皮氏蛾螺黏液粗蛋白對肝癌細胞增殖及荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

于凌慧，趙譚軍，陳思夢，李娜，徐靜，李春茂，湛垚垚，常亞青*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學 生物科學技術學院，遼寧 沈陽 110866； 2.大連海洋大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023； 3.大連醫(yī)科大學 病理學與病理生理學教研室，遼寧 大連116000；4.大連海洋島水產(chǎn)集團股份有限公司，遼寧 大連 116500)

皮氏蛾螺VolutharpaampullaceaPerryi 隸屬于軟體動物門 Mollusca 腹足綱 Gastropoda 新腹足目 Neogastropoda 蛾螺科 Buccinoidea 渦屬螺屬Mosusogai，自然分布范圍比較狹窄，在中國主要分布于黃渤海北部海域[1]。由于皮氏蛾螺的足部與太平洋鮑魚Haliotisdiscus比較相似，且價格較鮑魚低廉，因此，在市場上常常被作為鮑魚的替代品售賣，俗稱“假鮑魚”[2]。近年來，隨著對皮氏蛾螺基礎生物學研究的不斷深入，關于皮氏蛾螺體內(nèi)活性物質(zhì)的研究逐漸受到人們的關注。2015年，Wang等[3]研究了皮氏蛾螺的腹足、內(nèi)臟和性腺組織中多糖的結(jié)構(gòu)和種類，為其營養(yǎng)價值和商業(yè)價值提供了參考信息。2017年，孫美玲[4]分離純化了皮氏蛾螺組織酶解液中兩種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin convert enzyme，ACE)抑制肽，可作用于ACE達到降血壓的效果。2019年，He等[5]從皮氏蛾螺肌肉蛋白酶水解物中獲得了一種潛在的能夠抑制髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性多肽，在藥物和功能性食品的開發(fā)中具有應用潛力。2020年，Zhao等[6]研究發(fā)現(xiàn)，皮氏蛾螺足部分泌的黏液中富含多種藥理成分，是一種具有開發(fā)潛力的海洋源生物活性資源。

肝癌(liver cancer)是生存率低、死亡率高的多誘因(病毒、損傷和遺傳等)肝臟惡性腫瘤，可分為原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌兩大類[7]。據(jù)統(tǒng)計，2020年中國原發(fā)性肝癌發(fā)病率位列國內(nèi)癌癥發(fā)病率第五位，而肝癌死亡率則位列中國癌癥死亡率的第二位[8]。在肝癌治療方面，目前中國采取的策略主要包括手術、消融(ablation)、靶向藥物、免疫治療和中藥治療等[9]。雖然這些策略在一定程度上改善了中國肝癌患者的整體預后并降低了肝癌死亡率，但仍存在術后復發(fā)、轉(zhuǎn)移和副作用明顯等問題，中國肝癌的高發(fā)病率和高致死率問題仍十分嚴峻。因此，尋找新的肝癌治療靶點，開發(fā)靶向性強且安全的新型藥物，以及制定更為有效的肝癌治療方案一直是醫(yī)學研究的熱點和焦點。

本課題組前期研究顯示，0.66 g/L(質(zhì)量濃度，下同)的皮氏蛾螺黏液粗蛋白可顯著抑制人肝癌細胞Hep-G2的增殖[6]，但是，粗蛋白抑制人肝癌細胞Hep-G2增殖的具體機制及其是否能在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用等問題，尚未展開研究。本研究中，以人肝癌細胞Hep-G2和H22荷瘤小鼠為研究對象，采用顯微觀察、流式細胞術和qRT-PCR等技術，分別通過體外和體內(nèi)試驗，分析比較了0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白對Hep-G2細胞的增殖及H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響，以期全面評估和掌握皮氏蛾螺作為海洋源生物活性物質(zhì)資源的開發(fā)潛力，為開發(fā)新型海洋源天然抗肝癌藥物提供新的線索和參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 試驗用野生皮氏蛾螺采自中國遼寧省大連市海洋島海域(東經(jīng)123°28′，北緯39°01′)，轉(zhuǎn)運至農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室暫養(yǎng)，用于黏液收集。暫養(yǎng)條件：pH為7.83±0.01，鹽度為29.97±0.15，海水溫度為(8.37±0.05)℃，溶解氧含量充足，暫養(yǎng)期間不投喂，循環(huán)水養(yǎng)殖。

