三氯生對羊肚菌霉菌性枯萎病病原菌的抑制作用

楊 春，劉本洪，劉 蕾，張 怡

(四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院， 成都 610065)

【研究意義】羊肚菌(Morchellaspp.)是一類名貴食(藥)用菌[1]，在國際市場上有較大需求，價(jià)格頗高，2018年全國人工栽培羊肚菌干品批發(fā)價(jià)保持在900～1400 元/kg[2]。羊肚菌屬于低溫型真菌[3]，適宜生長溫度為18～22 ℃[4]。新鮮羊肚菌上市季節(jié)非常短暫，主要在春季[5]。中國羊肚菌商業(yè)栽培開始于2012年前后，主要栽培物種為梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)和六妹羊肚菌(Morchellasextelata)，隨后國內(nèi)羊肚菌的人工栽培面積不斷擴(kuò)大，從2012年200 hm2[6]到2018—2019年8000～9333 hm2[7]。羊肚菌栽培在中國食用菌栽培行業(yè)占據(jù)重要地位，川渝地區(qū)是我國羊肚菌主產(chǎn)區(qū)[6]。與常規(guī)食用菌基質(zhì)袋栽技術(shù)不同，羊肚菌整個(gè)栽培過程均暴露在復(fù)雜外部環(huán)境中，菌絲生長和子實(shí)體發(fā)育易受土壤微生物影響[8]。隨著食用菌栽培產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展和栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大，食用菌病害越來越普遍和頻繁，成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要瓶頸[9]，羊肚菌也是如此。在2013年3月，由Diplo?sporalongispora引起的霉菌性枯萎病(下文簡稱枯萎病)首次在湖北省和重慶市被發(fā)現(xiàn)，5%～8%菇體感染了枯萎病，如今該病害在栽培區(qū)域已十分常見[10]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】以往的研究集中于致病真菌分離和鑒定。目前已知枯萎病是一種嚴(yán)重的真菌性病害且多發(fā)生于栽培后期，當(dāng)環(huán)境溫度升高時(shí)病害會(huì)迅速蔓延，染病部位呈白色絨毛狀，隨染病時(shí)間增加受侵染部位會(huì)萎縮、凹陷和破損。該病原菌分生孢子具有隔膜，通常直接由菌絲膨大而成，呈橢圓形或近梭形；該病原菌的厚垣孢子近球形，通常呈串珠狀[11]?？菸》揽卮胧┲饕獮橥恋靥崆胺?、及時(shí)撤走被污染的外源營養(yǎng)袋和及時(shí)采摘感病的菇體[8]。病原真菌與羊肚菌對藥物敏感程度具有相似性，這就對化學(xué)藥劑選用提出很高要求[12]。目前沒有該病害相關(guān)抑菌劑研究報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】三氯生(Triclosan，下文簡稱TCS)是一種人工合成的抑菌劑，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于口腔護(hù)理產(chǎn)品中[13]，如牙膏[14]和漱口水[15]。含TCS的牙膏可以有效控制牙菌斑形成和保持牙齦健康[16]。TCS在較低濃度時(shí)即可有效抑制革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母菌和霉菌[17]。在與其他化學(xué)抑菌劑如六氯酚(Hexachlorophene)、氯碘羥喹(Clioquinol)、氯喹那多(Chlorquinaldol)和慶大霉素(Gentamicin)等的對比中，TCS對細(xì)菌和真菌作用效果明顯，表現(xiàn)為對多種細(xì)菌和真菌具有更低的最小抑制濃度[18]。TCS曾應(yīng)用于平菇(Pleurotusostreatus)、大球蓋菇(Strophariarugosoannulata)和蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)等食藥用菌的液體發(fā)酵，由于液體菌種在實(shí)際生產(chǎn)中極易受到雜菌污染，在配制液體培養(yǎng)基時(shí)加入TCS(濃度為1～30 mg/L)能夠抑制雜菌生長，提高發(fā)酵成功率[19]。根據(jù)TCS在食藥用菌液體發(fā)酵中的應(yīng)用，推測TCS具有抑制羊肚菌雜菌病害的可能性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文研究了TCS抑雜菌能力和不同濃度TCS對六妹羊肚菌和枯萎病病原菌生長產(chǎn)生的影響，并關(guān)注了在不同TCS濃度下六妹羊肚菌和枯萎病病原菌微觀結(jié)構(gòu)的變化，為研發(fā)控制羊肚菌枯萎病的抑菌劑提供資料參考，有利于羊肚菌栽培行業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 固體培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上增加麥麩作為培養(yǎng)基原料，制得麥麩馬鈴薯葡萄糖瓊脂(下文簡稱WPDA培養(yǎng)基)培養(yǎng)基，每1 L培養(yǎng)基加入200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g麥麩和21 g瓊脂。需滅菌的培養(yǎng)基均在1.5×105Pa下滅菌40 min。

