用于生物微環(huán)境檢測的極性比例熒光探針制備及性能分析

李苗，金瀟儀，姜碩，孫萌，田野*

(1.大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034； 2.大連海洋大學 設施漁業(yè)教育部重點實驗室(大連海洋大學)，遼寧 大連 116023)

極性是一個復雜的物理參數，溶劑極性大小取決于除分子間氫鍵作用和能夠使溶質發(fā)生化學變化的溶劑作用之外，溶劑分子和溶質間所有可能的分子間相互作用[1-2]。在化學、化工領域，溶劑極性是推動化學反應進程的關鍵參數[3-6]。在生命科學領域，細胞極性變化與生理和病理過程密切相關[7]，如溶酶體極性能夠影響溶酶體膜流動性和溶酶體內酶促反應等[8]?；谏鲜鎏匦裕醒芯咳藛T通過監(jiān)控秀麗隱桿線蟲蟲體極性變化或比較處于不同糖尿病階段小鼠肝臟組織極性的大小，進而分析秀麗隱桿線蟲或小鼠生理、病理的發(fā)生和發(fā)展情況[9-10]。魚的病變也必然引起病變部位細胞極性的變化，通過監(jiān)測魚體極性變化對其病變部位進行定位和診斷，相比于傳統(tǒng)解剖方法具有檢測手段更加快速、準確且不會對生物體產生傷害的優(yōu)點。因此，對溶劑或生物微環(huán)境進行準確的極性檢測具有廣泛的應用前景。

熒光檢測法是通過分析熒光探針熒光強度、熒光壽命、比例熒光或其他熒光參數的變化，對離子[11-12]、小分子[13-14]、生物大分子濃度[15]及生物微環(huán)境參數[16-18]進行檢測的方法，該方法具有靈敏度高、特異性好、響應迅速和技術簡便等特點[19-28]。其中，極性響應型熒光探針通常由分子內電子給體(如氨基)、共軛連接區(qū)和電子受體組成，被光激發(fā)后可產生分子內電荷轉移(intramolecular charge transfer，ICT)，能更好地對微環(huán)境極性變化產生響應[2,29]。當周圍環(huán)境極性發(fā)生變化時，探針分子基態(tài)、激發(fā)態(tài)與溶劑間產生偶極-偶極相互作用，熒光發(fā)射強度會產生顯著變化，即分子基態(tài)、激發(fā)態(tài)間產生π→π*躍遷時，熒光發(fā)射峰強度隨溶劑極性的增強而降低，而當產生n→π*躍遷時，熒光發(fā)射強度則隨溶劑極性的增強而升高[30]。可見，構建光激發(fā)后同時具有π→π*與n→π*的雙分子躍遷熒光探針，即極性比例熒光探針，有利于對微環(huán)境極性變化進行準確的熒光檢測[31]。目前，極性比例熒光探針的構建尚無明確的理論依據，本文首次提出了極性比例熒光探針的構建方法，為熒光探針準確檢測極性提供了有效途徑。

本文中，以萘環(huán)為熒光團，首先構建具有電子推拉體系的熒光探針I(yè)A，再引入乙醇胺縮合形成含氮原子雜環(huán)，合成極性比例熒光探針I(yè)AN，通過測定熒光探針I(yè)A和IAN的吸收、熒光發(fā)射光譜，分析探針對溶劑極性的響應性能，并將制備的探針I(yè)AN應用于生物活體檢測，以期為準確檢測生物微環(huán)境極性變化的比例熒光探針構建提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物：試驗用雌性BALB/c小鼠(4～6周)購于大連醫(yī)科大學SPF實驗動物中心(體質量為16.0 g±2.0 g，6只)；珍珠龍膽石斑魚Epinephelusfuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂購于萊州明波水產有限公司(體質量為120.0 g±5.0 g，10尾)，健康珍珠龍膽石斑魚5尾，患肝膽綜合癥珍珠龍膽石斑魚5尾。