試驗用12只雌性Balb/c小鼠體質(zhì)量為(21±1) g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司(許可證號：SYXK(遼)2018—0007)，于大連醫(yī)科大學實驗動物中心飼養(yǎng)(SPF標準)，適應性飼養(yǎng)一周后開始正式試驗。飼養(yǎng)條件：室溫為18～22 ℃，濕度為50%～60%，12 h亮-暗交替照明，小鼠自由進食標準飼料和飲用水。

1.1.2 細胞系 人肝癌細胞Hep-G2購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；小鼠肝癌細胞H22(腹水型)由大連醫(yī)科大學病理學教研室凌茂英教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 皮氏蛾螺黏液粗蛋白提取 分別提取所收集的皮氏蛾螺黏液的水溶性總蛋白和膜總蛋白(脂溶性蛋白)。

水溶性總蛋白提取方法：將黏液與純水按照體積比為1∶5置于燒杯中，于磁力攪拌器中4 ℃下攪拌1 h，以10 000 r/min離心 20 min后取上清液，即為水溶性總蛋白。

膜總蛋白提取方法：將黏液與純水按照體積比為1∶5～1∶10混勻后于冰浴中進行超聲破碎，超聲破碎20 s間隔 10 s，共進行4個循環(huán)，以10 000 r/min離心20 min，棄上清液，利用膜總蛋白提取試劑盒提取膜總蛋白；將膜總蛋白溶于含有終體積分數(shù)為0.02%的TritonX-100水溶液中，得到膜總蛋白溶液。合并所提取的水溶性總蛋白和膜總蛋白溶液，即獲得皮氏蛾螺黏液粗蛋白。

1.2.2 皮氏蛾螺黏液粗蛋白濃度測定 將8 μL皮氏蛾螺黏液粗蛋白與72 μL PBS放入無菌1.5 mL EP管中冰上混合均勻，用量程為20 μL的移液器(德國Eppendorf公司)吸取上述混合液20 μL于干凈的96孔板中，重復3個復孔。將A液與B液根據(jù)BCA試劑盒(北京賽文創(chuàng)新生物公司)說明書方法配制成工作液。向加有粗蛋白的3個孔中分別加入200 μL BCA工作液，將96孔板于37 ℃恒溫箱中避光孵育30 min，用酶標儀(NEO 2，美國BioTek公司)檢測波長570 nm處的吸光值，根據(jù)標準曲線計算皮氏蛾螺黏液粗蛋白濃度。

1.2.3 細胞形態(tài)學觀察 取對數(shù)生長期的人肝癌細胞Hep-G2接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，使其匯合度為80%～90%。處理組加入含有0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白的完全MEM培養(yǎng)基(南京凱基公司)，對照組加入完全MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，于光學顯微鏡(E100，日本Nikon公司)下觀察細胞形態(tài)學的變化。吸棄培養(yǎng)液，用體積分數(shù)為0.25%的胰酶消化后收集細胞懸液于 5 mL離心管中，以1 000 r/min室溫下離心5 min后棄上清液，用PBS清洗2次離心管，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，以1 500 r/min室溫下離心8 min。棄上清液后，加入1 mL體積分數(shù)為2.5%的戊二醛(4 ℃)過夜固定。按照透射電鏡(HT7700，日本日立公司)的常規(guī)方法制片，觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 流式細胞術 取對數(shù)生長期的人肝癌細胞Hep-G2接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，使其匯合度為80%～90%。接種12 h后，待細胞完全貼壁，處理組以換液形式加入含0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白的培養(yǎng)基，對照組同時換液為完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)12 h 后，用體積分數(shù)為0.25%的胰酶消化細胞，用PBS清洗2次后4 ℃下固定在體積分數(shù)為70%的乙醇中。離心去乙醇，加入碘化丙啶(PI)染液后室溫下避光孵育30 min。上機檢測前樣本經(jīng)48 μm尼龍篩過濾一次。采用流式細胞儀(FACS Calibur，美國BD公司)檢測，記錄激發(fā)波長488 nm的紅色熒光，計算細胞周期各時相細胞數(shù)占比。

