松材線蟲微滴式數(shù)字PCR檢測體系的建立

蘇 宇，于海英，趙冰峰，蔣 歡，唐貴婷，張 勇，吳朝君，王旭祎

(1.重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 涪陵 408000；2. 國家林業(yè)和草原局森林和草原病蟲害防治總站，沈陽 110034)

【研究意義】松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)是引起松樹萎蔫病(PWD)的病原線蟲。截至2020 年底，全國共有18個省(區(qū)、市)726個縣級行政區(qū)被列為松材線蟲病疫區(qū)，僅2020年就新增60個縣級疫情發(fā)生區(qū)和1181個鄉(xiāng)(鎮(zhèn))級疫情發(fā)生區(qū)。為防止該病進(jìn)一步蔓延，國家林業(yè)局印發(fā)的《松材線蟲病疫區(qū)和疫木管理辦法》中督促強化檢疫執(zhí)法，要求建立檢疫追溯體系，嚴(yán)防疫情傳出疫區(qū)。因此，林業(yè)植物檢疫部門急需一個高效、準(zhǔn)確、高通量的松材線蟲檢測系統(tǒng)，應(yīng)用于松材線蟲檢疫?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，松材線蟲的檢測方法主要有形態(tài)學(xué)檢測法[1-2]、生物化學(xué)檢測法[3]和分子生物學(xué)檢測法[4-16]。其中SCAR、RT-qPCR、LAMP等分子生物學(xué)檢測方法因具有快速、準(zhǔn)確、操作簡便的優(yōu)勢，已成為松材線蟲的主要檢測手段。數(shù)字PCR作為一種新型的核酸定量檢測技術(shù)，以其特有的優(yōu)勢越來越受到關(guān)注，但目前尚無數(shù)字PCR用于松材線蟲檢測的相關(guān)報道。數(shù)字PCR的原理最先由Sykes等[17]和Vogelstein等[18]提出，該技術(shù)不需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實現(xiàn)絕對定量。美國Bio-Rad公司將該技術(shù)發(fā)展為微滴式數(shù)字PCR并將其應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、病毒檢測和轉(zhuǎn)基因檢測等多個研究領(lǐng)域[19-22]。該技術(shù)在檢測精密度和重復(fù)性方面具有明顯的優(yōu)勢，特別適合復(fù)雜基質(zhì)樣品中核酸分析和濃度差異微小的樣品分析?！颈狙芯壳腥朦c】本研究擬將微滴式數(shù)字PCR檢測體系應(yīng)用于松材線蟲檢測，以期豐富現(xiàn)有的松材線蟲檢測技術(shù)，為松材線蟲的分子檢測提供一個更高效、精確的技術(shù)手段。同時，對不同發(fā)病時期松樹的線蟲量、同一株樹不同部位的線蟲量可以做到定量檢測，為研究松材線蟲的發(fā)生及傳播規(guī)律提供可靠的試驗數(shù)據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】設(shè)計松材線蟲特異性引物探針序列，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，明確數(shù)字PCR檢測體系的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試線蟲及松木樣品 本試驗選取18株采自不同地區(qū)的松材線蟲及其相近種線蟲蟲株，其中松材線蟲6株，擬松材線蟲3株，泰國傘滑刃線蟲3株，十二齒小蠹傘滑刃線蟲1株，大連傘滑刃線蟲1株，異腐生滑刃線蟲1株，紅松滑刃線蟲2株，松柱形墊刃線蟲1株(表1)。感病松木樣品和健康松木樣品采自重慶市涪陵區(qū)龍橋街道湯家院村林場。

表1 供試線蟲基本信息

1.1.2 主要試劑及儀器 基因組DNA提取試劑盒購自愛思進(jìn)(Axygen)有限公司；生化試劑購自索萊寶(北京)有限公司；數(shù)字PCR反應(yīng)試劑2×SuperMix、微滴生成油、微滴發(fā)生卡、PCR反應(yīng)板等數(shù)字PCR相關(guān)耗材試劑及QX200型微滴式數(shù)字PCR儀、PCR儀C1000 Thermal Cycler等均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試線蟲及松木樣品DNA提取 人工飼養(yǎng)的線蟲使用無菌水在平板上洗脫，將洗脫的線蟲懸液加入到1.5 mL離心管3000 r/min離心10 min，棄上清，收集管底線蟲。將收集到的線蟲放入液氮速凍1 min后沸水浴5 min。加入350 μL PBS緩沖液，使用基因組DNA提取試劑盒按照說明書操作步驟提取基因組DNA。