動物試驗嚴格遵守美國國立衛(wèi)生研究院出版的《實驗動物護理和使用指南》(2011年)。動物試驗方案獲得了動物倫理委員會大連理工大學研究倫理審查委員會的批準(倫理批準號為2018-043)。

試劑：化學試劑乙酸銨、丙二腈、苊酮、胍基乙酸、乙醇胺等高純度試劑均購于上海薩恩化學有限公司；分析純試劑甲苯、二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、1,4-二氧六環(huán)等均購于天津科密歐化學試劑有限公司。以上試劑未經過進一步處理，直接應用于反應和測試。

儀器設備：核磁共振波譜儀(Bruker Avance II，瑞士布魯克公司)；LC/Q-TOF-MS質譜儀(美國安捷倫公司)；熒光分光光度計(Aglient Technologies Eclipse，美國安捷倫公司)；紫外-可見分光光度計(Aglient Technologies Cary 60，美國安捷倫公司)；穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀(LP920，英國愛丁堡公司)；絕對光致發(fā)光量子產率儀(C11347，日本濱松公司)；單光子共聚焦激光掃描顯微鏡(FVl000，日本奧林巴斯公司)。

1.2 方法

1.2.1 熒光探針I(yè)A、IAN的制備路線 首先用乙酸銨和乙酸，在回流甲苯中催化丙二腈和原料苊酮I-1發(fā)生縮合反應，生成中間體化合物I-2；通過滴加胍基乙酸催化中間體化合物I-2與N, N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛繼續(xù)產生縮合反應，生成探針I(yè)A；攪拌狀態(tài)下，向含有IA的無水二氯甲烷溶液中滴加乙醇胺，反應溶液逐漸變?yōu)榱脸壬?，并析出沉淀，純化后獲得探針I(yè)AN。熒光探針I(yè)A和IAN的合成路線見圖1。

圖1 熒光探針I(yè)A和IAN的合成路線Fig.1 Synthesis pathway of fluorescent probes IA and IAN

1.2.2 熒光探針I(yè)A、IAN吸收光譜及熒光發(fā)射光譜的測定 首先通過空白溶劑對紫外-可見吸收光譜儀進行校正；再將相同體積的探針母液(濃度為20 mmol/L)稀釋并置于含不同極性測試溶劑的石英皿中(3 mL)，混合均勻后制得測試樣本，并將含有測試樣本的石英皿置于紫外-可見光譜儀測試倉中進行探針吸收光譜掃描；最后通過熒光光譜儀對上述測試樣本進行激發(fā)，獲得探針的熒光發(fā)射光譜，用熒光強度(I)表示。

Δf=(ε-1)/(2ε+1)-(n2-1)/(2n2+1),

(1)

εmix=faεa+fbεb，

(2)

(3)

其中：εa、na和fa分別為溶劑a的介電常數、折射率和在混合溶劑中的體積比；εb、nb和fb分別為溶劑b的介電常數、折射率和在混合溶劑中的體積比。

1.2.3 熒光探針I(yè)AN熒光量子產率及熒光壽命測定 首先在測試石英皿中加入空白溶劑，并用儀器自動校正。再將探針加入測試樣品池中(終濃度為0.1 mmol/L)，通過量子產率儀測量樣品的透射光子數和熒光發(fā)射光子數。探針的熒光量子產率(Φf)計算公式為

Φf=Np,em/Np,abs=Np,em/(Np,all-Np,trans)。

(4)

其中：Np,all為用于激發(fā)探針分子的全部光子數；Np,em、Np,abs和Np,trans分別為探針分子的發(fā)射、吸收和透射光子數。采用穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀測定探針熒光壽命(τ)。

1.2.4 Stokes’位移的計算及其與溶劑極性的關系

探針溶劑化變色效應和溶劑化熒光變色效應通過Lippert-Mataga公式計算得到[4]，即

(5)