1.2.5 qRT-PCR 取對數(shù)生長期的人肝癌細胞Hep-G2接種于滅菌6孔板中，待細胞全部貼壁后，處理組加入含有0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白的完全MEM培養(yǎng)基，對照組加入完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，收集對照組和處理組細胞，并按照RNA試劑盒(美國Invitrogen公司，貨號15596026)步驟抽提。采用紫外分光光度計(Nanodrop 2000，美國Thermo Fisher公司)測定溶液中的總RNA濃度，定量1 μg，加入5×PrimeScript RT Master Mix(ABM公司) 4 μL，再加無菌水補至20 μL，混合均勻后，按以下程序進行反轉(zhuǎn)錄：25 ℃ 10 min、42 ℃ 50 min、85 ℃ 5 min。然后用無菌水將反轉(zhuǎn)錄好的 cDNA 稀釋10倍后作為模板，利用PCR檢測細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因(CDKN1A/p21)、細胞周期蛋白cyclin B基因(CCNB1)和細胞周期蛋白依賴性激酶基因(CDK1)的mRNA表達水平，同時選β-actin為內(nèi)參基因，所用引物序列如表1所示。

PCR反應體系(共10 μL)：上、下游引物各0.5 μL，2×Taq酶5 μL，cDNA定量0.5 μg，用ddH2O補足至10 μL。PCR擴增程序：94 ℃下預變性5 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，退火復性30 s(各退火溫度見表1)，72 ℃下延伸30 s，共進行32個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸5 min，4 ℃或 -20 ℃下保存。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2.6 動物體內(nèi)試驗

H22細胞的制備：用無菌PBS調(diào)整小鼠肝癌細胞H22濃度為1×108cells/mL的單細胞懸液，按0.2 mL/只腹腔注射4只Balb/c小鼠，5～7 d后無菌操作抽取腹水。將腹水離心去上清液，用無菌PBS洗滌兩次，將獲得的H22細胞濃度用無菌PBS調(diào)整為4×107cells/mL，備用。

H22荷瘤小鼠模型的建立：將上述制備的H22細胞按0.2 mL/只接種于12只Balb/c小鼠右前肢腋下，并記為第0天，24 h后將12只小鼠隨機分成3組，每組4只(圖1)。每周連續(xù)5 d記錄小鼠體質(zhì)量，用游標卡尺測量腫瘤體積并觀察小鼠的飲食情況和精神狀態(tài)。

A—腋下種瘤；B—預防組給藥；C—模型對照組和治療組給藥；D—小鼠取樣。A—tumor implanted under the armpit; B—prevention groups administered; C—model control and treatment group administered; D—mice treated for sampling.圖1 小鼠肝癌細胞H22荷瘤模型的建立和處理示意圖Fig.1 Schematic diagram of establishment and treatment of mouse hepatocellular carcinoma H22 transplantation tumor model

分組與給藥：

1)模型對照組。至小鼠腫瘤體積為80～100 mm3(第3天)時，每天在腫瘤周圍皮下注射30 mg/kg(體質(zhì)量)的無菌PBS至試驗結(jié)束(第18天)。

2)預防組。從第1天開始，每天在腫瘤周圍皮下注射30 mg/kg(體質(zhì)量)的皮氏蛾螺黏液粗蛋白至試驗結(jié)束(第18天)。

3)治療組。至小鼠腫瘤體積為80～100 mm3(第3天)時，每天在腫瘤周圍皮下注射30 mg/kg(體質(zhì)量)的皮氏蛾螺黏液粗蛋白至試驗結(jié)束(第18天)。

