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    光能變價離子鈦對3種馬鈴薯致病菌的抑制作用

    2022-09-30 07:13:42肖秋菊肖星月童麗穎邵歡歡
    西南農(nóng)業(yè)學報 2022年7期
    關(guān)鍵詞:茄科疫霉瘡痂

    肖秋菊,唐 雪,譚 曉,肖星月,童麗穎,邵歡歡,陶 向,雍 彬

    (四川師范大學生命科學學院,成都 610101)

    【研究意義】馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界第四大作物,其種植面積和產(chǎn)量僅次于水稻、小麥和玉米,全球消費量僅次于水稻和小麥。作為世界上馬鈴薯種植面積最大國家之一[1-2],中國近年已將馬鈴薯列為主糧,該作物的安全生產(chǎn)事關(guān)國家糧食安全。馬鈴薯生產(chǎn)實踐中多采用塊莖營養(yǎng)繁殖,但營養(yǎng)繁殖會造成致病菌代代相傳并不斷積累,目前已報道的馬鈴薯病害有100多種,每年因病害減產(chǎn)10%~30%,嚴重時減產(chǎn)超過70%。由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引發(fā)的晚疫病是一種全世界范圍內(nèi)絕大多數(shù)馬鈴薯種植區(qū)均有發(fā)生的最具毀滅性的病害,曾造成1845—1950年間的愛爾蘭大饑荒[3-5],瘡痂鏈霉菌(Streptomycesscabiei)、茄科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)等也會對馬鈴薯安全生產(chǎn)造成嚴重威脅,茄科雷爾氏菌造成的青枯病是馬鈴薯生產(chǎn)中的第二大病害[6-7]。馬鈴薯瘡痂病是一種世界性土傳病害,可由S.scabies、S.acidiscabies、S.turgidiscabies、S.galilacus等多種鏈霉菌引發(fā)[8-9]。這3種病害均對馬鈴薯安全生產(chǎn)造成嚴重威脅,有效防控病害是保障馬鈴薯產(chǎn)量及質(zhì)量的重要途徑。長期以來馬鈴薯病害防控主要依靠噴施農(nóng)藥,加上我國農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)落后,農(nóng)民安全用藥意識薄弱,大量使用化學農(nóng)藥與化學肥料,造成嚴重的農(nóng)殘超標、土壤殘留、病原菌抗藥性增強和生態(tài)環(huán)境破壞等問題,環(huán)境友好型抑菌農(nóng)藥的研制極為迫切。為此,我國在農(nóng)業(yè)“十三五”規(guī)劃中明確提出化學肥料和農(nóng)藥“雙減”目標,推動農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和食品安全生產(chǎn)。靶向馬鈴薯病害的化學農(nóng)藥替代品的研發(fā)與應用可為保障我國農(nóng)業(yè)綠色生產(chǎn)及實現(xiàn)國家“雙減”目標提供產(chǎn)品和技術(shù)支撐?!厩叭搜芯窟M展】鈦(Titanium,Ti)是一種過渡金屬元素,在地殼中的含量超過0.6%,在生物體、水體中亦廣泛存在[10]。鈦具有“親生物”特性,對人體無害,是WHO唯一允許植入人體的金屬。已有研究證明,鈦能刺激人體內(nèi)吞噬細胞提升機體免疫力,并具有一定抑菌能力[11-12]。近年來,已將鈦應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,并證明鈦能提高植物體內(nèi)多種酶的活性[13-14],促進植物對養(yǎng)分的吸收和利用[15]。焦湞等[16]在煙草種子中注入低劑量的鈦離子,發(fā)現(xiàn)種子的發(fā)芽率以及葉片中的鉀含量均有提升。鈦除了對農(nóng)作物的產(chǎn)量品質(zhì)、生長發(fā)育產(chǎn)生積極的影響之外,在病蟲害防治方面也發(fā)揮著重要作用。鈦可有效抑制黃瓜霜霉病菌、白粉病菌、番茄和玫瑰的細菌性葉斑病菌的生長[17-19]。然而,自然界中的鈦元素常以氧化物、硅酸鹽結(jié)合態(tài)或鈦鐵礦等形式存在,難以為植物利用[20]。而離子狀態(tài)的鈦通常是鈦與鹵素生成的易揮發(fā)高價鈦鹵化物,且存在不穩(wěn)定、遇水易發(fā)生反應等問題。光能變價離子鈦(Titanium ion of variable valence with light energy,TIVL)中的鈦是一種穩(wěn)定的新型鈦離子制劑[專利:US8308840B2;20151077 3354.4],其中的鈦元素以離子(Ti4+與Ti3+)形式存在,于環(huán)境友好。已有田間試驗顯示低濃度的TIVL可以提高光合作用效率、提高作物產(chǎn)量與品質(zhì),使大豆籽粒中的蛋白質(zhì)含量和產(chǎn)量分別增加1.61%和16.34%[21],顯著提升煙葉的香氣、口感等[22];低濃度的TIVL還可防止低溫冷害顯著提高牧草、煙草等植物種子的發(fā)芽率、促進植株根系生長[23];另外TIVL能降低作物發(fā)病率與發(fā)病癥狀,李洪浩等[24]通過田間試驗發(fā)現(xiàn)使用TIVL(675 mL/hm2)對馬鈴薯晚疫病的防效可達40%以上。據(jù)此推測TIVL具有抑制馬鈴薯致病菌生長的功能?!颈狙芯壳腥朦c】擬于培養(yǎng)基中加入不同濃度的TIVL培養(yǎng)致病疫霉、茄科雷爾氏菌和瘡痂病鏈霉菌3種馬鈴薯致病菌,分析TIVL對3種致病菌的影響?!緮M解決的關(guān)鍵問題】明確TIVL是否具有抑制馬鈴薯病原菌生長的作用,尋找適宜的TIVL抑菌濃度,為TIVL應用于馬鈴薯病害防控領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    光能變價離子鈦(TIVL)采購于鈦谷(天津)科技有限公司,該制劑未添加其他金屬元素,鈦離子濃度為4 mg/mL。致病疫霉菌(P.infestans)由四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供,瘡痂鏈霉菌(CGMCC 4.1765)、茄科雷爾氏菌(CGMCC 1.2839)于中國普通微生物保藏管理中心購買。