其中：h為普朗克常數；c為真空中的光速；a為onsager腔半徑；Δf為溶劑極性；μe和μg分別為探針分子的基態(tài)偶極和激發(fā)態(tài)偶極；ε0為真空介電常數。當Δν和Δf可以被線性擬合時，表明探針與溶劑之間的相互作用為一般溶劑化效應；而當Δν和Δf線性擬合的斜率不同時，表明探針基態(tài)、激發(fā)態(tài)偶極矩差值(μe-μg)發(fā)生變化。

探針分子在特定溶劑中的Stokes’位移(Δν，cm-1)計算公式為

Δν=νabs-νem=(1/λabs-1/λem)×2π。

(6)

其中：λabs和λem分別為探針分子的吸收峰和發(fā)射峰波長。

1.2.5 熒光探針I(yè)AN對活體生物的檢測 將6只BALB/c雌性小鼠適應性喂養(yǎng)一周。在小鼠乳腺癌細胞4T1傳代時，將培養(yǎng)瓶中的4T1細胞消化、收集、離心后棄去細胞培養(yǎng)基，以1×108cells/mL的密度將細胞重新懸浮于PBS緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)中。構建腫瘤模型時，在每只BALB/c雌鼠左端側翼區(qū)皮下注射含上述4T1細胞的PBS懸浮液100 μL。腫瘤小鼠模型構建成功后，將雌性BALB/c小鼠的心臟、腎臟、肝臟、脾臟、肺和腫瘤組織取出，在體積分數為10%的中性緩沖福爾馬林中固定24 h后，包埋在石蠟中，通過冷凍切片機切成厚度為5 μm的切片。脫蠟后，用IAN(10 μmol/L,孵育1.5 h)對不同組織樣本進行染色，使用共聚焦激光掃描顯微鏡進行熒光觀察。

將健康和患肝膽綜合癥的珍珠龍膽石斑魚解剖取出肝臟，固定在體積分數為10%的中性緩沖福爾馬林溶液中，選出具有代表性的肝臟組織，切下相同位置和大小的組織，用石蠟包埋并切成厚度為5 μm的切片。脫蠟后，用IAN(10 μmol/L，孵育1.5 h)對不同組織樣品進行染色，使用共焦激光掃描顯微鏡進行熒光觀察,肝臟組織切片的平均熒光強度比值(I474 nm/I552 nm)可選取多處ROI的熒光比例同時進行定量分析獲得。

2 結果與分析

2.1 熒光探針I(yè)A和IAN的合成

2.1.1 中間體化合物I-2的合成 在無水甲苯中，通過滴加乙酸銨(0.55 g，濃度為7.1 mmol/L)和乙酸(2.25 mL，39.2 mmol/L)，催化丙二腈(2.36 g，35.7 mmol/L)和苊酮I-1(6.00 g，35.7 mmol/L)在加熱回流狀態(tài)下進行縮合反應。反應2 h后，將反應溶液冷卻并伴有固體析出，再將析出的固體產物過濾收集后，用乙醇、水和正己烷等溶劑先后進行潤洗，真空干燥得到橙黃色固體，即中間體化合物I-2(產量7.96 g，產率77%)。

化合物核磁氫譜數據：1H NMR (400 MHz, CDCl3)，δ為8.54 (d,J=7.4 Hz,1H)、8.12 (d,J=8.1 Hz, 1H)、7.83 (d,J=8.3 Hz,1H)、7.76 (t,J=7.8 Hz, 1H)、7.67～7.62(m, 1H)、7.51 (d,J=6.9 Hz,1H)、4.43 (s,2H)。

2.1.2 熒光探針I(yè)A的合成 通過滴加胍基乙酸(0.029 g，0.25 mmol/L)，催化中間體化合物I-2(0.540 g，2.5 mmol/L)與N, N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛(DMF-DMA，0.357 g，3.0 mmol/L)的縮合反應。反應溶液在100 ℃條件下，持續(xù)攪拌0.5 h，反應結束后，將反應溶劑蒸干，并將剩余物通過柱層析方法進行分離，提純目標化合物。硅膠柱層析分離提純化合物IA所用洗脫液為二氯甲烷。純化后的目標化合物經真空干燥后為深栗色固體，即產物IA(產量0.676 g，產率接近100%)。