1.2.7 小鼠體質(zhì)量和肝脾臟器指標的測定 末次注射粗蛋白24 h后記錄各組小鼠體質(zhì)量，斷頸處死小鼠。快速分離肝臟、脾臟等臟器并剝離瘤體，觀察腫瘤形態(tài)，稱重并記錄。肝臟(脾臟)指數(shù)(%)計算公式為

肝臟(脾臟)指數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100%。

(1)

抑瘤率=[對照組平均瘤質(zhì)量(g)-處理組平均瘤質(zhì)量(g)]/對照組平均瘤質(zhì)量(g)×100%。

(2)

1.2.8 小鼠荷瘤生長狀態(tài)觀察 每周連續(xù)5 d注射，注射前用游標卡尺測量3組小鼠的腫瘤體積，稱量3組小鼠的體質(zhì)量至試驗結(jié)束。觀察荷瘤小鼠的行為飲食及精神狀態(tài)。腫瘤體積(mm3)計算公式為

腫瘤體積=0.5×長徑(mm)×短徑2(mm2)。

(3)

1.2.9 蘇木精-伊紅(H.E)染色 切取部分瘤體于體積分數(shù)4%的多聚甲醛中固定，石蠟切片(HistoCore BIOCUT，德國徠卡公司)，常規(guī)H.E染色，在光學顯微鏡下觀察腫瘤組織病理改變情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用GraphPad Prism Version 6軟件(GraphPad Software，美國)對人肝癌細胞Hep-G2細胞周期及其相關基因表達量進行t檢驗；采用SPSS 26.0軟件對小鼠體質(zhì)量、肝脾指數(shù)、瘤質(zhì)量、瘤體積進行單因素方差分析，用Duncan法進行組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮氏蛾螺黏液粗蛋白處理后人肝癌細胞Hep-G2形態(tài)學和超微結(jié)構(gòu)的變化

光學顯微觀察顯示，經(jīng)0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白處理12 h后，人肝癌細胞Hep-G2的細胞密度明顯低于對照組，且細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化(圖2A)，表現(xiàn)為細胞體皺縮、變圓(圖2B)。進一步的細胞超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，經(jīng)0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白處理12 h后，人肝癌細胞Hep-G2的胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，細胞表面微絨毛減少，細胞核濃縮、變形嚴重，線粒體腫脹，核膜界限模糊(圖2D、圖2F)。這表明，0.66 g/L的皮氏蛾螺黏液粗蛋白可顯著改變?nèi)烁伟┘毎鸋ep-G2的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)。

A、B為對照組和處理組細胞的光學顯微結(jié)構(gòu)；C、E為對照組細胞超微結(jié)構(gòu)；D、F為處理組細胞超微結(jié)構(gòu)。黑色箭頭示胞體皺縮、變圓(B)，紅色箭頭示細胞空泡化(D)，白色箭頭示核膜(E、F)，藍色箭頭示腫脹的線粒體結(jié)構(gòu)(F)。A and B are the microstructures of the cells in the control and treatment groups under a light microscope； C and E are the ultrastructures of the cells in the control group； D and F are the ultrastructures of the cells in the treatment groups. The black arrows show the wrinkling and rounding of the cytosol (B)， the red arrows show the cell vacuolation (D)， the white arrows show the nuclear membrane (E,F) and the blue arrows show the swollen mitochondrial structure (F).圖2 皮氏蛾螺黏液粗蛋白處理12 h后人肝癌細胞Hep-G2形態(tài)學和超微結(jié)構(gòu)的變化Fig.2 Changes in morphology and ultrastructure of human hepatocellular Hep-G2 treated with crude protein from the mucus of the whelk Volutharpa ampullacea Perryi for 12 h