    1.2 培養(yǎng)基制備

    1.2.1 瘡痂鏈霉菌培養(yǎng)基(SP-2培養(yǎng)基) 稱取酵母提取物4.0 g,麥芽提取物10.0 g,葡萄糖4.0 g,以蒸餾水定容1.0 L并調(diào)節(jié)pH至7.3(固體培養(yǎng)基加瓊脂粉15.0 g),115 ℃高壓滅菌35 min。

    1.2.2 茄科雷爾氏菌培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基) 稱取蛋白胨10.0 g,牛肉浸取物3.0 g,NaCl 5.0 g,以蒸餾水定容1.0 L并調(diào)節(jié)pH至7.0(固體培養(yǎng)基加瓊脂粉15.0 g),121 ℃高壓滅菌20 min。

    1.2.3 致病疫霉菌培養(yǎng)基(黑麥培養(yǎng)基) 稱取黑麥10 g加入100 mL水中,121 ℃高壓滅菌40 min,4層紗布過濾去除殘渣,于上清液中加入2 g蔗糖和1.5 g瓊脂粉定容至100 mL,121 ℃再次高壓滅菌20 min。

    1.3 供試菌種活化

    將4 ℃冰箱保存的瘡痂鏈霉菌和茄科雷爾氏菌分別劃線接種至固體SP-2和營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基,置于28和30 ℃培養(yǎng),待長出單菌落后備用。從4 ℃冰箱保存的致病疫霉菌黑麥平板切取直徑5 mm的菌餅接種到黑麥培養(yǎng)基中央,18 ℃黑暗培養(yǎng)5~7 d。

    1.4 菌液濃度選擇

    挑取瘡痂鏈霉菌和茄科雷爾氏菌單菌落于1 mL無菌水中,以移液器吹打使之分散均勻,記為103倍稀釋菌液;依次吸取100 μL菌液加入900 μL無菌水中,吹打均勻,梯度稀釋至1010倍。分別取每個稀釋梯度下的菌液100 μL均勻涂布于固體SP-2或營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基,置于28和30 ℃培養(yǎng)至長出單菌落,選擇可清晰統(tǒng)計單菌落數(shù)量的梯度稀釋菌液作為最適稀釋濃度用于后續(xù)試驗。

    1.5 平板抑菌實驗

    固體培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后冷卻至50 ℃左右,分別添加濃度為4 mg/mL的TIVL母液,使TIVL濃度為0、4、8、16 mg/L,輕輕搖勻后倒平板。