林間取回的松木樣品，參照茍大平等[23]所采用的Chelex-100 DNA提取方法，并略作改動。將當(dāng)年死亡的馬尾松伐倒，在樹干中部截取厚5 cm左右的圓盤，帶回實驗室。使用電鉆鉆取樹皮以內(nèi)、芯材以外部位，收集木屑。稱取50 mg松木屑樣品，放入2 mL離心管中，加入異硫氰酸胍提取緩沖液[3 mol/L CH5N3HSCN5，50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA(pH 8.0)，1%TritonX-100]400 μL，攪拌均勻，冰上放置5 min，沸水浴5 min，然后加入5%(W/V)Chelex-100 200 μL，攪拌均勻，沸水浴8 min，吸取上清液用于數(shù)字PCR檢測。

1.2.2 引物及探針設(shè)計 利用南京金斯瑞生物科技有限公司的在線引物設(shè)計工具(https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool)在松材線蟲16S rDNA序列上設(shè)計一組特異性引物和探針。

1.2.3 松材線蟲微滴式數(shù)字PCR檢測體系建立及評價 Bio-Rad微滴式數(shù)字PCR檢測平臺反應(yīng)總體積為20 μL，包括：2×SuperMix 10 μL，上游引物0.9 μL(10 μmol/L)，下游引物0.9 μL(10 μmol/L)，探針0.2 μL(10 μmol/L)，樣品DNA 5 μL，去離子水3 μL。將PCR反應(yīng)退火溫度設(shè)置為8個溫度梯度(49.9～65.0 ℃)，篩選最佳退火溫度，優(yōu)化數(shù)字PCR反應(yīng)體系。

以松材線蟲基因組DNA為模板，利用設(shè)計的特異引物和探針進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)。具體操作步驟：將配制好的20 μL反應(yīng)液加入到微滴發(fā)生卡的Sample孔位中，在微滴發(fā)生卡的oil孔位內(nèi)加入70 μL微滴生成油，將微滴發(fā)生卡放入到微滴生成儀中生成微滴。微滴生成后，將生成的微滴移至96孔板中，封膜后進(jìn)行PCR擴增。擴增反應(yīng)完成后，將96孔板放入微滴讀取儀中進(jìn)行微滴讀取和數(shù)據(jù)采集，通過軟件生成的散點圖判定反應(yīng)最佳退火溫度。

1.2.4 檢測體系的特異性檢測 以1.2.1所述的18株供試線蟲的基因組DNA為模板，以優(yōu)化得到的數(shù)字PCR反應(yīng)體系及程序進(jìn)行PCR檢測，根據(jù)試驗結(jié)果判定所建立的數(shù)字PCR體系的特異性。

1.2.5 檢測體系的靈敏度檢測 以松材線蟲基因組DNA的10倍稀釋液為模板，設(shè)8個濃度梯度(Sample 1～Sample 8)，以優(yōu)化好的反應(yīng)體系及程序進(jìn)行數(shù)字PCR檢測，根據(jù)試驗結(jié)果判斷數(shù)字PCR的最低檢出下限。

1.2.6 檢測體系的重復(fù)性檢測 以3個不同濃度的松材線蟲基因組DNA為模板，按照上述優(yōu)化好的反應(yīng)體系及程序進(jìn)行數(shù)字PCR檢測。每個樣品重復(fù)3次，根據(jù)試驗結(jié)果計算每個樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差(Standard deviation，SD)和變異系數(shù)(Coefficient of variation，CV)。根據(jù)變異系數(shù)判斷數(shù)字PCR檢測體系的重復(fù)性。

1.2.7 松木樣品檢測 取健康松木樣品，每個取樣50 mg，分別在其中加入1條、2條、4條、8條、16條松材線蟲，共5個濃度梯度，制成模擬帶蟲樣品。提取樣品中的基因組DNA作為檢測模板。

林間采集的枯死松樹木樣品16份，每份取樣50 mg。提取總DNA為模板，按照優(yōu)化后的數(shù)字PCR反應(yīng)體系對上述樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 松材線蟲特異性引物探針設(shè)計

根據(jù)松材線蟲16S rDNA序列設(shè)計了一組松材線蟲特異性引物探針。P1904-F：CTACGTGCTGTTGTTGAG；P2057-R：TCCACCGGAGTAACTTAA；Prob e-1938：5′-FAM-CCGACAGATGAGA CCAGCCA-BHQ-3′。

