沙柳SpsNAC034基因克隆及多種逆境表達分析

楊海峰,張新乾,于興旺,郝 璞,樊俐嬌,王樹森,于鳳強,阿拉騰蘇和

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學林學院，呼和浩特 010000;2.內(nèi)蒙古蒙草生態(tài)環(huán)境(集團)股份有限公司，呼和浩特 010000;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學沙漠治理學院, 呼和浩特 010000;4.鄂爾多斯林業(yè)和草原事業(yè)發(fā)展中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000;5.鄂爾多斯造林總場，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

【研究意義】植物在生長過程中，因為所處環(huán)境不同而遭受各種脅迫，繼而影響植物正常生長發(fā)育，使林木經(jīng)濟產(chǎn)量降低，影響農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。研究表明，NAC 轉錄因子可通過參與植物激素信號通路來調(diào)節(jié)植物的逆境響應。但目前對于木本植物NAC基因的抗逆研究雖有一定了解但相對滯后，因此，開展沙柳NAC轉錄因子的抗逆研究，探究該基因在非生物脅迫下的應答分析，將有助于進一步增加木本植物NAC轉錄因子的分子抗逆機制研究，對于分析沙柳NAC基因功能以及探究其抗逆分子機制具有重要應用價值?！厩叭搜芯窟M展】NAC是植物細胞內(nèi)特有的轉錄因子，也是迄今為止植物基因組中發(fā)現(xiàn)的最大轉錄因子家族之一[1]。NAC轉錄因子包含5個典型的NAC子結構域：A、B、C、D和E，由大約150個氨基酸組成[2-3]。NAC轉錄因子的命名最初源于被發(fā)現(xiàn)含有NAC結構域的3個同源基因的首字母，即在胚胎和花朵發(fā)育中起作用的矮牽牛無頂端分生組織中克隆出來的NAM基因、ATAF1/2以及在擬南芥中克隆得到的CUC2(對于杯狀子葉)基因[4-5]。伴隨著基因組學的快速發(fā)展，目前對NAC轉錄因子的研究也已逐步深入。在擬南芥[Arabidopsisthaliana(L.) Heynh. (Cruciferae)]、水稻(OryzasativaL.)、玉米[ZeamaysL. (Gramineae)]、大豆[Glycinemax(Linn.) Merr. (Leguminosae)]、番茄[LycopersiconesculentumMill. (Solanaceae)]、菠蘿[Ananascomosus(Linn.) Merr.]、柑橘[CitrusreticulataBlanco (Rutaceae)]、沙冬青[Ammopiptanthusmongolicus(Leguminosae)]、小黑楊[Populus×xiaoheiT. S. Hwang et Liang (Salicaceae)]、柳樹(蘇柳)等植物中均證實了NAC轉錄因子的存在和功能。研究發(fā)現(xiàn)，蘇柳中SlNAC1、SlNAC2基因分別可被干旱、鹽誘導，且表達量均上調(diào)[6]。NAC7基因已在小黑楊中成功克隆，主要在根中表達并且對鹽脅迫有響應[7]。在水稻和擬南芥基因組中，成功預測了149和106個NAC家族轉錄因子，這些NAC轉錄因子對植物生長發(fā)育均具有重要的調(diào)控作用[8-9]。Jeong等[10]研究發(fā)現(xiàn)，水稻中過量表達Os11g03300/OsNAC10的植株在生殖階段對干旱具有較強的耐受性，表明這2個NAC基因對干旱脅迫具有重要作用。脫落酸(Abscisic Acid)ABA處理過后的少數(shù)OsNAC基因屬于SNAC亞組和NAM/CUC3亞組，并在葉片和穗中產(chǎn)生應答反應[11]。此外，Ooka等[12]發(fā)現(xiàn)NAM和CUC2都參與莖頂端分生組織的形成和發(fā)育，而且還在NAM和NAC1亞組中發(fā)現(xiàn)了預測的其它NAC蛋白。上述研究說明NAC轉錄因子不僅在植物的抗逆中具有重要功能，而且也參與了植物的形態(tài)建成和發(fā)育?！颈狙芯壳腥朦c】我國西部地區(qū)是典型的鹽堿地沙質(zhì)土壤，維持其植物多樣性以及生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定是重中之重?；哪参锷沉?SalixpsammophilaC. Wang et Ch. Y. Yang) 在長期的進化過程中，對環(huán)境的適應和抵抗能力逐漸增強。沙柳的根系發(fā)達、發(fā)芽勢強[13]，是少數(shù)能在鹽堿地生長的植物之一，維持其穩(wěn)定的生物量至關重要。因此，本研究以沙柳為實驗材料，對沙柳NAC轉錄因子進行同源克隆、生物信息學分析以及抗逆機制的研究具有重要意義?！緮M解決的關鍵問題】本研究以沙柳為研究對象，克隆沙柳SpsNAC034基因的編碼序列(Coding Sequence, CDS)，進行生物信息學分析，并通過模擬非生物脅迫揭示該基因在沙柳經(jīng)高溫、低溫、鹽以及干旱4種逆境后的響應特性，為探究沙柳的抗逆育種提供應用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

