牛子宮內(nèi)膜炎病原菌鑒定與藥敏試驗

文│金元山（青海省海東工業(yè)園區(qū)互助綠色產(chǎn)業(yè)園管理委員會）

牛子宮內(nèi)膜炎是子宮黏膜受到損傷引發(fā)的一種生殖障礙疾病，該病主要是繁殖母牛群易發(fā)，是引起母牛不孕不育的主要疾病之一。牛子宮內(nèi)膜炎可以分為急性和慢性，急性的誘發(fā)因素主要是在母牛產(chǎn)后病原微生物入侵，大量繁殖產(chǎn)生毒素使得子宮出現(xiàn)炎癥病變；慢性病因主要是因為急性子宮內(nèi)膜炎治療不及時或藥物使用不當(dāng)導(dǎo)致牛子宮內(nèi)還存在大量病原菌。近幾年，人們在治療子宮內(nèi)膜炎時盲目選擇藥物，導(dǎo)致抗生素的耐藥情況越發(fā)頻繁，同時，藥物殘留問題也越來越嚴(yán)重，嚴(yán)重危害人類的食品安全，而且不同地區(qū)不同環(huán)境下的子宮內(nèi)膜炎的致病菌有所不同。因此，應(yīng)對牛的致病菌進(jìn)行分離鑒定，同時選用合理的抗生素進(jìn)行治療顯得尤為重要。本研究選用某規(guī)模化牛場患有子宮內(nèi)膜炎的牛進(jìn)行病原菌分離，同時對分離的病原菌進(jìn)行藥敏試驗，旨在為養(yǎng)殖戶提供治療的參考方法，同時為臨床合理使用抗生素提供試驗參考。

一、試驗材料與方法

1.試驗材料。試驗牛選自某規(guī)?；膛龌甲訉m內(nèi)膜炎的15頭奶牛；普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、FungiMedium真菌培養(yǎng)基、MH血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購于北京陸橋；營養(yǎng)瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂購于北京奧博星；SS瓊脂購于青島海博；藥敏紙片紅霉素、克林霉素、米諾環(huán)素、諾氟沙星、頭孢吡肟、復(fù)方新諾明、克拉霉素、頭孢他啶、氨芐西林購于自杭州天和微生物試劑有限公司。

2.試驗方法。

（1）病料采集。選用臨床上已確診為患有子宮內(nèi)膜炎的奶牛，利用一次性輸精管，經(jīng)過75%酒精消毒處理后采用直腸把握法將輸精管插入患病牛子宮，然后在輸精管的另外一側(cè)接上注射器，通過注射器抽吸子宮內(nèi)膜分泌物，最后把分泌物放入無菌的5毫升離心管中，密封保存待用，整個過程要做好標(biāo)記，并保證無菌操作，避免交叉污染。

（2）病原菌分離培養(yǎng)和純化。試驗所用的培養(yǎng)基按照配置說明書事先制備好；在生物安全柜按照無菌操作要求取出100微升子宮內(nèi)膜液，置于普通營養(yǎng)培養(yǎng)基內(nèi)，用無菌棉簽涂抹均勻，靜置3分鐘后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后觀察記錄菌落形態(tài)和生長情況；之后挑取菌落形態(tài)不一致的進(jìn)行染色涂片鏡檢，根據(jù)鏡檢特征標(biāo)記菌株號，并進(jìn)行純化處理，純化后再接種于營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行染色鏡檢，并置于冰箱冷藏保存。

（3）分離的病原菌鑒定。對（2）步驟分離的純化菌種進(jìn)行革蘭氏染色，并分別接種于FungiMedium真菌培養(yǎng)基、MH血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂、SS瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，在此基礎(chǔ)上參照高玉梅等所述的方法進(jìn)行發(fā)酵型細(xì)菌、非發(fā)酵型細(xì)菌及各科細(xì)菌的分類，并按照各科、屬細(xì)菌、真菌的生化鑒定編碼冊得出鑒定結(jié)果。

（4）藥敏試驗。參照《動物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測定—紙片擴(kuò)散法》，以其為標(biāo)準(zhǔn)，選擇上述購買的藥敏片進(jìn)行藥敏試驗，試驗方法參照吳文德等所述的方法進(jìn)行。

二、結(jié)果

1.病原菌鑒定結(jié)果。對15頭患病奶牛子宮內(nèi)容物的病原菌進(jìn)行分離鑒定，共分離到35株菌株，13種病原菌，具體的菌株明細(xì)和檢出率詳見表1。從表上可以看出，葡萄球菌屬分離到的菌株數(shù)最多，共17株，占比48.6%，其中木糖葡萄球菌占比17.1%，表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌占比為14.3%，金黃色葡萄球菌為2.9%；其次是惡臭假單胞菌和黃桿菌，占比為11.4%；所有分離菌株中沒有發(fā)現(xiàn)真菌。

表1 分離菌株明細(xì)及檢出率

2.藥敏試驗結(jié)果。由表2可知，葡萄球菌屬對紅霉素、米諾環(huán)素、克林霉素、諾氟沙星、頭孢吡肟高度敏感，抑菌圈直徑＞20毫米；對復(fù)方新諾明有耐藥性，抑菌圈＜10毫米；奈瑟氏菌、非發(fā)酵菌和腸桿菌金黃奈瑟氏菌、惡臭假單胞菌、類產(chǎn)堿假單胞菌、醋酸鈣不動桿菌氏菌、卡他布蘭漢氏菌、大腸桿菌對頭孢吡肟和頭孢他啶高度敏感，抑菌圈直徑＞20毫米，對氨芐西林、氧氟沙星產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，抑菌圈＜10毫米。

表2 藥敏試驗結(jié)果 毫米

三、結(jié)論

從本研究可以發(fā)現(xiàn)，牛子宮內(nèi)膜炎是由多種病原菌引起的，屬于混合感染；通過對比發(fā)現(xiàn)，不同牛群分離的致病菌不同，如高玉梅等在南寧地區(qū)105頭患病奶牛中共分離出200個菌株，35種病原菌，本研究共分離35株菌株，13種病原菌，且分離的菌株對藥物的敏感度也不同，其原因和選取的患病牛頭數(shù)不同有關(guān)，試驗牛頭數(shù)越多病原菌數(shù)量越多，但也直接說明了不同牛場子宮內(nèi)膜炎感染的菌株不一樣，和牛場的飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生有關(guān)；至于具體哪種菌是牛子宮內(nèi)膜炎的致病菌，還有待進(jìn)一步驗證。藥敏試驗結(jié)果表明，分離到的葡萄球菌對紅霉素、克林霉素、米諾環(huán)素、諾氟沙星、頭孢吡肟高度敏感；奈瑟氏菌、非發(fā)酵菌和腸桿菌金黃奈瑟氏菌、惡臭假單胞菌、類產(chǎn)堿假單胞菌、醋酸鈣不動桿菌氏菌、卡他布蘭漢氏菌、大腸桿菌對頭孢吡肟和頭孢他啶高度敏感，通過以上分析以頭孢吡肟作為該奶牛場患病牛的治療藥物首選。

綜上所述，不同地區(qū)的牛子宮內(nèi)膜炎致病菌不同，有必要進(jìn)行致病菌分離，利用藥敏試驗選出適宜的抗生素進(jìn)行治療，這樣可防止抗生素的濫用，同時也能提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。