2.2 皮氏蛾螺黏液粗蛋白對人肝癌細胞Hep-G2細胞周期的影響

采用流式細胞儀,檢測了經(jīng)皮氏蛾螺黏液粗蛋白處理后的人肝癌細胞Hep-G2在細胞周期各時相(G0/G1期、S期、G2/M期)細胞數(shù)量的變化情況。結(jié)果顯示：對照組人肝癌細胞Hep-G2在G0/G1期和S期的細胞數(shù)所占比例分別為(52.20±0.42)%、(20.00±3.82)%，經(jīng)0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白處理12 h后，細胞數(shù)所占比例分別下降為(43.70±4.95)%、(18.40±0.14)%，且均無顯著性差異(P>0.05)；對照組人肝癌細胞Hep-G2在G2/M期細胞數(shù)所占比例為(21.25±0.07)%，經(jīng)0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白處理12 h后，細胞數(shù)所占比例顯著升高至(32.40±1.56)%(P<0.05)(圖3)。這表明，0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白可以阻滯人肝癌細胞Hep-G2的細胞周期于G2/M期。

*表示與對照組有顯著性差異(P<0.05)。 *means significant difference compared with the control (P<0.05).圖3 皮氏蛾螺黏液粗蛋白誘導人肝癌細胞Hep-G2 12 h后細胞周期各時相細胞數(shù)占比Fig.3 Proportion of cell number in each phase of cell cycle in human hepatoma Hep-G2 cells treated with crude protein from the mucus of the whelk Volutharpa ampullacea Perryi for 12 h

2.3 皮氏蛾螺黏液粗蛋白對Hep-G2細胞G2/M期相關基因表達的影響

細胞周期中G2/M期阻滯主要由抑癌蛋白p53、細胞周期蛋白cyclin B與CDK1蛋白復合體介導。本研究中，用qRT-PCR方法檢測了p53的下游CDKN1A/p21、CCNB1和CDK1 mRNA表達水平的變化。

qRT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白處理細胞12 h后，人肝癌細胞Hep-G2中CCNB1和CDK1的mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，CDKN1A的mRNA表達水平略有上調(diào)，但無顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

圖(a)中紅色虛線表示凝膠的邊界。*表示與對照組有顯著性差異(P<0.05)；**表示與對照組有極顯著性差異(P<0.01)。The red dotted line in the figure (a) indicates the boundary of the gel. *means significant difference compared with the control (P<0.05)；**means very significant difference compared with the control(P<0.01).圖4 皮氏蛾螺黏液粗蛋白對人肝癌細胞Hep-G2的G2/M期相關基因表達的影響Fig.4 Effects of crude protein from the mucus of the whelk Volutharpa ampullacea Perryi on relative expression of genes related to G2/M phase in cell cycle of human hepatoma Hep-G2 cells

2.4 注射皮氏蛾螺黏液粗蛋白對荷瘤小鼠生長的影響

從圖5可見：與模型對照組相比，皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射組小鼠無自主活動減少現(xiàn)象，一般狀況良好，飲食正常；試驗期間，每周連續(xù)5 d稱量小鼠體質(zhì)量，至試驗結(jié)束時，3組荷瘤小鼠體質(zhì)量較種瘤前分別增加了12.54%(模型對照組)、10.42%(預防組)和14.73%(治療組)，各組間體質(zhì)量變化無顯著性差異(P>0.05)。這表明，皮氏蛾螺黏液粗蛋白皮下注射對荷瘤小鼠無明顯毒副作用。

圖5 皮氏蛾螺黏液粗蛋白對荷瘤小鼠生長的影響Fig.5 Effects of crude protein from the mucus of the whelk Volutharpa ampullacea Perryi on growth in tumor-bearing mice

2.5 注射皮氏蛾螺黏液粗蛋白對荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響

從表2可見，3組荷瘤小鼠的肝臟指數(shù)無明顯差異(P>0.05)，脾臟指數(shù)雖無明顯差異(P>0.05)，但注射粗蛋白組較模型對照組略有升高，提示皮下注射皮氏蛾螺黏液粗蛋白可改善荷瘤小鼠的免疫力，對荷瘤小鼠臟器無明顯藥物毒性。