1.2 菌種

六妹羊肚菌母種由四川省成都市科創(chuàng)菌業(yè)有限公司提供。在羊肚菌收獲期間從四川省德陽市中江縣某羊肚菌栽培基地(31.023°N，104.737°E)收集出現(xiàn)枯萎病癥狀的菇體，用滅菌的接種環(huán)挑取感病部位的白色菌絲接種于WPDA培養(yǎng)基，常溫培養(yǎng)4 d后可發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上出現(xiàn)具有濃密白色菌絲的菌落，將其轉(zhuǎn)接至新的WPDA培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。鏡檢觀察到該菌種的分生孢子呈梭形且具隔膜，還具有呈串珠狀的厚垣孢子。委托四川省成都市羅寧生物科技有限公司對病原菌菌種進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，使用真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行ITS rRNA基因的PCR擴(kuò)增，使用NCBI的blastn進(jìn)行堿基序列的對比，供試菌株的ITS序列與Paecilomycespenicillatus和D.longispora均具有99%的一致性，枯萎病病原菌D.longispora曾被錯(cuò)誤地鑒定為P.penicillatus[12]。結(jié)合分生孢子和厚垣孢子的形態(tài)特征可判斷該菌種為D.longispora。六妹羊肚菌母種和純化后得到的枯萎病病原菌菌種均放置在培養(yǎng)箱中(18±0.5)℃條件下培養(yǎng)。

1.3 主要試劑和儀器

TCS(山東臨沂優(yōu)索化工科技有限公司)、全溫培養(yǎng)箱HZP-250(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、高壓蒸汽滅菌鍋XFS-280A+(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)、立式顯微鏡AXIOSKOP40(卡爾·蔡司股份公司)。

1.4 TCS抑雜菌能力檢驗(yàn)

首先，將0.50 g的TCS加入500 mL的純凈水中，配制得到1000 mg/L的TCS懸浮液原液。將原液按比例與WPDA培養(yǎng)基混合可得到含不同濃度TCS的培養(yǎng)基。與原液混合后的培養(yǎng)基液體被分裝進(jìn)玻璃試管(18 mm×180 mm)中，分裝完成后使用脫脂棉塞封口。

設(shè)置2組實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)的TCS濃度如表1所示。TCS濃度為0 mg/L的處理為對照組(Control check，CK)。實(shí)驗(yàn)1中培養(yǎng)基設(shè)置滅菌與不滅菌2種處理，這與評價(jià)亞麻籽環(huán)肽混合物對霉菌的抑制作用[20]和有機(jī)肥對黃瓜枯萎病的防治效果[21]的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)類似，不滅菌基質(zhì)中帶有各種雜菌，接近自然條件。實(shí)驗(yàn)1主要是為了探究TCS在發(fā)揮抑雜菌能力的同時(shí)又對六妹羊肚菌產(chǎn)生較小影響的濃度范圍，為實(shí)驗(yàn)2的濃度設(shè)置提供參考依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)2中，將六妹羊肚菌與枯萎病病原菌接種于同一試管培養(yǎng)基上，接種枯萎病病原菌3 d后再接種六妹羊肚菌，通過這種方式模擬土壤中存在枯萎病病原菌的情況。實(shí)驗(yàn)2中所有培養(yǎng)基都經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后再接種。

