nm值為1.313。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 初始發(fā)酵培養(yǎng)基的OD600 nm值為0.810。根據(jù)響應(yīng)面分析法得到賴氨酸芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方，在此條件下預(yù)測(cè)發(fā)酵液OD600 nm值為1.313。為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得賴氨酸芽孢桿菌CR-3發(fā)酵培養(yǎng)基中OD600 nm值為1.328，與預(yù)測(cè)值誤差較小，說明該方法可以較好地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果，回歸模型方程可靠。

3 討論

3.1 菌株的篩選及鑒定

中國的漁業(yè)資源非常豐富，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)尤為發(fā)達(dá)，但在飼養(yǎng)過程中會(huì)因?yàn)轱暳现泻械奶穷愇镔|(zhì)導(dǎo)致魚體中血糖含量上升。有文獻(xiàn)表明，魚類對(duì)糖類物質(zhì)分解能力有限，從而導(dǎo)致飼料的浪費(fèi)且不利于魚體健康，究其原因可能與以下因素有關(guān)：第一，胰島素在魚體血液中含量較低；第二，糖類物質(zhì)較難被魚體外周組織所利用；第三，相對(duì)于氨基酸等物質(zhì)，糖類物質(zhì)刺激魚類胰島素分泌的能力較弱；第四，魚體中腸促胰島素易被DDP-Ⅳ降解失去活性從而無法起到降糖作用[21]。為了解決DDP-Ⅳ降解腸促胰島素導(dǎo)致血糖上升的問題，本試驗(yàn)中從鯉腸道內(nèi)含物中，篩選得到一株具有DDP-Ⅳ抑制劑的益生菌CR-3。通過生理生化試驗(yàn)、16S rRNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，鑒定該菌株為賴氨酸芽孢桿菌，并且測(cè)定該菌株在37 ℃時(shí)的DDP-Ⅳ抑制劑產(chǎn)率高達(dá)62.35%。目前，對(duì)賴氨酸芽孢桿菌的研究多集中在纖維素的分解和重金屬的吸附，對(duì)于該菌株具有產(chǎn)DDP-Ⅳ抑制劑的研究尚未見報(bào)道。

3.2 CR-3菌株培養(yǎng)基最佳營養(yǎng)成分的確定

在相關(guān)研究中，邴輝[22]在地衣芽孢桿菌BacilluslicheniformisLCDD6的培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)中，確定最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為豆粕，最佳無機(jī)鹽為磷酸氫二鉀；王曉潔等[23]通過單因素試驗(yàn)考察碳源、氮源、無機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵短桿菌素Brevibacillinlaterosporus的影響，得到最佳碳源為40.0 g/L的蔗糖，最佳氮源為30.0 g/L的牛肉膏，最佳無機(jī)鹽離子為10.0 g/L的鎂離子，并將其作為主要影響因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。本研究中，通過單因素試驗(yàn)，探究了發(fā)酵培養(yǎng)基配方對(duì)賴氨酸芽孢桿菌CR-3發(fā)酵液OD600 nm的影響，確定出最優(yōu)碳源為蔗糖，最優(yōu)無機(jī)鹽為CaCO3，最優(yōu)無機(jī)氮源為NH4Cl，最優(yōu)有機(jī)氮源為豆粕。其中，豆粕作為有機(jī)氮源時(shí)，發(fā)酵液的OD600 nm值明顯優(yōu)于其他對(duì)照，這可能是由于豆粕在生產(chǎn)過程中經(jīng)益生菌發(fā)酵水解，產(chǎn)生大量具有獨(dú)特生理活性功能的活性肽，同時(shí)含有多種營養(yǎng)物質(zhì)(如乳酸、維生素和氨基酸)，能夠更大程度地滿足微生物的生長需求。除此之外，豆粕還具有價(jià)格低廉、原料易得等優(yōu)點(diǎn)，為下一步的大規(guī)模生產(chǎn)提供了成本上的便利[24]。