表2 皮氏蛾螺黏液粗蛋白對荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響(n=12)Tab.2 Effects of crude protein from the mucus of whelk Volutharpa ampullacea Perryi on organ indices of tumor-bearing mice(n=12)

2.6 注射皮氏蛾螺黏液粗蛋白對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

從圖6(a)可見：與模型對照組相比，皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射組小鼠腫瘤體積明顯減??；模型對照組的腫瘤形狀多為不規(guī)則圓形，而皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射組的腫瘤形狀多為不規(guī)則扁平。

標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences.圖6 皮氏蛾螺黏液粗蛋白對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響Fig.6 Effects of crude protein from the mucus of the whelk Volutharpa ampullacea Perryi on tumor growth in tumor-bearing mice

從圖6(b)可見：預防組和治療組腫瘤質(zhì)量分別為(0.69±0.18)、(0.5±0.12)g，二者均極顯著低于模型對照組(P<0.01)，模型對照組腫瘤質(zhì)量為(0.87±0.08)g。

從圖6(c)可見：與模型對照組相比，皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射組的腫瘤生長速度明顯緩慢；從種瘤后第10天開始，粗蛋白注射組的腫瘤體積與模型對照組出現(xiàn)差異；至試驗結(jié)束時，預防組和治療組腫瘤體積分別為(1 619.51±17.58)、(1 437.11±311.81)mm3，二者均顯著低于模型對照組(P<0.05)，模型對照組腫瘤體積為(2 563.55±565.46)mm3。

從圖6(d)可見：預防組和治療組最終抑瘤率分別為20.75%和42.94%。這表明，皮氏蛾螺黏液粗蛋白皮下注射可顯著抑制荷瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤生長。

2.7 注射皮氏蛾螺黏液粗蛋白對小鼠腫瘤組織病理變化的影響

小鼠養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，斷頸處死小鼠剝離瘤體，觀察發(fā)現(xiàn)，在其他組織器官未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

H.E染色結(jié)果顯示，模型對照組小鼠的腫瘤組織中細胞較為完整、分布密集，而皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射組的小鼠腫瘤組織中出現(xiàn)片狀壞死灶，腫瘤組織疏松，細胞間隙明顯變大，且伴隨不同程度的核固縮(圖7)，這進一步證實了30 mg/kg的皮氏蛾螺黏液粗蛋白皮下注射在小鼠體內(nèi)具有一定抗腫瘤作用。

A—模型對照組；B—預防組；C—治療組。黑色箭頭所示為腫瘤組織中的壞死灶。A—model control group; B—prevention group; C—therapy group. The black arrow shows the necrotic foci in the tumor tissue.圖7 荷瘤小鼠腫瘤組織的H.E染色結(jié)果Fig.7 H.E staining results of mouse tumor tissues in each group

3 討論

3.1 皮氏蛾螺黏液粗蛋白對人肝癌細胞Hep-G2形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響

海洋源生物活性物質(zhì)具有降血壓、抗炎、抗血栓和抗腫瘤等生物活性[10]，在開發(fā)與利用方面一直是海洋生物學和藥物學研究領域的熱點和焦點。比如，從海洋被囊動物Aplidiumalbicans中提取的脫氫膜海鞘素(aplidin)，可通過作用于破骨細胞前體和成熟的破骨細胞，抑制骨吸收，發(fā)揮抗骨髓瘤的生物活性作用[11]；從海洋無脊椎動物Arcasubcrenata體內(nèi)分離出的一種小分子肽H3，可顯著抑制人宮頸癌細胞HeLa、人肝癌細胞Hep-G2和人結(jié)腸癌細胞HT-29的增殖，具有抗腫瘤和抗氧化的生物活性作用[12]；從海洋海綿Ceratopsionsp.中提取的細胞毒性肽Yaku’amides A，可抑制癌細胞株JFCR39生長，現(xiàn)已進入臨床試驗階段[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，皮氏蛾螺黏液含有較為豐富的藥理學成分，其粗蛋白可顯著抑制人肝癌細胞Hep-G2的增殖[6]。本研究中，在前期研究基礎上，首先通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)0.66 g/L的皮氏蛾螺黏液粗蛋白處理后，Hep-G2細胞的形態(tài)和超顯微結(jié)構(gòu)均發(fā)生了顯著改變，這與張旭等[14]發(fā)現(xiàn)的蘇木素(hematoxylin)誘導膀胱癌細胞T24凋亡的顯微觀察結(jié)果具有一定的相似性。這表明，0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白可通過改變?nèi)烁伟┘毎鸋ep-G2的結(jié)構(gòu)，進而影響其亞細胞器發(fā)揮正常生理功能，最終導致細胞增殖受阻。