實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2的每一種處理都設(shè)置10個(gè)重復(fù)。在實(shí)驗(yàn)2的濃度條件下培養(yǎng)了單一的枯萎病病原菌，用以觀察不同TCS濃度下病原菌菌絲的微觀結(jié)構(gòu)差異。接種后的培養(yǎng)基均放入培養(yǎng)箱中(18±0.5)℃培養(yǎng)。

1.5 測量菌絲生長長度

菌絲生長長度可用于評估真菌生長情況，參考在原種培養(yǎng)基中測量菌絲在豎直方向上的延伸長度的方式[22-25]，測量菌絲在試管中的延伸長度。實(shí)驗(yàn)1在接種六妹羊肚菌3 d后測量菌絲生長長度。使用不銹鋼卷尺測量菌絲縱向的生長長度，當(dāng)菌絲長至試管底部時(shí)測量范圍為試管底部至菌絲延伸上邊界，某些處理組中菌絲未長至試管底部，此時(shí)測量范圍為菌絲延伸的下邊界至上邊界。

實(shí)驗(yàn)2中六妹羊肚菌與枯萎病病原菌在同一試管培養(yǎng)基上共同培養(yǎng)，六妹羊肚菌接種較枯萎病病原菌接種晚3 d。在接種枯萎病病原7 d后測量菌絲生長長度。測量菌絲生長長度的方式為測量接種塊中心位置至菌絲延伸最長處的距離。

1.6 光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲微觀結(jié)構(gòu)

實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)行多次使用光學(xué)顯微鏡觀察六妹羊肚菌和枯萎病病原菌菌絲結(jié)構(gòu)變化。

1.7 TCS噴施的初步對比試驗(yàn)

試驗(yàn)地點(diǎn)選擇中國四川省德陽市中江縣某羊肚菌栽培基地(31.023°N，104.737°E)，該基地多個(gè)地塊的羊肚菌菇體出現(xiàn)枯萎病病害癥狀。選擇4個(gè)出現(xiàn)感病菇體的區(qū)域，采用背負(fù)式電動(dòng)噴霧器噴施濃度為40 mg/L的TCS懸浮液，噴施對象為明顯感染枯萎病的菇體，觀察噴施TCS懸浮液一周后枯萎病病癥變化。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以均值(x)±2倍標(biāo)準(zhǔn)差(s)判斷每組數(shù)據(jù)的異常值。使用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)和Levene檢驗(yàn)分別對數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布和是否具備方差齊性進(jìn)行檢驗(yàn)(顯著性水平α=0.05)。當(dāng)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且具有方差齊性時(shí)，采用單因素方差分析(α=0.05)檢驗(yàn)各組處理菌絲生長長度間是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異，事后多重比較選擇LSD法(α=0.05)。當(dāng)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，但不具備方差齊性時(shí)，事后多重比較選擇Dunnett’s T3法(α=0.05)。如果數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，就采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)(α=0.05)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 25.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度TCS處理下未滅菌的培養(yǎng)基雜菌污染和六妹羊肚菌菌絲生長情況

對照組(0 mg/L)培養(yǎng)基表面出現(xiàn)了大量雜菌，肉眼可見地抑制了六妹羊肚菌菌絲生長(圖1-a)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，對照組六妹羊肚菌菌絲生長長度顯著地低于20、40、80 mg/L處理下的菌絲生長長度。當(dāng)TCS濃度為20 mg/L時(shí)，六妹羊肚菌菌絲生長長度顯著地高于0、40、60、80和100 mg/L處理下六妹羊肚菌菌絲生長長度，但是在培養(yǎng)基表面仍能發(fā)現(xiàn)較多雜菌(圖1-b)。高濃度TCS在抑制雜菌的同時(shí)，也抑制六妹羊肚菌的生長，TCS濃度為60和100 mg/L時(shí)，六妹羊肚菌菌絲生長長度與對照組無顯著性差異。