該研究使用的實驗材料沙柳(SalixpsammophilaC. Wang et Ch. Y. Yang)是來自內(nèi)蒙古鄂爾多斯達拉特旗吉格斯太鎮(zhèn)的沙柳種質(zhì)資源庫的無性系，截取長勢良好植株水培備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙柳總RNA的提取及反轉錄cDNA的合成 使用天根RNAprep Pure Polysugar Polyphenol Plant Total RNA Extraction Kit總RNA 提取試劑盒(DP441)提取沙柳總RNA，反轉錄(FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix)合成cDNA，儲存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 UTR區(qū)設計特異性引物及基因克隆 利用擬南芥NAC基因與歐洲紅皮柳和毛果楊進行同源比對分析之后，再用Primer 5.0軟件在基因UTR區(qū)設計特異性引物NAC034-F1(TTATTCGAGGCGGTCCGA)、NAC034-F2(GGAGTTGGAGTTCAAGTCTTCA AG)，送中美泰和生物公司合成。

以cDNA為模板進行PCR擴增，最佳退火溫度60 ℃。反應體系20 μL: cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，A8高保真酶(2×A8 Fast HiFi PCR MasterMix)10 μL，蒸餾水補至20 μL。反應程序：98 ℃預變性5 min，98 ℃變性1 min， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min后將所得PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀顯示其與目的基因條帶一致后用Takara凝膠回收試劑盒回收目的基因。利用膠回收所得目的片段連接克隆載體(pEASY-Blunt zero Cloning Vector)后轉化感受態(tài)細胞。待含有相應抗生素的固體LB板長出單菌落后，挑取單菌落通過PCR檢測目標條帶正確后送全式金生物公司測序。

1.2.3 沙柳SpsNAC034基因生物信息學分析 利用在線網(wǎng)站NCBI 的 ORF分析SpsNAC034基因的開放閱讀框；同源氨基酸序列用Phytozome 11數(shù)據(jù)庫查詢；分別通過T-COFFEE(http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/index.html)、MEME Suite(http://meme-suite.org/)進行氨基酸多序列以及結構域的比對; MEGA 6.0和ClustalX 2.0構建進化樹; ExPASy和ExPASy-ProtParam tool分析SpsNAC034氨基酸的理化特性，包括總平均疏水指數(shù)、原子量、分子量、理論等電點、蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)等; 利用在線網(wǎng)址(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)和Singal P4.1查詢確定SpsNAC034蛋白是否存在信號肽、跨膜結構；將SpsNAC034基因的蛋白序列上傳至NPS(@https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html)、Swiss model(http://swiss model.expasy.org/)分析蛋白質(zhì)二三級結構；通過WOLF PSORT(http: //www.genscript.com/wolf-psort.html)進行亞細胞定位的分析預測[14-15]。BAR(http://bar.utoronto.ca)楊樹基因數(shù)據(jù)庫在線預測基因的組織特異表達情況[16]。