    挑取瘡痂鏈霉菌單菌落于1 mL無菌水中,經(jīng)梯度稀釋并涂布于SP-2培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)1010倍稀釋菌液培養(yǎng)60 h后可清晰統(tǒng)計單菌落數(shù)量,因此選擇1010倍稀釋菌液用于后續(xù)實驗。

    挑取茄科雷爾氏菌單菌落于1 mL無菌水中,經(jīng)梯度稀釋并涂布于營養(yǎng)肉汁平板培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)茄科雷爾氏菌單菌落稀釋1010倍后,涂布于營養(yǎng)肉汁平板培養(yǎng)3~4 d能清晰統(tǒng)計單菌落數(shù)量,因此選擇1010倍稀釋菌液用于后續(xù)實驗。分別取最適稀釋濃度的瘡痂鏈霉菌和茄科雷爾氏菌各100 μL均勻涂布于含不同濃度TIVL的固體培養(yǎng)基上,置于相應溫度條件下培養(yǎng)(瘡痂鏈霉菌28 ℃培養(yǎng)60 h,培茄科雷爾氏菌30 ℃培養(yǎng)108 h),于不同時間拍照記錄菌落生長情況。

    從4 ℃冰箱保存的致病疫霉菌黑麥平板切取直徑5 mm的菌餅,接種到含有不同濃度TIVL的黑麥平板中央,18 ℃黑暗培養(yǎng)5~7 d,拍照記錄致病疫霉菌圈生長情況。以田間生產(chǎn)中常用的馬鈴薯晚疫病防治農(nóng)藥福帥得(氟啶胺500 g/L,日本石原產(chǎn)業(yè)株式會社)對致病疫霉的抑制效果作為對照,分析TIVL的抑菌效果:黑麥培養(yǎng)基中加入稀釋1000倍(0.5 g/L氟啶胺)和500倍(1.0 g/L氟啶胺)的福帥得,并切取5 mm直徑的菌餅置于平板中央,18 ℃黑暗培養(yǎng)7 d,拍照記錄致病疫霉菌圈生長情況。

    1.6 透射電子顯微鏡樣品制備與觀察

    將含有8 mg/L TIVL的致病疫霉固體培養(yǎng)基上生長的致病疫霉的菌絲輕輕刮下,置于1.5 mL尖底EP管內(nèi)。菌絲體積不小于米粒大小,沿管壁加入由Sorensen緩沖液配置的5%的戊二醛固定液,不沖散菌絲,于4 ℃冰箱內(nèi)固定過夜,0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗3次,置入1%鋨酸后固定1.5 h,磷酸緩沖液漂洗3次,經(jīng)50%、70%、80%、90%乙醇逐級脫水(每次15 min),90%丙酮脫水15 min,再經(jīng)100%丙酮脫水3次(每次15 min),Embed 812樹脂滲透并包埋,60 ℃高溫聚合24 h后修塊,采用超薄切片機(徠卡UC7)切片,經(jīng)2%醋酸雙氧鈾染色液——檸檬酸鉛染色液雙重染色法染色(各25 min,每種染色劑染色后均用蒸餾水漂洗數(shù)次),晾干,置于Tecnai G2 F20 S-TWIN透射電鏡觀察。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 TIVL對致病疫霉菌的抑制作用

    切取致病疫霉菌餅接種至含有不同濃度TIVL的黑麥培養(yǎng)基上,培養(yǎng)第5天時,0 mg/L TIVL平板上致病疫霉已有較好的長勢,而4和8 mg/L TIVL的平板上致病疫霉菌才開始生長,且長勢較弱,16 mg/L TIVL平板上未見病菌生長跡象(圖1)。經(jīng)測量,培養(yǎng)5 d時0、4、8 mg/L TIVL黑麥平板上菌圈直徑分別為(3.77±0.06)、(3.67±0.12)和(3.13±0.15)cm;培養(yǎng)6 d時菌圈直徑分別為(4.83±0.15)、(4.60±0.10)和(4.03±0.15)cm;培養(yǎng)第7天時菌圈直徑達到(6.40±0.10)、(6.17±0.06)和(5.20±0.36)cm(表1)。16 mg/L TIVL黑麥平板直至第7天時仍未見菌圈。添加了福帥得的黑麥培養(yǎng)基培養(yǎng)第7天時同樣未見明顯的致病疫霉菌圈形成。表明TIVL可顯著抑制致病疫霉的生長,當TIVL濃度達到16 mg/L時,抑菌效果與福帥得相當。