數(shù)據(jù)以x±s形式展示，帶有相同英文字母表示菌絲生長長度在顯著性水平為0.05的條件下不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。下同Data are presented as x±s, with the same English letter indicating that the mycelial length did not show a statistically significant difference at the level of 0.05.The same as below圖1 不同濃度TCS處理下未滅菌的試管培養(yǎng)基接種六妹羊肚菌3 d后的菌絲生長長度和培養(yǎng)基雜菌生長情況Fig.1 Mycelial length and undesired microbes’ growth after 3 days of inoculation of M. sextelata on unsterilized test tube media under different concentrations of TCS

在不滅菌的情況下，與對照組相比，加入TCS的培養(yǎng)基出現(xiàn)雜菌的情況明顯減少，且隨著TCS濃度的增加，抑雜菌效果就越明顯。但是，當(dāng)TCS濃度過高(100 mg/L)時(shí)，TCS對六妹羊肚菌菌絲生長的抑制作用不可忽視，甚至與雜菌對六妹羊肚菌生長產(chǎn)生的抑制類似。

表1 各組實(shí)驗(yàn)的TCS濃度設(shè)置

2.2 不同濃度TCS處理下滅菌后培養(yǎng)基六妹羊肚菌菌絲生長情況

實(shí)驗(yàn)1-2中對照組的六妹羊肚菌菌絲生長長度最長，顯著地高于其他處理組。40 和100 mg/L TCS處理濃度下，六妹羊肚菌菌絲生長長度沒有顯著性差異。培養(yǎng)基不滅菌處理主要是為了檢驗(yàn)TCS是否具有良好的抑雜菌效果。培養(yǎng)基滅菌處理可檢驗(yàn)在沒有雜菌影響的情況下TCS濃度對六妹羊肚菌生長的影響。可發(fā)現(xiàn)隨著TCS濃度增加，六妹羊肚菌菌絲生長長度呈下降趨勢。從菌絲外觀可以看出，當(dāng)TCS濃度為40～100 mg/L時(shí)，菌絲主要呈團(tuán)狀(圖2-d～圖2-f)；當(dāng)TCS濃度較低時(shí)，菌絲生長較為整齊。

圖2 不同濃度TCS處理下滅菌試管培養(yǎng)基接種六妹羊肚菌3 d后的菌絲生長長度Fig.2 Mycelial length and undesired microbes’ growth after 3 days of inoculation of M. sextelata on sterilized test tube media under different concentrations of TCS

2.3 不同濃度TCS處理下枯萎病病原菌與六妹羊肚菌共同培養(yǎng)時(shí)的生長情況

2.3.1 枯萎病病原菌和六妹羊肚菌菌絲生長情況 從菌絲外觀可以看出，隨著TCS濃度的增加，枯萎病病原菌和六妹羊肚菌的菌絲生長形態(tài)逐漸畸形(圖3)，這與實(shí)驗(yàn)1觀察到的現(xiàn)象一致。

接種枯萎病病原菌25 d后每組處理已有2支培養(yǎng)基被用于觀察光學(xué)顯微鏡下的菌絲微觀結(jié)構(gòu)；(a)接種7 d后；(b)接種4 d后，此時(shí)是接種枯萎病病原菌7 d后Two test tube media of each treatment were used to observe the microstructure of mycelium after 13 days of D. longispora inoculation; (a) After 7 days of inoculation; (b)After 4 days of inoculation, 7 days after D. longispora inoculation圖3 不同濃度TCS處理下六妹羊肚菌與枯萎病病原菌共同培養(yǎng)時(shí)菌絲生長長度Fig.3 Mycelial length in co-cultures of M. sextelata and D. longispora under different concentrations of TCS