化合物核磁氫譜數據：1H NMR (400 MHz, CDCl3)，δ為8.65 (d,J=7.4 Hz,1H)、8.57 (s, 1H)、7.96(d,J=8.1 Hz,1H)、7.67～7.59(m,2H)、7.52～7.47(m, 1H)、7.28(s,1H)、3.46(s,6H)。

2.1.3 熒光探針I(yè)AN的合成 向含有化合物IA(0.267 g，0.98 mmol/L)的無水二氯甲烷(5 mL)溶液中，逐滴加入乙醇胺(1.795 g，29.48 mmol/L，滴加時間為10 min)。在30 ℃下持續(xù)攪拌反應溶液4 h，反應溶液由淺紅色逐漸變?yōu)榱脸壬?，并伴有橙黃色固體沉淀析出。抽濾后，用乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷等溶劑先后對所得濾餅進行潤洗，真空干燥后得到橙黃色固體化合物，即終產物IAN(產量0.197 g，產率70%)。

化合物核磁氫譜數據：1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)，δ為8.36 (s，1H)、8.19 (d，J=7.1 Hz，1H)、8.12 (d，J=8.2 Hz，1H)、7.79 (d，J=15.7，8.1 Hz，2H)、7.72 (d，J=6.9 Hz，1H)、7.67～7.60 (m，1H)、4.10 (t，J=5.1 Hz，2H)、3.78 (t，J=5.1 Hz，2H)。

13C NMR (101 MHz，DMSO-d6)，δ為151.08、138.75、135.17、134.18、132.75、131.20、130.55、130.05、128.85、128.30、124.06、123.33、117.50、116.05、113.64、92.09、57.45、54.07。

HRMS(ESI，m/z)，化合物IAN的[M+H]+(C18H14N3O+)，測定值為288.113 1(理論值為288.113 1)。

2.2 溶液中熒光探針I(yè)A光譜的極性響應性能

通過混合不同體積分數的水和1,4-二氧六環(huán)，構建極性Δf=0.124～0.301的測試體系,在此體系中，探針I(yè)A的吸收峰位于540 nm，并在610 nm處出現了相應的熒光發(fā)射峰(圖2)。結合探針I(yè)A的熒光強度I610 nm與測試溶液極性Δf之間的Boltzmann擬合關系發(fā)現，探針I(yè)A的吸收峰位置和吸光度不隨極性變化而變化，但其在λ=610 nm處，熒光發(fā)射峰的強度隨著極性的增強而升高(圖3)。

圖2 探針I(yè)A在不同體積比的水和1,4-二氧六環(huán)混合溶劑中的吸收光譜及熒光發(fā)射光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra and fluorescence emission spectra of fluorescent probe IA in the mixtures of H2O and 1,4-dioxane with different volume ratios

圖3 探針I(yè)A的I610 nm與溶劑Δf的Boltzmann擬合關系Fig.3 Boltzmann fit of I610 nm versus Δf for fluorescent probe IA

2.3 溶液中熒光探針I(yè)AN光譜的極性響應性能

在不同極性測試體系中，對探針I(yè)AN進行光譜測試發(fā)現，IAN的吸光度不隨極性的變化而變化。但與探針I(yè)A不同的是，隨著極性的增大，探針I(yè)AN吸收峰從480 nm明顯藍移到420 nm(圖4)。與此同時，IAN的熒光發(fā)射峰也從552 nm明顯藍移到474 nm(圖5(a))。通過計算不同極性條件下探針在λ=474 nm和λ=552 nm處熒光強度的比值(I474 nm/I552 nm)可知，在Δf=0.124～0.316時,探針I(yè)474 nm/I552 nm值隨著測試溶液極性的升高而增加(圖5(b))。

