甘薯KUP/HAK/KT基因家族的全基因組鑒定和表達(dá)模式分析

吳勝男，孫 凱，張 海，劉 峰，張永光，王 鳳(.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)植物研究所，吉林 公主嶺 3605；.扎賚特旗音德爾鎮(zhèn)綜合保障和技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 興安盟 37600)

【研究意義】鉀是植物生長不可或缺的大量營養(yǎng)元素之一，占植物總干物質(zhì)的2%～7%。甘薯作為典型喜鉀作物，鉀素有調(diào)節(jié)甘薯細(xì)胞滲透壓[1]、膜內(nèi)外電荷平衡[2]、參與酶活反應(yīng)[3]、提高光合反應(yīng)速率[4]，促進(jìn)植株內(nèi)糖分的運(yùn)輸和蛋白質(zhì)合成等作用。研究表明通過栽培技術(shù)等手段可以提高甘薯對(duì)鉀的利用效率[5]，進(jìn)而促使甘薯產(chǎn)量的提升[6]，而有關(guān)甘薯鉀離子吸收分子機(jī)制的研究還未見報(bào)道。因此，研究提高甘薯對(duì)K+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)成為當(dāng)下的熱點(diǎn)方向?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物通過鉀離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體兩大系統(tǒng)來完成植物對(duì)K+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，根據(jù)前人在擬南芥和水稻中的相關(guān)研究[7]，已經(jīng)確定K+轉(zhuǎn)運(yùn)體主要分為KUP/HAK/KT、KEA、Trk/HKT及CHX四大家族[8]。其中KT/HAK/KUP是在大腸桿菌中被首次鑒定到，稱為KUP轉(zhuǎn)運(yùn)體，負(fù)責(zé)鉀離子吸收，在土壤酵母中發(fā)現(xiàn)則稱為HAK1轉(zhuǎn)運(yùn)體，對(duì)鉀離子有較高的親和力[9]。水稻的OsHAK5基因在過表達(dá)的情況下，能通過K+從地下部分到地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)，增加其耐鹽性；在干旱脅迫脅迫下ABA可以擬南芥的KUP6基因表達(dá)量迅速上調(diào)；擬南芥AtHAK5和AtKUP11可以通過對(duì)K+的轉(zhuǎn)運(yùn)響應(yīng)鹽脅迫?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今在擬南芥[10]、水稻[11]、玉米[12]、小麥[13]、大豆[14]、蘋果[15]中KUP/HAK/KT基因家族均已被報(bào)道，且有部分KUP/HAK/KT基因已被克隆和功能驗(yàn)證。甘薯是我國第四大的糧食作物[16]，但在甘薯中相關(guān)研究尚未開展?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究中以甘薯品種‘泰中6號(hào)’全基因測序結(jié)果為基礎(chǔ)，通過基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，對(duì)甘薯KUP/HAK/KT家族基因進(jìn)行鑒定，分析其家族蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、親緣關(guān)系和表達(dá)模式，為進(jìn)一步深入分析甘薯KUP/HAK/KT基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 甘薯KUP/HAK/KT家族成員鑒定

首先通過甘薯基因組網(wǎng)站(https://ipomoea-genome.org/)得到甘薯全基因組蛋白序列、CDS和注釋文件。其次以KUP/HAK/KT結(jié)構(gòu)域(PF02705)的隱馬爾科夫模型為條件，通過hmmsearch對(duì)甘薯蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，篩選含有該結(jié)構(gòu)域的序列。最后利用NCBI-CDD和Pfam數(shù)據(jù)庫檢測所得序列結(jié)構(gòu)域的完整性，去除重復(fù)及不完整序列。在cello(http://cello.life.nctu.edu.tw/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位；ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行蛋白質(zhì)的理化特性分析[17]；利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測[18]。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

從TRAI網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org/)和MSU數(shù)據(jù)庫(http://rice.uga.edu/)分別下載擬南芥和水稻KUP/HAK/KT蛋白序列。利用MUSCLE進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA 7.0軟件比鄰法(Neighbor-joining method,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)為1000[19]。通過MEME服務(wù)器(http://meme-suit/org/)分析蛋白序列的保守基序(motifs)，結(jié)合進(jìn)化樹分析結(jié)果整合制圖。