接種枯萎病病原菌7 d后，40 mg/L TCS濃度下霉菌性枯萎病病原菌菌絲生長長度最短，顯著地低于0、5、10和20 mg/L處理下的菌絲生長長度。0、10和20 mg/L處理下的枯萎病病原菌菌絲生長長度之間沒有顯著性差異。同時(shí)隨著TCS濃度的增加，六妹羊肚菌的菌絲生長長度也隨之減小。因?yàn)橐延?支試管種被用于觀察顯微鏡下微觀結(jié)構(gòu)，所以接種枯萎病病原菌25 d后每組處理剩余8支試管種。此時(shí)可觀察到枯萎病病原菌與六妹羊肚菌交叉生長，從外觀上可看出，枯萎病病原菌菌絲在與六妹羊肚菌菌絲相接后仍逐漸向上延伸，培養(yǎng)基中未添加TCS的對照組中可觀察到枯萎病病原菌菌絲長滿整個(gè)培養(yǎng)基的現(xiàn)象。

2.3.2 顯微鏡觀察下的微觀結(jié)構(gòu) 在顯微鏡下觀察，可在六妹羊肚菌菌絲體周圍發(fā)現(xiàn)枯萎病病原菌串珠狀的厚垣孢子(圖4-a、c、d)，且病原菌菌絲可能侵入了羊肚菌菌絲(圖4-b、e、f)。顯微鏡下未觀察到六妹羊肚菌的分生孢子。羊肚菌在人工栽培過程中容易產(chǎn)生分生孢子，但是在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中沒有觀察到分生孢子的產(chǎn)生[26]。

接種枯萎病病原菌35 d后，箭頭指出附著在羊肚菌菌絲周圍的枯萎病病原菌菌絲和孢子After 35 days of D. longispora inoculation.Arrows point to the mycelia and spores of D. longispora attached to mycelia of M. sextelata圖4 不同濃度TCS處理下六妹羊肚菌與枯萎病病原菌交叉生長區(qū)域菌絲形態(tài)Fig.4 Mycelial morphology in the co-growth area of M. sextelata and D. longispora under different concentrations of TCS

在40 mg/L的TCS處理濃度下，枯萎病病原菌產(chǎn)生的分生孢子出現(xiàn)畸形、破裂和內(nèi)容物外泄現(xiàn)象(圖5)。在其他TCS處理濃度(0、5、10、20 mg/L)下未觀察到此現(xiàn)象。

圖5 接種單一枯萎病病原菌41 d后不同濃度TCS處理下分生孢子形態(tài)Fig.5 Conidia morphology under different concentrations of TCS after 41 days of D. longispora inoculation

2.4 TCS噴施的初步對比試驗(yàn)結(jié)果

真菌性病害爆發(fā)速度快，會(huì)很快地?cái)U(kuò)散至周圍區(qū)域[11]。初步對比試驗(yàn)的結(jié)果表明對感染枯萎病的羊肚菌噴施40 mg/L的TCS懸浮液后，枯萎病未出現(xiàn)大范圍擴(kuò)散現(xiàn)象?？擅黠@看出生長在感病菇體周圍的大部分健康菇體在7 d后并未出現(xiàn)枯萎病感染癥狀(圖6-e～圖6-h)且生長正常。

3 討 論

食用菌病害包括侵染性病害和競爭性病害，如木霉菌(Trichodermaspp.)是最常見的食用菌侵染性病害病原菌[27]。在對峙實(shí)驗(yàn)中可觀察到棘孢木霉(T.asperellum)的分生孢子附著在平菇菌絲周圍[28]，多個(gè)木霉菌株都能侵入香菇(Lentinusedodes)菌絲體中[29]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)枯萎病病原菌孢子附著于六妹羊肚菌菌絲周圍且病原菌菌絲侵入六妹羊肚菌菌絲的現(xiàn)象，這與木霉侵染平菇和香菇的表現(xiàn)一致，然而目前病原真菌侵染食用菌菌絲的具體過程還沒有深入研究[29]，僅推測枯萎病屬于侵染性病害。

抑制病菌的菌絲生長是抑菌劑產(chǎn)生效果的表現(xiàn)?？菸〔≡木z生長長度隨著TCS濃度的增加而降低，表明TCS對羊肚菌枯萎病病原菌的菌絲生長表現(xiàn)出了抑制作用。這一結(jié)果與以下抑菌劑對某些致病菌菌絲造成的抑制效果相似：氰烯菌酯和種菌唑?qū)λ緪好绮〔≡?Fusariumfujikuroi)具有很高的抑真菌活性，表現(xiàn)為對菌絲生長產(chǎn)生抑制[30]。從香莢蘭(Vanillaplanifolia)中萃取的o-Vanillin能夠抑制污染糧食作物的真菌Aspergillusflavus菌絲生長，表現(xiàn)為隨著o-Vanillin劑量的提高，菌落直徑減小，菌絲抑制率不斷增加[31]。