圖4 探針I(yè)AN在不同體積比的水和1, 4-二氧六環(huán)混合溶劑中的吸收光譜Fig.4 UV-Vis absorption spectra of fluorescent probe IAN in the mixtures of H2O and 1,4-dioxane with different volume ratios

圖5 探針I(yè)AN在不同體積比的水和1,4-二氧六環(huán)混合溶劑中的熒光發(fā)射光譜及I474 nm/I552 nm與Δf的Boltzmann擬合Fig.5 Fluorescence emission spectra and Boltzmann fit of I474 nm/I552 nm versus Δf of fluorescent probe IAN in the mixtures of H2O and 1,4-dioxane with different volume ratios

2.4 不同極性溶劑對探針I(yè)AN光物理參數的影響

為分析探針I(yè)AN產生雙吸收和雙熒光發(fā)射峰的原因，對熒光探針I(yè)AN光物理參數隨極性變化的規(guī)律進行測定。在單一溶劑中，隨著測試溶劑極性的增強，探針I(yè)AN的吸收峰位于480 nm左右；當溶劑極性繼續(xù)增加，即Δf>0.260時，探針I(yè)AN的吸收峰波長藍移到420 nm附近，同時熒光發(fā)射峰波長也從550 nm附近藍移到480 nm附近(表1)。

表1 探針I(yè)AN在單一極性溶劑中的吸收和熒光發(fā)射波長Tab.1 Absorption and fluorescence emission wavelengths of fluorescent probe IAN in single solvents

將探針I(yè)AN溶解在水和1，4-二氧六環(huán)兩相溶劑的混合體系中，當溶劑極性較低(Δf<0.260)時，探針I(yè)AN的吸收峰、熒光發(fā)射峰分別位于480、552 nm；隨著兩相混合溶劑中水含量的增加，溶劑極性不斷增強，探針位于552 nm發(fā)射峰的熒光量子產率和熒光壽命不斷降低；當溶劑極性較高(Δf≥0.260)時，探針I(yè)AN的吸收峰、熒光發(fā)射峰分別藍移到420、474 nm；隨著溶劑極性的上升，探針的熒光強度不斷增強，同時伴有探針熒光量子產率Φf和熒光壽命τ的增加(表2)。

表2 熒光探針I(yè)AN在不同極性混合溶劑中的光物理數據Tab.2 Photophysical data of fluorescent probe IAN in mixed solvents with different polarity

2.5 探針I(yè)AN溶劑極性特異響應特性的判定

從圖6可見：當單相溶劑(或兩相混合溶劑)極性Δf為0.000～0.250時，探針I(yè)AN的Stokes’位移與測試體系極性間的關系可通過線性函數Linear fit 1進行擬合；當單相溶劑(或兩相混合溶劑)極性Δf為0.250～0.350時，探針I(yè)AN的Stokes’位移與測試體系極性間的關系可通過線性函數Linear fit 2進行擬合。可見,探針I(yè)AN的Stokes’位移在測試體系極性Δf處于0.260左右時產生明顯的變化，此結果與探針I(yè)AN吸收峰、熒光發(fā)射峰在Δf處于0.260附近時產生明顯移動的結果一致。

圖6 探針I(yè)AN在不同極性溶劑中的Stokes’位移與溶劑極性的線性擬合Fig.6 Linear fit of Stokes’ shift versus the solution polarity for fluorescent probe IAN

探針I(yè)AN的Δf和Δν數據點可以被線性擬合，表明溶劑與溶質之間的相互作用為一般溶劑化效應，不存在如分子間氫鍵作用等特殊溶劑化效應。

而由Linear fit 1與Linear fit 2的斜率不同,可以推測出：當測試體系極性Δf在0.260附近時，探針I(yè)AN分子基態(tài)、激發(fā)態(tài)偶極矩差值(μe-μg)發(fā)生改變，再次證明了探針分子IAN隨著溶劑極性的變化存在兩種分子躍遷路徑。