3.3 CR-3菌株發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

賴氨酸芽孢桿菌CR-3的發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗(yàn)是一種多因素多水平的優(yōu)化試驗(yàn)，且涉及多因素不同水平間的交互作用。采用響應(yīng)面分析法可以快速高效地在影響發(fā)酵液OD600 nm的因子中篩選出主要的影響因子，且利用回歸方程能更全面地找到整個(gè)區(qū)域的最優(yōu)解，避免因非主要成分所造成的資源浪費(fèi)及工作量的疊加。大量文獻(xiàn)表明，該統(tǒng)計(jì)學(xué)方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)，優(yōu)化后的理論預(yù)測(cè)值結(jié)果與驗(yàn)證試驗(yàn)的實(shí)測(cè)值接近，且優(yōu)化后的實(shí)測(cè)值較未優(yōu)化前有顯著性提升。孫承文等[25]在維氏氣單胞菌CA07滅活疫苗菌液發(fā)酵工藝的研究中，采用了響應(yīng)面優(yōu)化法，優(yōu)化結(jié)果較單因素最高活菌數(shù)值提高20.59%，實(shí)測(cè)結(jié)果與預(yù)測(cè)值結(jié)果基本相符。高繪菊等[26]在產(chǎn)漆酶DHJ-4菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化過程中，將爬坡試驗(yàn)與響應(yīng)面分析法相結(jié)合，優(yōu)化得出酶活力的平均值為410.04 U/mL，與預(yù)測(cè)值407.57 U/mL間誤差小于1%，較單因素試驗(yàn)結(jié)果提升9.5倍。李婷等[27]在降解纖維素酶的低溫放線菌T23-B的產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究中，得到該菌株纖維素酶最佳生產(chǎn)條件為甘露糖15.6 g/L、酵母浸粉7.8 g/L、初始pH 5.2、培養(yǎng)時(shí)間96 h、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、培養(yǎng)溫度35 ℃，最適產(chǎn)酶條件下纖維素酶活力高達(dá)123.43 U/mL，較優(yōu)化前提高了4.4倍。張麗等[28]在齊整小核菌發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基優(yōu)化研究中，最終得到的小核菌多糖最優(yōu)培養(yǎng)基多糖產(chǎn)量為(23.76±1.05)g/L，與預(yù)測(cè)值誤差為2.5%，相比原始培養(yǎng)基提高了54.42%。

本研究中，通過Box-Behnken試驗(yàn)分析確定出關(guān)鍵因素的最佳值，得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為蔗糖1.46%、CaCO30.55%、NH4Cl 0.48%和豆粕2.10%，得到發(fā)酵培養(yǎng)基OD600 nm的平均值為1.328，與預(yù)測(cè)值(1.313)相差較小。通過分析各變量間的3D曲面模型的陡峭程度，能夠迅速高效地呈現(xiàn)出各因素間的交互作用情況和影響發(fā)酵液OD600 nm的關(guān)鍵影響因子，說明該統(tǒng)計(jì)學(xué)方法能夠真實(shí)反映出碳源、氮源、無機(jī)鹽對(duì)賴氨酸芽孢桿菌CR-3生長的影響程度，同時(shí)也佐證了采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化賴氨酸芽孢桿菌CR-3的發(fā)酵培養(yǎng)基配方是科學(xué)可行的。

4 結(jié)論

1)本試驗(yàn)中采用SKM培養(yǎng)基從鯉腸道內(nèi)含物中篩選出15株具有產(chǎn)DDP-Ⅳ抑制劑的菌株，其中，CR-3菌株產(chǎn)DDP-Ⅳ抑制劑的能力最強(qiáng)，在 37 ℃時(shí)DDP-Ⅳ抑制劑產(chǎn)率高達(dá)62.35%，經(jīng)生理生化試驗(yàn)和16S rRNA測(cè)序，將CR-3菌株鑒定為賴氨酸芽孢桿菌。說明該賴氨酸芽孢桿菌能夠?qū)DP-Ⅳ產(chǎn)生抑制效果，從而間接地降低血糖，為進(jìn)一步提高鯉生存率提供了可能。

2)通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化獲得賴氨酸芽孢桿菌CR-3的液體培養(yǎng)基配方為蔗糖1.46%、CaCO30.55%、NH4Cl 0.48%和豆粕2.10%，在此條件下賴氨酸芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的OD600 nm值為1.328，比未優(yōu)化前的初始發(fā)酵培養(yǎng)基的OD600 nm值(0.810)提升了64%，本研究結(jié)果可為賴氨酸芽孢桿菌大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的數(shù)據(jù)參考。