3.2 皮氏蛾螺黏液粗蛋白誘導人肝癌細胞Hep-G2阻滯于G2/M期

細胞周期阻滯(cell cycle arrest)、細胞凋亡(apoptosis)、細胞自噬(autophagy)和細胞壞死是導致細胞增殖受阻的重要原因。其中，細胞周期阻滯被認為是抑制細胞增殖的經(jīng)典因素。本研究中發(fā)現(xiàn)，0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白處理組人肝癌細胞Hep-G2中處于G2/M期的細胞比例顯著高于未經(jīng)處理的對照組，由于G2/M檢查點(checkpoints)是防止有DNA損傷的細胞進入細胞分裂期的最后關卡[15]，筆者由此推測，0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白可能通過影響G2/M期的核心蛋白或復合物而發(fā)揮抑制癌細胞增殖的作用。研究顯示，細胞周期蛋白cyclin B在細胞有絲分裂中扮演著重要角色，其缺乏可導致細胞周期G2/M期的延長[16]，細胞周期蛋白依賴性激酶CDK1在細胞周期G2/M期發(fā)揮檢查點作用，協(xié)調(diào)推動細胞周期進程[17]。此外，CDK1依賴于cyclin B而活化，并與其結(jié)合形成cyclin B/CDK1復合物，該復合物被證實是G2/M期的核心復合物，直接影響細胞周期的進程[15]。本研究中qRT-PCR結(jié)果顯示，與未經(jīng)處理的對照組相比，0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白處理組人肝癌細胞Hep-G2中的CCNB1和CDK1的mRNA表達水平均呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢，這一結(jié)果與藍萼甲素(glaucocalyxin A)通過cyclin B1/CDK1途徑誘導人前列腺癌細胞DU145阻滯于G2/M期的研究結(jié)果具有一定的相似之處[18]，同時，也進一步證實筆者的推測。此外，0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白處理組人肝癌細胞Hep-G2CDKN1A/p21的mRNA表達水平較未處理的對照組有輕微上升，因此推測，由細胞周期蛋白激酶抑制劑CDKN1A介導的CCNB1和CDK1的相對表達下調(diào)，可能是皮氏蛾螺黏液粗蛋白導致Hep-G2細胞無法完成由G2/M期向G1過渡進而阻滯于G2/M期的重要機制。當然，僅從轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果判斷皮氏蛾螺黏液粗蛋白在體外抑制人肝癌細胞Hep-G2增殖的機制仍不十分全面，在后續(xù)的研究中，應從蛋白表達水平進一步驗證皮氏蛾螺黏液粗蛋白可能通過影響G2/M期的核心蛋白或復合物而發(fā)揮抑制癌細胞增殖的作用。同時，應系統(tǒng)研究皮氏蛾螺黏液粗蛋白是通過哪些細胞信號轉(zhuǎn)導通路誘導了人肝癌細胞Hep-G2的G2/M期阻滯。