2.6 探針I(yè)AN對小鼠和珍珠龍膽石斑魚組織檢測的應用

應用共聚焦顯微鏡對小鼠各組織染色切片進行3D熒光成像(λem=460～500 nm)，結果顯示，小鼠的心臟和腎臟組織切片熒光最強，肝臟組織切片熒光強度次之，脾臟和肺部組織切片熒光強度稍弱，而腫瘤切片熒光強度最弱(圖7)。

圖7 熒光探針I(yè)AN在小鼠不同組織中的3D熒光成像圖Fig.7 3D fluorescence images of fluorescent probe IAN in different tissues of mice

利用探針I(yè)AN對健康和患有肝膽綜合癥的珍珠龍膽石斑魚肝組織進行檢測，結果顯示，病變肝組織的熒光強度比值極顯著低于健康肝組織(P<0.01)(圖8)，這表明IAN可有效地識別健康和病變組織，在魚病的診斷方面具有潛在的應用價值。

**表示有極顯著性差異(P<0.01)。 ** means very significant difference(P<0.01).圖8 熒光探針I(yè)AN對珍珠龍膽石斑魚肝組織的檢測Fig.8 Detection of hybrid grouper liver with fluorescent probe IAN

3 討論

3.1 極性響應型熒光探針的構建方法

細胞極性是很多細胞重要活動的基礎，也是復雜生物組織、器官形成和功能的基礎[32]。雖然在化學、化工領域，針對極性的研究已經十分透徹，但由于生物微環(huán)境精細且復雜，活細胞中極性的直接測定較為困難，而極性響應型熒光探針的出現，恰好解決了這一難題。通常來說，極性響應型熒光探針一般由共軛連接體和位于兩端的推電子和拉電子基團共同組成，有利于電子推拉體系形成。Xiao等[9]在2016年報道了第一例位于近紅外區(qū)(NIR)的超靈敏極性熒光探針MCY-BF2，該探針由具有親脂性側鏈的花菁和雙氟硼酸酯組成，其中叔胺和二氟硼酸酯基團分別作為給電子基團和吸電子基團，形成強烈的電子推-拉體系，能夠產生響應極性變化的單熒光發(fā)射峰。2017年，Jiang等[33]開發(fā)了雙光子溶酶體極性探針Lyso-OC，通過檢測自噬過程中Lyso-OC熒光強度的變化，可對自噬小體形成后溶酶體的極性變化進行監(jiān)控。然而，由于細胞微環(huán)境內熒光探針濃度、流體光學特性和實驗儀器等參數波動的影響，單發(fā)射熒光探針雖然可監(jiān)控極性變化，但無法準確計算生物微環(huán)境極性的確切數值。因此，亟待開展極性響應型比例熒光探針的設計、合成和構建方法的探索。

本研究中，根據探針I(yè)A熒光強度隨極性增強而升高的變化規(guī)律可知，探針I(yè)A被光激發(fā)后主要產生n→π*躍遷。不同于探針I(yè)A只產生n→π*躍遷，探針I(yè)AN分子將氨基縮合成環(huán)后，增強了氮原子上的孤對電子與π體系的共軛能力，激活的探針I(yè)AN產生雙吸收峰(420 nm和480 nm)和雙熒光發(fā)射峰(474 nm和552 nm)。由于π→π*分子躍遷產生熒光發(fā)射峰的強度隨極性升高而降低，n→π*分子躍遷熒光發(fā)射強度隨極性升高而增強，探針I(yè)AN能夠同時產生n→π*和π→π*分子躍遷，故IAN可作為比例熒光探針，對極性進行靈敏且準確地檢測。此外，應用本研究中提出的引入氮原子進行雜環(huán)縮合進而構建極性響應型比例熒光探針的方法，可靈活引入嗎啉、三苯基膦等細胞器定位基團。根據上述方法，不僅可以構建避免探針濃度、檢測環(huán)境及底物和光漂白等因素影響的極性響應型比例熒光探針，還可以對特定細胞器部位進行精準定位，簡便、高效且準確地對細胞器極性進行檢測。