    圖1 不同濃度TIVL與Fluazinam對致病疫霉生長的影響Fig.1 Effect of different TIVL and fluazinam concentrations on the growth of Phytophthora infestans

    表1 不同濃度TIVL對3種病原菌的菌落數(shù)和菌圈直徑的影響

    2.2 TIVL對瘡痂鏈霉菌的抑制作用

    將瘡痂鏈霉菌涂布在含有不同TIVL濃度的平板上,其生長狀況如圖2所示,培養(yǎng)36 h時,含0和4 mg/L TIVL的培養(yǎng)基上瘡痂鏈霉菌生長趨勢差別較小,分別含有(217±23)、(221±24)個菌落;含8 mg/L TIVL的培養(yǎng)基上菌落則明顯少于0和4 mg/L的TIVL平板,只有(165±17)個單菌落;而含16 mg/L TIVL的培養(yǎng)基上則未見單菌落長出(表1)。培養(yǎng)48 h時,0和4 mg/L TIVL平板上部分單菌落已出現(xiàn)“融合”現(xiàn)象,而8 mg/L的平板上仍可清晰分辨單菌落,菌落數(shù)分別為(375±31)、(227±15)和(174±19)個(表1)。培養(yǎng)60 h時,8 mg/L的平板上亦出現(xiàn)單菌落的融合,而16 mg/L TIVL平板上仍未見單菌落長出,表明TIVL可顯著抑制瘡痂鏈霉菌的生長。

    圖2 不同濃度TIVL對瘡痂鏈霉菌生長的影響Fig.2 Effect of different TIVL concentrations on the growth of Streptomyces scabiei

    2.3 TIVL對茄科雷爾氏菌的抑制作用

    將茄科雷爾氏菌涂布于含有不同TIVL濃度的平板上觀察菌落生長情況(圖3)。培養(yǎng)36 h時,0 mg/L的TIVL平板上有菌落(690±40)個,4和8 mg/L TIVL濃度下均未見明顯菌落;培養(yǎng)60 h時,0 mg/L的TIVL平板上長出(678±26)個單菌落,4 mg/L TIVL濃度下有菌落(323±31)個,而8 mg/L TIVL平板上單菌落數(shù)仍為0個;84 h時,8 mg/L濃度下亦可見菌落長出,數(shù)量為(76±7)個,但明顯少于0 mg/L[(704±21)個]和4 mg/L[(329±9)個];108 h時,3種TIVL濃度下的菌落數(shù)分別為(554±38)、(359±15)、(204±6)個。表明TIVL可顯著抑制茄科雷爾氏菌的生長。

    圖3 不同濃度TIVL對茄科雷爾氏菌生長的影響Fig.3 Effect of different TIVL concentrations on the growth of Ralstonia solanacearum

    2.4 TIVL對致病疫霉影響的顯微特征觀察

    以透射電鏡觀察含8 mg/L TIVL的培養(yǎng)基培養(yǎng)致病疫霉菌,在2000倍放大倍數(shù)下可見加入8 mg/L TIVL黑麥平板培養(yǎng)的致病疫霉菌體的形態(tài)、大小均發(fā)生改變,多數(shù)菌體變得不規(guī)則(圖4-A,4-D);放大至25 000倍時,可觀察到菌絲的細胞質(zhì)發(fā)生收縮,液泡變大(圖4-B,4-E);在50 000倍放大倍數(shù)下,可見致病疫霉細胞質(zhì)和周質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)較多黑點(圖4-C,4-F)。上述結(jié)果表明TIVL的抑菌作用可能因為鈦離子進入細胞內(nèi)并破壞細胞結(jié)構(gòu)。

    A、D.放大2000倍;B、E.放大25 000倍;C、F.放大50 000倍A, D.2000 times magnification; B, E.25 000 times magnification; C, F.50 000 times magnification圖4 TIVL對致病疫霉細胞結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of TIVL on the cellular structure of Phytophthora infestans