1.2.4 沙柳SpsNAC034基因組織特異性表達RT-PCR分析 利用1.2.1以上提取的RNA的多糖多酚試劑盒提取沙柳各組織部位(根、葉、花、嫩莖、成熟莖、嫩芽)的RNA，并反轉錄獲得cDNA。再利用1.2.2克隆所得的SpsNAC034基因的CDS序列通過Primer3.0設計特異性定量引物qNAC034-F1(CTCTGATTCGGCTGATCCTC)和qNAC034-R1(TTC ATCCGTAGGACGAAACC)，送中美泰和生物公司合成。以cDNA為模板，UBQ(UBQ_F-AAGCCCAAG AAGATCAAGCA和 UBQ_R-ACCACCAGCCTTCTGGTAAA)為內(nèi)參，利用實時熒光定量PCR分析SpsNAC034基因在沙柳不同組織部位基因的相對表達量。根據(jù)公式2-ΔΔCt分析實驗數(shù)據(jù)，再通過SPSS(Statistical Product and Service Solutions)軟件進行顯著性分析。

1.2.5 沙柳SpsNAC034基因非生物脅迫處理下的定量表達分析 選取水培處理后長勢良好的嫩枝，將其分別置于20%聚乙二醇6000 (PEG-6000)和250 mmol/L NaCl溶液中于25 ℃培養(yǎng)箱中模擬干旱和鹽脅迫，蒸餾水處理作為對照(CK)，同樣置于25 ℃培養(yǎng)箱。為了探究溫度脅迫對基因表達量的影響，將其分別置于低溫(4 ℃)和高溫(40 ℃)培養(yǎng)箱中模擬溫度脅迫。以上處理均提供14 h光照，10 h黑暗進行試驗培養(yǎng)。分別于脅迫處理1、2、3、4、6、8、12、24、48 h后，采集不同處理下包括對照組的葉片，每種處理的樣品隨機采集并混樣，3次生物學重復。采樣后置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結果與分析

2.1 SpsNAC034基因克隆

以所提沙柳的RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，SpsNAC034-F1和SpsNAC034-R1為特異性引物進行目標序列克隆。電泳結果顯示目的序列長度與目標條帶一致(圖1)。測序后獲得長1797 bp的編碼序列(Coding Sequence, CDS)，編碼598個氨基酸(圖2)。

M:Trans2K DNA Marker；SpsNAC034: SpsNAC034克隆片段M: Trans2K DNA Marker; SpsNAC034: SpsNAC034 clone fragment圖1 目的基因擴增檢測Fig.1 Target gene amplification detection

圖2 SpsNAC034基因CDS及蛋白序列Fig.2 CDS and protein sequence of SpsNAC034 gene

2.2 SpsNAC034基因的生物信息學分析

2.2.1SpsNAC034基因的氨基酸同源序列比對分析 將SpsNAC034基因與歐洲紅皮柳(SapurV1A.0003s0310.1)、毛果楊(Potri.002G182400.1)、擬南芥(AT4G35580.1)、葡萄(GSVIVT01027470001)、木薯(Manes.05G014800.1)、水稻(LOC_Os06g01230.1)、高粱(Sobic.001G290400.1)編碼的同源氨基酸序列進行多序列比對分析(圖3)。SpsNAC034基因與以上同源氨基酸序列均具有典型的保守結構域NAM，在線網(wǎng)址Pfam顯示SpsNAC034氨基酸序列150～279(C～E區(qū)域)為NAM結構域。且對比分析以上氨基酸序列發(fā)現(xiàn)NAM結構域的序列相對保守，上述預測發(fā)現(xiàn)的典型NAM結構域特征，表明本研究克隆基因隸屬NAC轉錄因子家族。

a: 同源氨基酸多序列比對；b: 同源結構域比對a: Homologous amino acid multiple sequence alignment; b: Homologous domain alignment圖3 SpsNAC034基因氨基酸多序列比對和同源結構域比對Fig.3 Amino acid multiple sequence alignment and homology domain alignment of SpsNAC034 gene