TCS可以抑制細(xì)菌在FabI(烯?！；d體蛋白還原酶)步驟中的脂肪酸合成，這種抑制作用會(huì)造成膜完整性的喪失[32]。雖然TCS的作用機(jī)制被歸結(jié)為對脂肪酸生物合成的抑制，但有研究證明TCS的抑菌作用至少部分是通過嵌入磷脂膜，造成膜結(jié)構(gòu)擾動(dòng)介導(dǎo)的，它可能發(fā)揮了一種獨(dú)立于抑制脂肪酸生物合成的抑菌作用[33-34]，但是這些作用都最終表現(xiàn)為細(xì)胞膜完整性的破壞。此外，TCS可干擾FabB(3-氧代-酰基載體蛋白合成酶I)，從而防止細(xì)菌形成菌落[35]，這解釋了在不滅菌處理下添加了TCS的培養(yǎng)基很少或幾乎沒有細(xì)菌污染的現(xiàn)象。

在真菌性病害中，病原菌和食用菌同屬于真菌，無性孢子是病原菌的初侵染與再侵染源，因此控制病原菌的孢子萌發(fā)非常重要[36]。在40 mg/L的TCS處理下枯萎病病原菌分生孢子的畸形、破裂和內(nèi)容物的外泄，說明在該濃度處理下，TCS對枯萎病病原菌已表現(xiàn)出良好的抑真菌活性。細(xì)胞膜是真菌細(xì)胞吸收營養(yǎng)并與周圍環(huán)境交換物質(zhì)能量的重要屏障，它的完整性在維持細(xì)胞活力方面起著重要作用[37]，破壞細(xì)胞膜的完整性是抑菌劑發(fā)揮作用的一種方式[38]。在噴施40 mg/L的TCS懸浮液后，羊肚菌枯萎病擴(kuò)散現(xiàn)象得到有效抑制。

目前，多種化學(xué)抑菌劑被用于防治食用菌的雜菌污染和病害，選擇抑菌劑應(yīng)該堅(jiān)持高效、低毒和低殘留的原則，其次是考慮食用菌對抑菌劑的敏感性[39]。病原菌與食用菌同屬于真菌，具有類似的生理特征，對病原菌有強(qiáng)烈抑制作用的抑菌劑可能無法避免對食用菌也有抑制作用[36]。因此，應(yīng)選擇具有良好防治病菌效果，又對食用菌本身影響較小的抑菌劑。中國農(nóng)藥信息網(wǎng)(http://www.icama.org.cn/hysj/index.jhtml)的農(nóng)藥登記數(shù)據(jù)中，可查詢到13 條用于食用菌(蘑菇)生產(chǎn)的抑菌劑，包含的農(nóng)藥種類有咪鮮胺錳鹽、二氯異氰尿酸鈉、百菌清和噻菌靈，施用方法一般為拌料或噴霧。目前還未見到用于羊肚菌栽培生產(chǎn)的農(nóng)藥備案[11]。

多菌靈常用于抑制食用菌生產(chǎn)過程中的雜菌生長。在PDA平板中不同濃度多菌靈對茶樹菇(Agrocybeaegerita)菌絲生長產(chǎn)生明顯抑制作用，不同濃度的處理組(10、15、20、25、30、35和40 μg/mL)與對照組菌絲生長速度差異極顯著(P<0.01)，且隨著濃度增大抑制作用增強(qiáng)[40]。對綠色木霉(T.viride)菌絲有抑制作用的多菌靈對平菇菌絲生長也具有抑制作用，500、1000、2000、4000倍稀釋的多菌靈對平菇菌絲生長速度的影響與對照相比差異極顯著(P<0.01)，抑制作用與施加藥劑濃度呈正相關(guān)[41]。測試殺真菌劑對菌蓋疣孢霉菌(Mcogoneperniciosa)和雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)菌絲的毒力差異，得到咪鮮胺類殺菌劑施保功和施?？藢w疣孢霉菌菌絲、疣孢霉菌分生孢子和雙孢蘑菇菌絲都具有較強(qiáng)的抑制作用，而施保功在雙孢蘑菇上已取得登記，可以應(yīng)用于生產(chǎn)[42]。