3.3 皮氏蛾螺黏液粗蛋白抑制荷瘤小鼠腫瘤生長的效果

動物試驗是研究生物活性物質(zhì)功能、藥物篩選及研發(fā)的經(jīng)典手段和常規(guī)方法。本研究中，通過建立移植瘤小鼠模型以進一步驗證皮氏蛾螺黏液粗蛋白在體內(nèi)是否具有抗腫瘤功效。研究表明，相較于雄性小鼠而言，雌性H22腹水型肝癌小鼠的生存期更長，耐受性更好[19]。因此，本研究中體內(nèi)試驗的研究對象為雌性小鼠，但皮氏蛾螺黏液粗蛋白對雄性H22荷瘤小鼠的影響仍需進一步研究。本研究結(jié)果顯示，與模型對照組相比，在連續(xù)3周(每周5次)皮下注射試驗中，皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射組(30 mg/kg)小鼠的存活率、體質(zhì)量及肝臟指數(shù)均無明顯差異，但是，脾臟指數(shù)略有升高。由于脾臟為機體重要的周圍免疫器官，因此，脾臟增大反映出免疫細胞的積累[20]。此外，通過改善癌癥患者免疫細胞的免疫抑制作用，可以達到對抗腫瘤的目的[21]，這表明免疫細胞在抵抗腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。因此，本研究中一方面證實皮氏蛾螺黏液粗蛋白對荷瘤小鼠并無顯著的副反應發(fā)生，另一方面也表明，皮氏蛾螺黏液粗蛋白可能通過改善荷瘤小鼠的免疫力發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。除此之外，與模型對照組相比，皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射組小鼠腫瘤生長速度、腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積顯著低于模型對照組，且治療組的體內(nèi)抗腫瘤生長效果優(yōu)于預防組，推測可能是由于預防組在種瘤次日開始治療，此時注射的腫瘤細胞懸液尚未完全形成腫瘤結(jié)節(jié)，因此，皮氏蛾螺黏液粗蛋白可能主要在腫瘤中晚期進程發(fā)揮抑制腫瘤生長作用，但相關調(diào)控機制仍需進一步深入研究。此外，本研究中移植瘤切片的H.E染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型對照組相比，皮氏蛾螺黏液粗蛋白注射組的小鼠瘤體中均出現(xiàn)不同程度的片狀壞死灶，這一結(jié)果與黃芪總皂苷聯(lián)合順鉑(cisplatin)抑制荷瘤小鼠生長的處理組中腫瘤組織形態(tài)改變的結(jié)果具有一定的相似之處[22]，這可能是由于腫瘤內(nèi)部供血不足造成的組織缺血，而腫瘤中的新血管生成在腫瘤生長、進展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[23]，這表明皮氏蛾螺黏液粗蛋白抗腫瘤的作用可能與抑制新血管生成相關?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，仍需進一步從分子水平探索皮氏蛾螺黏液粗蛋白抑制腫瘤生長的機制，是否與小鼠性別、免疫力改善、成瘤的不同階段及抑制新生血管形成相關，還應繼續(xù)挖掘皮氏蛾螺黏液粗蛋白抑制荷瘤小鼠腫瘤生長的不同信號通路。

綜上所述，皮氏蛾螺黏液粗蛋白在體內(nèi)和體外試驗中均可抑制肝癌細胞的增殖，這表明皮氏蛾螺足部分泌的黏液具有作為海洋源生物活性物質(zhì)資源的開發(fā)潛力，未來有望為新型海洋源天然抗肝癌藥物研發(fā)提供新的線索和參考資料。

4 結(jié)論

1)0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白可顯著改變?nèi)烁伟┘毎鸋ep-G2的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)，從而阻滯細胞周期，抑制肝癌細胞增殖。

2)初步推測體外試驗潛在分子機制是：0.66 g/L皮氏蛾螺黏液粗蛋白有可能通過抑制細胞周期相關基因CCNB1和CDK1表達，從而誘導人肝癌細胞Hep-G2阻滯于G2/M期。

3)通過皮下注射30 mg/kg皮氏蛾螺黏液粗蛋白，可顯著抑制荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的生長且無不良反應，為肝癌的防治提供了新的線索和參考資料。