1.3 啟動(dòng)子順式作用元件和GO注釋分析

利用eggNOG-mapper數(shù)據(jù)庫(http://eggnog-mapper.embl.de/)對(duì)甘薯KUP/HAK/KT蛋白進(jìn)行GO注釋分析[20]，使用WEGO 2.0(http://wego.genomics.cn/)進(jìn)行可視化[21]，對(duì)KUP/HAK/KT基因進(jìn)行功能注釋。利用PlantCARE軟件對(duì)順式元件進(jìn)行分析。

1.4 染色體定位和基因復(fù)制事件分析

利用基因組注釋文件，提取甘薯KUP/HAK/KT基因的位置信息，通過blastn比對(duì)甘薯基因組具有潛在重復(fù)關(guān)系的基因?qū)?，并用TBtools進(jìn)行可視化[22]。使用KaKs_calculator計(jì)算甘薯KUP/HAK/KT基因Ka/Ks比值[23]。

1.5 表達(dá)模式分析

利用NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫獲取的‘徐薯18’不同組織和逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄組文件，使用hisat2和ballgown進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，計(jì)算轉(zhuǎn)錄本TPM表達(dá)量，并進(jìn)行KUP/HAK/KT基因家族在不同組織和逆境脅迫下的熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯KUP/HAK/KT基因家族成員鑒定

由表1可知，通過相關(guān)篩選和驗(yàn)證，在甘薯基因組中最終得到的22條甘薯KUP/HAK/KT候選蛋白序列。對(duì)其蛋白質(zhì)理化特性分析發(fā)現(xiàn)，甘薯KUP/HAK/KT蛋白序列長度為227～1252 aa，平均長度為726.4 aa；分子量為18 297.95～140 640.46 u，平均值為78 242.8 u；等電點(diǎn)為5.54～9.31，平均值為8.18?；虻膩喖?xì)胞定位對(duì)于其功能具有借鑒作用，結(jié)果表明所有的甘薯KUP/HAK/KT基因都定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，這和其主要作用是參與K+轉(zhuǎn)運(yùn)是一致的。蛋白完整的二級(jí)結(jié)構(gòu)均具有4～13個(gè)跨膜區(qū)(圖1)。

表1 甘薯KUP/HAK/KT家族基因的特征

縱坐標(biāo)代表跨膜結(jié)構(gòu)概率The ordinate represents transmembrane helices probability圖1 甘薯KUP/HAK/KT蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Transmembrane topology analysis of sweetpotato KUP/HAK/KT proteins

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)13個(gè)擬南芥，27個(gè)水稻，22個(gè)甘薯KUP/HAK/KT全長蛋白質(zhì)序列整合，利用MEGA 7軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。如圖2所示，甘薯KUP/HAK/KT基因家族分為4個(gè)進(jìn)化簇，依次命名為ClusterⅠ、ClusterⅡ、ClusterⅢ和ClusterⅣ，又進(jìn)一步細(xì)分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲ和Ⅳ 6個(gè)亞類。其家族基因數(shù)量依次為ClusterⅡ的成員數(shù)目最多(10)，其次是ClusterⅠ(7)、再次是ClusterⅢ(3)，ClusterⅣ的成員數(shù)目最少(2)，表明甘薯KUP/HAK/KT家族基因的分布情況與擬南芥和水稻相似，均表現(xiàn)為ClusterⅠ和ClusterⅡ的成員數(shù)目遠(yuǎn)多于ClusterⅢ和ClusterⅣ。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹，KUP/HAK/KT基因在水稻，擬南芥，甘薯中的同源性很高，表明KUP/HAK/KT基因物種分化過程中非常保守。

圖2 甘薯、水稻和擬南芥KUP/HAK/KT基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of KUP/HAK/KT genes in sweetpotato, rice and Arabidopsis

如圖3所示，在甘薯KUP/HAK/KT基因家族中共找到10個(gè)基序。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)ClusterⅠ家族成員均含有基序4、基序5和基序8，ClusterⅡ均含有基序2、基序3、基序4、基序6和基序10，ClusterⅢ均含有基序8、基序9和基序10，ClusterⅣ均含有基序8和基序9。這表明，KUP/HAK/KT在進(jìn)化過程中，存在著家族內(nèi)部的分化，進(jìn)一步可能導(dǎo)致各家族基因功能的分化。

圖3 甘薯KUP/HAK/KT基因家族的保守基序Fig.3 Conserved motifs of KUP/HAK/KT genes in sweetpotato