    3 討 論

    作為WHO唯一允許植入人體的金屬,鈦在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有較好的應用前景。近年來,已有研究證明鈦不僅具有一定的促生作用[13-15],在作物病害防控方面也能發(fā)揮作用[17-19]。本研究所用的TIVL中鈦以離子形式存在,相比自然存在的氧化物、硅酸鹽結(jié)合態(tài)或鈦鐵礦形式,易于被植物吸收利用。已有的研究表明TIVL同樣具有較好的促生和抑菌作用[21-24],但目前尚未見TIVL抑制馬鈴薯致病菌生長的報道。本研究以含有4、8、16 mg/L的TIVL的培養(yǎng)基培養(yǎng)致病疫霉、瘡痂鏈霉菌、茄科雷爾氏菌3種馬鈴薯病原菌,發(fā)現(xiàn)16 mg/L的TIVL完全抑制3種病原菌的生長。其中16 mg/L TIVL對致病疫霉的抑菌效果與馬鈴薯大田生產(chǎn)中常用的農(nóng)藥福帥得(有效成分氟啶胺)的抑菌效果相當:固體培養(yǎng)基培養(yǎng)5~7 d,無菌圈長出。針對馬鈴薯瘡痂病和青枯病病原菌,含16 mg/L TIVL的固體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)60和108 h,均未見單菌落。范延芬等[25]曾以不同濃度TIVL的固體營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基培養(yǎng)茄科雷爾氏菌,同樣發(fā)現(xiàn)16 mg/L TIVL對茄科雷爾氏菌有顯著的抑菌作用。但范延芬等所用茄科雷爾氏菌分離自黃瓜青枯病株,該菌株能否引發(fā)馬鈴薯青枯病尚不得而知。因此,本研究選用能引發(fā)馬鈴薯青枯病的茄科雷爾氏菌為材料,通過抑菌實驗證明TIVL濃度越大對馬鈴薯青枯病病原菌的生長的抑制效果越明顯,濃度達到16 mg/L時完全抑制病菌的生長,說明TIVL能有效抑制馬鈴薯病原菌,具有作為農(nóng)用殺菌劑在田間生產(chǎn)中推廣應用的前景。

    抑菌劑通常是通過破壞細胞壁、細胞膜等細胞結(jié)構(gòu)或干擾新陳代謝而達到抑菌效果。TIVL作為一種新型農(nóng)用制劑,其抑菌機理鮮見報道。但TiO2抑菌相關(guān)研究已取得一定進展:TiO2具有光催化活性,可催化產(chǎn)生O2-及·OH等活性自由基,在溶液中O2-可與2分子·OH產(chǎn)生的H2O2反應,生成·OH、OH-與O2,而·OH 與O2可將有機質(zhì)氧化成CO2與H2O,這種氧化能力可破壞微生物細胞膜導致細胞破裂,從而達到抑菌效果[26-28]。TIVL中的鈦以Ti4+與Ti3+形式存在,接收光能后鈦可在三價和四價之間發(fā)生價位跳躍,產(chǎn)生活性自由基,形成強氧化能力。因此推測TIVL對致病疫霉、茄科雷爾氏菌和瘡痂鏈霉菌的抑菌作用機理可能與TiO2相似。楊薇薇等[29]在假單胞菌中添加鈦離子后通過透射電子顯微鏡圖可觀察到細胞質(zhì)和周質(zhì)內(nèi)均有黑點產(chǎn)生,通過EDS對納米粒子分析證明黑點為鈦粒子。在本研究中以含有TIVL的培養(yǎng)基培養(yǎng)的致病疫霉胞內(nèi)亦有黑點出現(xiàn),表明鈦離子已進入到致病疫霉胞內(nèi),并在胞內(nèi)通過氧化還原反應對細胞結(jié)構(gòu)造成破壞,發(fā)揮抑菌作用。

    4 結(jié) 論

    TIVL對致病疫霉、茄科雷爾氏菌和瘡痂病鏈霉菌3種馬鈴薯致病菌均有較好的抑菌作用,當TIVL 濃度達到16 mg/L時3種供試菌株已完全不能生長。TIVL進入致病菌胞內(nèi),通過氧化還原反應破壞細胞超微結(jié)構(gòu),抑制病菌正常生長,實現(xiàn)抑菌作用。本研究可為馬鈴薯綠色生產(chǎn)和實現(xiàn)化學肥料與化學農(nóng)藥“雙減”目標提供產(chǎn)品和技術(shù)支撐。

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