利用MEME Suite將SpsNAC034基因與以上植物的氨基酸同源序列進行同源結構域的分析比對，表明上述同源序列既存在相似結構域，也存在一定的差異結構域(圖3)。由圖3-a的同源氨基酸多序列比對和圖3-b的同源結構域比對可知，SpsNAC034基因與以上同源序列均具有C、D、E 3個同源區(qū)域，該區(qū)域主要為NAM結構域，具有較強保守性；但也存在較大的差異區(qū)域，其中A、B、F、G、H、I區(qū)域為木本植物與草本植物的差異區(qū)域，表明可能木本和草本植物存在分化差異，尤其是A、B區(qū)域為沙柳和歐洲紅皮柳特有的結構域，其他物種不具有，表明這可能是柳屬分化的一個特征區(qū)域。

2.2.2SpsNAC034基因的系統(tǒng)進化樹構建 將 SpsNAC034氨基酸序列和其他物種的同源序列構建進化樹。表明，SpsNAC034基因的系統(tǒng)進化樹共分為木本植物和草本植物兩個大類。木本植物聚為一個大類，其中SpsNAC034基因與歐洲紅皮柳、毛果楊的NAC034基因[17]聚為一類；草本植物聚為另一個大類，將同為禾本科以及單子葉植物的高粱和水稻聚為一亞類，其它草本植物各為一亞類。表明，楊柳科植物的NAC034同源基因的親緣關系更密切，與草本植物同源基因的親緣關系較遠。推測NAC034基因在木本和草木本植物間存在一定的分化，該結果與上述氨基酸同源序列分析的結果一致。

2.2.3 SpsNAC034氨基酸的理化特性分析 SpsNAC034蛋白在第183個氨基酸處疏水性最強，最大值達3.056，第225個氨基酸處親水性最強，最小值達-3.078，總平均疏水指數(shù)(GRAVY)達到-0.510，屬于親水性蛋白。其蛋白分子式為C2866H4478N788O928S31，總原子量9091，分子量65 815.66 kDa，理論等電點(pI)5.32，在氨基酸成分中，絲氨酸(Ser)的含量最高，為14.0%。SpsNAC034蛋白攜帶正、負電荷氨基酸殘基(Arg+Lys、Asp+Glu)總數(shù)分別為50和73。 預測結果顯示蛋白質(zhì)半衰期是30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為56.83，將其歸類為不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。

圖4 SpsNAC034 基因系統(tǒng)進化樹Fig.4 SpsNAC034 gene phylogenetic tree

圖5 SpsNAC034蛋白親水疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of SpsNAC034 protein

同時，psNAC034蛋白沒有跨膜結構和信號肽。

2.2.4 SpsNAC034蛋白二級、三級結構預測 在線預測SpsNAC034蛋白的二級蛋白結構(圖6)發(fā)現(xiàn)，其主要包括延伸鏈(Extended strand)、α螺旋(Alpha helix)以及無規(guī)則卷曲(Random coil)，分別占18.73%、16.72%、64.55%。無規(guī)則卷曲為主要結構，α螺旋占比最小，其中N端二級結構主要以延伸鏈為主， C端以無規(guī)則卷曲為主要結構。

藍色：α螺旋；紫色：無規(guī)則卷曲；紅色:延伸鏈 Blue: Alpha helix;Purple: Random coil;Red: Extended strand圖6 SpsNAC034蛋白的二級結構Fig.6 Secondary structure of SpsNAC034 protein