方框圈出菇體感染枯萎病的部位Boxes mark the part of morels infected by D. longispora圖6 噴施的TCS懸浮液(40 mg/L)7 d后感染枯萎病的羊肚菌生長狀態(tài)Fig.6 The growth state of morels infected by D. longispora after 7 days of spraying TCS suspension(40 mg/L)

TCS濃度的增加會(huì)造成六妹羊肚菌菌絲生長受到抑制。TCS濃度越高，抑制作用越明顯。這與上述某些在現(xiàn)實(shí)中得到應(yīng)用的化學(xué)抑菌劑對食用菌產(chǎn)生的影響具有一致性。因此，選擇合適的抑菌材料和控制施用濃度十分重要。

慢性毒性試驗(yàn)中，在Sprague-Dawley大鼠的飲食中以4種劑量水平(0、300、1000和3000 mg/L)施用TCS，為期2年。另外的實(shí)驗(yàn)組以6000 mg/L的劑量施用1年。結(jié)果顯示，TCS對大鼠死亡率沒有顯著影響，在飲食TCS劑量為3000 mg/L的大鼠中觀察到肝臟疾病，但在1000 mg/L的劑量水平下未發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟組織變化，可認(rèn)為1000 mg/L是TCS長期口服的“無影響水平”，毒理學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)研究以及臨床調(diào)查表明，TCS對人類一般沒有毒性潛力[13]。

《牙膏用原料規(guī)范》 (GB 22115—2008)中規(guī)定的TCS最大允許使用濃度為0.3%[43]，本研究結(jié)果表明40 mg/L的TCS足夠抑制羊肚菌枯萎病，該濃度僅占牙膏中最大允許使用濃度的1.3%，且并不需要長期施用。歐洲消費(fèi)者安全科學(xué)委員會(huì)(Scientific Committee on Consumer Safety)評估了TCS應(yīng)用于消費(fèi)品的安全性，在總結(jié)中表明漱口水中0.2%的最大TCS添加濃度和牙膏中0.3%的最大TCS添加濃度是安全的[44]。盡管TCS能夠以0.3%的最大濃度被添加到牙膏(口腔護(hù)理產(chǎn)品)中，它在羊肚菌這一食用菌栽培上的應(yīng)用安全性仍需要在未來得到進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

(1)TCS能夠有效控制羊肚菌菌種生產(chǎn)和栽培過程中的雜菌污染，對特定的枯萎病病原菌也具有良好抑制效果，表現(xiàn)為對菌絲生長的抑制和孢子完整性的破壞。

(2)在田間栽培環(huán)境中病菌污染風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，特別是在栽培環(huán)節(jié)，羊肚菌栽培種被直接播種于土壤中，病菌污染的可能性更大。TCS噴施的初步對比試驗(yàn)結(jié)果表明在這種高風(fēng)險(xiǎn)環(huán)境下，TCS仍表現(xiàn)出了肉眼可見的抑制羊肚菌枯萎病擴(kuò)散的良好效果。

(3)高濃度的TCS會(huì)對六妹羊肚菌的生長具有抑制作用，但是與病菌污染造成的抑制作用相比，一定濃度范圍內(nèi)(10～40 mg/L)TCS產(chǎn)生的抑制作用影響較小。本實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)表明TCS可能成為一種具有前景的應(yīng)對羊肚菌枯萎病的抑菌材料。

致 謝：感謝中國科學(xué)院成都山地災(zāi)害與環(huán)境研究所的邱敦蓮研究員在文章撰寫和修改過程中給予的意見和建議。