3.2 熒光探針I(yè)AN對細胞及生物組織極性的檢測

近幾年，大量熒光探針被應用于生物微環(huán)境內極性的檢測，無論探針性能還是其生物應用，都取得了重大進展。目前，許多極性熒光探針檢測范圍較窄，只實現了亞細胞器層級的極性檢測，難以對復雜生理、病理過程中極性的變化進行研究。2015年，Jiang等[34]開發(fā)了一例比例型熒光傳感器BOB，用于線粒體極性的檢測。該探針通過對正常細胞與癌細胞進行比例熒光成像，揭示了癌細胞的線粒體極性比正常細胞低這一病理現象。此外，Li等[35]也報道了一種羥基部花菁熒光探針HXPI-P，用于檢測線粒體極性變化，通過進行HXPI-P比例熒光成像，可以監(jiān)測到饑餓或雷帕霉素誘導線粒體自噬產生時線粒體極性減小的現象。本研究中，IA作為熒光探針，在Δf=0.124～0.301范圍內，其熒光強度對極性變化產生響應；而隨著極性的增大，探針I(yè)AN吸收峰從480 nm(Δf=0.124～0.253)藍移到420 nm(Δf=0.263～0.316)，其熒光發(fā)射峰也從552 nm明顯藍移到474 nm。通過對探針I(yè)AN熒光強度比值I474 nm/I552 nm與溶液極性Δf進行Boltzmann擬合發(fā)現，在Δf=0.124～0.316范圍內，I474 nm/I552 nm值隨著極性的升高而增加。因此，探針I(yè)AN能夠作為比例熒光探針，對極性變化進行靈敏且范圍廣的檢測。鑒于上述特性，應用IAN可以對復雜生理、病理過程中極性的變化進行監(jiān)控。本研究中，根據對小鼠組織的3D熒光成像結果和探針I(yè)AN在λem=480 nm處熒光強度隨極性變化規(guī)律可知，小鼠心臟和腎臟組織極性最強，肝臟、脾臟和肺部組織極性較弱，小鼠腫瘤組織極性最低?？紤]到水是極性物質，因此，推測上述結果的產生是由于各器官組織含水量不同所引起的。同時，結合探針I(yè)AN熒光強度比值I474 nm/I552 nm與溶液極性大小之間的Boltzmann函數關系，對比健康和肝膽綜合癥病變的珍珠龍膽石斑魚肝組織I474 nm/I552 nm的比例熒光成像結果可知，石斑魚病變肝組織的比例熒光強度極顯著低于正常肝組織。這表明，IAN可有效地識別健康和病變組織，在魚病的診斷方面具有潛在的應用價值。

綜上，本研究中合成的探針I(yè)AN，不僅可以靈敏響應細胞內極性環(huán)境的變化，進行準確便捷地實時監(jiān)測，還可以探究生理、病理過程中生物組織極性的變化，期望可為日后動物疾病的診斷與治療提供有效指導。

4 結論

1)本研究中，設計合成了以萘環(huán)為主體的極性熒光探針I(yè)A和IAN。其中，探針I(yè)A產生單一吸收峰，并具有單熒光發(fā)射峰，且探針I(yè)A熒光強度隨著溶液極性升高而增強，而探針I(yè)AN不但產生雙吸收、雙熒光發(fā)射峰，且可以對溶液極性變化產生靈敏的比例熒光響應。

2)本研究中，引入氮原子進行雜環(huán)縮合進而構建極性響應型比例熒光探針的方法，不但可以構建避免探針濃度、檢測環(huán)境、底物和光漂白等因素影響的極性響應型比例熒光探針，還可以對特定細胞器部位進行精準定位，簡便、高效且準確地對細胞器極性進行檢測。