通過SWISS-MODEL預測SpsNAC034蛋白的三級結構(圖7)，預測結果顯示GMQE(全局模型質(zhì)量評估)為0.13，覆蓋率為0.26；SpsNAC034蛋白與3ulx.1.A的相似度最高，3ulx.1.A為應激誘導轉錄因子 NAC1，是水稻處于逆境時響應 NAC1 保守結構域的晶體結構，SpsNAC034蛋白與其相似度達到40%，表明SpsNAC034 蛋白與NAC1很可能存在一定的功能相似性。

圖7 SpsNAC034蛋白的三級結構Fig.7 Tertiary structure of SpsNAC034 protein

2.2.5 亞細胞定位預測 根據(jù)亞細胞定位軟件WOLF PSORT對SpsNAC034蛋白進行亞細胞定位(表1)。鑒于它位于細胞核 (NUC) 中，準確率為 85%，對該蛋白的初步分析其可能在細胞核中起作用。

表1 SpsNAC034亞細胞定位

2.3 SpsNAC034基因的組織特異性表達預測與定量表達分析

根據(jù)楊樹基因組在線表達分析數(shù)據(jù)庫BAR，以SpsNAC034基因在毛果楊中的同源基因Potri.002G182400.1為依據(jù)進行檢索，預測其在楊樹不同組織內(nèi)的表達特異性(圖8)。從預測結果推測，SpsNAC034基因在花中相對表達量最高，在韌皮部、葉和根中均少量表達，其他部位表達不明顯。

圖8 SpsNAC034表達量預測Fig.8 SpsNAC034 expression prediction

通過RT-PCR檢測分析SpsNAC034基因在沙柳各組織部位的相對表達量，NAC034基因在花中的相對表達量最高，其次在成熟莖、葉片、根以及嫩芽中的表達量依次降低(圖9)。此結果與上述楊樹基因數(shù)據(jù)庫BAR在線預測SpsNAC034基因表達特異性一致。推測SpsNAC034基因在不同組織中相對表達量存在差異可能是由于該基因對沙柳不同組織發(fā)育或抗逆的生理調(diào)控有關。

不同小寫字母代表P<0.05水平差異顯著Different lowercase letters represent significant differences at the level of P<0.05圖9 SpsNAC034基因在不同組織部位的相對表達Fig.9 Relative expression of SpsNAC034 gene in different tissues

2.4 SpsNAC034基因非生物脅迫處理下的定量表達分析

從圖10可知，經(jīng)高溫、低溫、鹽以及干旱脅迫處理，SpsNAC034基因均有響應。其中經(jīng)低溫和高溫脅迫后，基因表達量迅速積累，其表達水平分別在1和2 h處達到高峰，隨后下降，基本與對照組維持在同一水平；鹽處理后，前8 h其基因表達相對穩(wěn)定，而在8 h之后其表達量開始逐漸增高，并在48 h處達到最高; PEG模擬干旱條件下，其表達水平迅速增加，在1 h時達到峰值，之后緩慢下降，維持在較低水平。表明SpsNAC034基因在低溫、高溫、鹽和干旱脅迫下均顯著上調(diào)，說明該基因在非生物脅迫下有顯著響應，其可能在對這些環(huán)境刺激的反應中發(fā)揮一定作用。

*代表P<0.05水平差異顯著* represents a significant difference at the level of P<0.05圖10 SpsNAC034基因在不同逆境下的相對表達量Fig.10 Relative expression of SpsNAC034 gene under different adversities