2.2 數(shù)字PCR檢測體系評價

松材線蟲數(shù)字PCR反應(yīng)最佳退火溫度優(yōu)化結(jié)果見圖1，數(shù)字PCR反應(yīng)最佳退火溫度為55.0 ℃。從圖2-A中可以看出，微滴可明顯地分成兩個部分，一部分的熒光值在4000～6000，另一部分的熒光值在0～500；從圖2-B可以看出，陰性微滴的峰和陽性微滴的峰顯著分開，中間沒有干擾峰存在，說明本研究所建立的松材線蟲微滴式數(shù)字PCR檢測體系適用于松材線蟲的檢測。

圖1 數(shù)字PCR反應(yīng)最適退火溫度篩選Fig.1 Fluorescence amplitude plotted against annealing temperature gradient

圖2 松材線蟲數(shù)字PCR一維散點圖(A)和二維直方圖(B)Fig.2 Representative 1-D plot(A) and 2-D plot(B) of dd-PCR reactions

2.3 松材線蟲微滴式數(shù)字PCR的特異性檢測結(jié)果

如圖3所示,松材線蟲樣品檢測結(jié)果均為陽性，而其他種線蟲的樣品檢測結(jié)果都為陰性。本研究所建立的松材線蟲檢測體系可以特異地檢出松材線蟲，而對其他種屬的線蟲無擴增，滿足特異性檢出松材線蟲的需要。

C01.BX-01；C02.BX-02；C03.BX-03；C04.BX-04；C05.BX-05；C06.BX-06; E01.BM-01；E02.BM-02；E03.BM-03；F01.BT-01；F02.BT-02；F03.BT-03；G01.BS-01；G02.AD-01；G03.AS-01；H01.AR-01；H02.AR-02；H03.CP-01圖3 數(shù)字PCR檢測體系的特異性檢測Fig.3 Specificity test of dd-PCR detection system

2.4 數(shù)字PCR檢測體系的靈敏度檢測結(jié)果

松材線蟲數(shù)字PCR靈敏度檢測結(jié)果如圖4所示，可以看出數(shù)字PCR對松材線蟲基因組DNA的檢出下限為0.51 copies/μL。根據(jù)上述數(shù)值，折算成每20 μL反應(yīng)10.07個拷貝。

圖4 數(shù)字PCR檢測體系的靈敏度檢測Fig.4 Sensitivity detection of dd-PCR detection system

2.5 數(shù)字PCR檢測體系的可重復(fù)性檢測

數(shù)字PCR檢測體系的可重復(fù)性檢測結(jié)果見表2,樣品濃度越高，變異系數(shù)越低，但3個樣品的變異系數(shù)(CV)均小于10%，說明數(shù)字PCR具有極高的可重復(fù)性。

表2 數(shù)字PCR檢測體系的可重復(fù)性檢測

2.6 微滴式數(shù)字PCR檢測模擬帶線蟲松木樣品

利用建立的松材線蟲微滴式數(shù)字PCR檢測體系檢測了5份模擬加入線蟲的健康松木樣品，結(jié)果如圖5所示。模擬帶線蟲的樣品檢測結(jié)果均為陽性，并且隨著加入線蟲數(shù)量增多呈現(xiàn)遞增趨勢；陰性對照樣品和空白對照樣品均顯示為陰性。以上結(jié)果表明本研究所建立的松材線蟲檢測體系可以用于松木樣品中松材線蟲的檢測。

E01.1條線蟲；D01.2條線蟲；C01.4條線蟲；B01.8條線蟲；A01.16條線蟲；H04.陰性對照；F04.空白對照E01.1 nematode；D01.2 nematodes；C01.4 nematodes；B01.8 nematodes；A01.16 nematodes；H04.Negative control；F04.No template control圖5 模擬帶線蟲樣品的數(shù)字PCR檢測Fig.5 Detection of simulated samples with nematode by digital PCR

2.7 微滴式數(shù)字PCR檢測林間病木樣品

為了進(jìn)一步驗證本研究所建立的松材線蟲檢測體系的有效性，對林間采回的16份枯死松樹樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖6所示。3號樣品、9號樣品、陰性對照和空白對照的檢測結(jié)果呈陰性，其余樣品均呈陽性。