3 討 論

本研究將SpsNAC034基因與其同源序列進行氨基酸多序列及結構域比對、進化樹聚類分析，結果表明沙柳的NAC034基因與木本植物間NAC034基因的相似度較高，與草本植物間存在一定差異，造成此差別的原因可能是由于木本和草本在漫長的進化過程中對不斷變化的環(huán)境適應的結果。全基因組重復(WGD)又稱多倍化(Polyploid)，使染色體數(shù)目加倍，導致數(shù)百數(shù)千個重復基因被保留，并最終影響物種多樣化[18]。WGD存在于多種真核生物的進化歷程中，程強等[19]通過分析楊樹基因組內(nèi)8000個旁系同源基因，推測楊樹在進化過程中截至目前至少經(jīng)歷了3次基因組重復事件。研究發(fā)現(xiàn)毛果楊和小葉楊都存在WGD事件[20]； WGD 擴展了眾多楊樹基因家族[21]；由此推測可能是由于楊樹基因組重復事件致使木本和草本植物的基因序列呈現(xiàn)差異，而且在漫長的進化過程中，導致基因的多態(tài)性增加，基因結構不斷發(fā)生變異，從而使草本和木本植物的同源NAC034基因之間的差異不斷增大，進而形成不同的基因結構，最終可能導致功能出現(xiàn)一定的分化。本研究中進化樹以及同源結構域比對結果同樣印證了NAC034基因結構在木本和草本植物間的差異。

沙柳NAC034基因響應多種非生物脅迫。研究發(fā)現(xiàn)沙柳經(jīng)高溫和低溫脅迫后，NAC034基因分別在1和2 h表達上調(diào)，而后降至對照組水平，表明低溫和高溫均可誘導SpsNAC034基因的迅速表達，且該基因在溫度脅迫僅1和2 h呈現(xiàn)高表達，這表明其很可能是在溫度脅迫下促使基因表達的早期重要調(diào)控因子。鹽和干旱脅迫也誘導SpsNAC034基因的高表達。本研究分別在鹽處理8 h以及干旱處理1 h后，SpsNAC034表達均有明顯上調(diào)，只是在應答快慢上有所差異。上述研究表明，沙柳NAC034基因響應了多種非生物脅迫。在其他相關物種研究中，NAC基因也響應了多種非生物脅迫。柑橘CsNAC基因在低溫、干旱、鹽脅迫下，其表達水平均上調(diào)[22]，鷹嘴豆CarNAC1、CarNAC5基因分別在低溫和高溫脅迫下均可被誘導表達，且表達量顯著增加[23-24]；硬粒小麥經(jīng)高溫和干旱、鹽處理后，TaNAC69-1基因均顯著表達，分別在24和48 h達到峰值[25]; 菠蘿NAC轉錄因子基因AcoNAC1經(jīng)低溫、干旱處理后分別在24和12 h表達量最高[26]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中ANAC019、ANAC055、ANAC072基因可被干旱和鹽誘導，其過量表達使轉基因植株的耐旱性顯著增加[27]；小麥NAC型轉錄因子基因TaNAC4和TaNAC8分別經(jīng)鹽、低溫和干旱處理后，表達量均明顯增強[28-29]；SNAC1[30]和SNAC2[31]基因對脅迫產(chǎn)生應答，在轉基因水稻植株中的過表達大大增強了其耐旱和耐鹽性。辣椒的CaNAC61基因經(jīng)鹽、干旱、高溫等處理后表達量均顯著上調(diào)[32]。本研究的SpsNAC034基因同樣對多種非生物脅迫有響應，表明該基因參與了沙柳的多種非生物脅迫應答反應，對增加植物的抗逆育種具有重要應用價值。

4 結 論

本研究獲得了具有NAC基因家族典型結構域的沙柳SpsNAC034基因，隸屬NAC基因家族；該基因在木本和草本植物間存在一定的分化；在沙柳中呈現(xiàn)組織特異性表達，花中表達量最高；SpsNAC034基因對多種非生物脅迫均具有應答反應。預計該基因對未來研究木本植物的抗逆調(diào)控機理具有一定參考價值，也可能對提高木本植物的抗逆性具有重要作用。