A02.1號樣品；B02.2號樣品；C02.3號樣品；D02.4號樣品；E02.5號樣品；F02.6號樣品；G02.7號樣品；F02.8號樣品；A03.9號樣品；B03.10號樣品；C03.11號樣品；D03.12號樣品；E03.13號樣品；F03.14號樣品；G03.15號樣品；H03.16號樣品；H04.陰性對照樣品；F04.空白樣品A02.Sample No.1；B02.Sample No.2；C02.Sample No.3；D02.Sample No.4；E02.Sample No.5；F02.Sample No.6；G02.Sample No.7；F02.Sample No.8；A03.Sample No.9；B03.Sample No.10；C03.Sample No.11；D03.Sample No.12；E03.Sample No.13；F03.Sample No.14；G03.Sample No.15；H03.Sample No.16；H04.Negative control；F04.No template control圖6 林間枯死松樹樣品檢測Fig.6 Dd-PCR amplification of PWN nematodes from wood samples

3 討 論

微滴式數(shù)字PCR是數(shù)字PCR的一種，與傳統(tǒng)PCR和實時熒光定量PCR不同。微滴式數(shù)字PCR在擴增前對反應(yīng)管中的樣品進(jìn)行微滴化處理，將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成數(shù)萬個納升級的油包水微滴。每個微滴作為一個獨立的PCR反應(yīng)器，微滴在PCR管內(nèi)經(jīng)擴增儀擴增后，利用微滴檢測儀對每個微滴進(jìn)行檢測，最后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)，計算出靶分子的絕對起始拷貝數(shù)及濃度，從而實現(xiàn)樣品中核酸的精確定量。自該核酸定量系統(tǒng)推出以來，已廣泛應(yīng)用于多個生物學(xué)研究領(lǐng)域，包括基因表達(dá)、表觀遺傳學(xué)及基因組學(xué)研究，動物疫病檢查，水體生態(tài)研究和轉(zhuǎn)基因成分檢測分析等。目前，應(yīng)用微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)對農(nóng)林業(yè)有害生物的檢測研究還較少。Zhao等[24]、Zhong等[25]和田茜等[26]分別建立了柑橘潰瘍病、柑橘黃龍病、水稻細(xì)菌性條斑病和水稻白葉枯病的微滴式數(shù)字PCR檢測體系，均取得了良好的檢測效果。

本研究通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了松材線蟲微滴式數(shù)字PCR檢測體系，通過檢測松材線蟲和其他線蟲樣品確定了該檢測體系的特異性。在對該體系靈敏度檢測時我們發(fā)現(xiàn)，在0.5個拷貝/μL濃度下，數(shù)字PCR顯示為陽性，而在同一樣品濃度下RT-qPCR的檢測數(shù)值為36.5。在使用RT-qPCR檢測松材線蟲時，Ct值大于35即判定為陰性。由此可見，利用該體系檢測松材線蟲，可降低假陰性產(chǎn)生的幾率。該檢測體系在對低濃度樣品定量時，能夠直觀地顯示樣品中的靶標(biāo)分子拷貝數(shù)，因此該方法能夠?qū)悠分械陌谢蜻M(jìn)行精確定量。本研究進(jìn)行的可重復(fù)性試驗發(fā)現(xiàn)，3個樣品中變異系數(shù)(CV)最高僅為9.12%，證明該體系除了能夠精確測定出樣品中靶基因的濃度外，還具有較高的重復(fù)性。再使用數(shù)字PCR對模擬加入線蟲的松木樣品和林間采回的枯死松木樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果可精確地反映樣品中待測靶標(biāo)的濃度。以上試驗結(jié)果證明，該方法可用于對松材線蟲的特異性檢測。由于數(shù)字PCR具有可精確定量特性，本研究所建立的松材線蟲檢測體系亦可用于研究松材線蟲在自然界中的分布、擴散規(guī)律、生活習(xí)性及其與傳播媒介昆蟲的互作。在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)體系中靶標(biāo)基因濃度大于20 000個拷貝/μL時，數(shù)字PCR即達(dá)到飽和，因而在對高濃度樣品進(jìn)行定量檢測時，樣品稀釋是十分必要的。

4 結(jié) 論

本研究所建立的松材線蟲微滴式數(shù)字PCR檢測體系，具有特異性高、精確度高、可重復(fù)性好、能夠進(jìn)行精確定量等優(yōu)點，尤其是在檢測低濃度樣品時，能夠有效降低假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。松材線蟲目前是我國乃至全世界對松林危害最嚴(yán)重的病原物，本檢測體系的建立為提高松材線蟲控制水平、防止病害傳播擴散、保護我國林業(yè)資源提供了一個新的可靠技術(shù)手段。