2.3 GO注釋和啟動(dòng)子順式作用元件分析

從圖4可以看出，GO注釋主要包括了細(xì)胞成分(Cellular Component)、分子功能(Molecular Function)、生物過程(Biological Process)三部分。對(duì)甘薯KUP/HAK/KT基因進(jìn)行GO分析；在細(xì)胞成分類別中，所有的KUP/HAK/KT蛋白在細(xì)胞膜的合成過程中發(fā)揮作用，25%的蛋白在細(xì)胞器的合成方面起作用。在分子功能類別中，100%的KUP/HAK/KT蛋白具有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，來發(fā)揮其在植物體內(nèi)的生物學(xué)功能；僅有少于10%的蛋白起催化作用。在生物過程類別中，發(fā)現(xiàn)有100%的蛋白在細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮作用、另有少于20%的KUP/HAK/KT蛋白可在生長發(fā)育過程和細(xì)胞組成生物合成過程中起到調(diào)控作用。通過上述結(jié)果表明甘薯KUP/HAK/KT蛋白在細(xì)胞膜組成過程和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。

圖4 IbKUP/HAK/KT蛋白的基因本體(GO)注釋分析Fig.4 Gene Ontology annotation of IbKUP/HAK/KT proteins

順式作用元件位于基因的旁側(cè)，可以與功能基因一起發(fā)揮作用。本研究截取了IbHAK基因上游1500 bp的序列，分析基因的順式作用元件。如圖5所示，在IbHAK啟動(dòng)子區(qū)域共鑒定到12種順式作用元件，大致可分為四大類：調(diào)控植物生長發(fā)育相關(guān)元件、光響應(yīng)元件、逆境響應(yīng)元件和激素響應(yīng)元件。其中22個(gè)IbHAK基因都含有TATA和CAAT控植物生長發(fā)育相關(guān)元件以及光響應(yīng)元件；22個(gè)IbHAK基因含有1～3種逆境響應(yīng)元件，包含響應(yīng)干旱、低溫、厭氧、物理傷害的順式作用元件；22個(gè)IbHAK基因都含有1～4種激素響應(yīng)元件，包含響應(yīng)茉莉酸甲酯、脫落酸、生長素、赤霉素和水楊酸順式作用元件。這表明IbHAK基因?qū)δ婢澈图に仨憫?yīng)中起到至關(guān)重要的作用。

圖5 甘薯KUP/HAK/KT啟動(dòng)子順式作用元件分析Fig.5 Cis-elements in the promoter regions of KUP/HAK/KT genes in sweetpotato

2.4 染色體定位、基因復(fù)制分析

根據(jù)甘薯基因組gff3注釋文件，將鑒定得到了IbHAK基因進(jìn)行染色體定位。如圖6所示，22個(gè)基因分布在甘薯的11條染色體上。其中Chr4染色體上含有IbHAK基因最多(4個(gè))；Chr5染色體上分布3個(gè)IbHAK基因；而Chr6、Chr13、Chr14和Chr15 4條染色體上沒有IbHAK基因；此外的9條染色體上分布1～2個(gè)IbHAK基因。通過對(duì)甘薯IbHAK復(fù)制事件的分析，共發(fā)現(xiàn)3對(duì)大片段復(fù)制事件(IbHAK1/IbHAK2、IbHAK2/IbHAK13和IbHAK10/IbHAK11)和2對(duì)串聯(lián)復(fù)制事件(IbHAK7/IbHAK8和IbHAK8/IbHAK9)。為了研究IbHAK基因在進(jìn)化過程中對(duì)受到何種選擇，計(jì)算了非同義突變頻率(Ka)和同義突變頻率(Ks)的比值，發(fā)現(xiàn)IbHAK基因的并聯(lián)復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制基因?qū)Φ腒a/Ks值分別為0.75和0.893，比值均小于1，說明所有IbHAK復(fù)制事件在甘薯進(jìn)化過程中都受到了純化選擇(表2)。

圖6 甘薯KUP/HAK/KT基因的基因定位和甘薯基因組內(nèi)復(fù)制基因?qū)ig.6 Genomic locations of IbKUP/HAK/KT genes and duplicated gene pairs in sweetpotato

表2 甘薯KUP/HAK/KT基因復(fù)制事件類型、同義替換率、非同義替換率及其比值

2.5 表達(dá)模式分析

為深入研究IbHAK基因在甘薯生長發(fā)育過程中潛在的生物學(xué)功能，通過‘徐薯18’的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)甘薯KUP/HAK/KT家族基因在根、莖和葉中的表達(dá)情況進(jìn)行分析(圖7-A)發(fā)現(xiàn)：IbHAK基因表現(xiàn)出了明顯的組織表達(dá)特異性，一些組織特異性表達(dá)的基因主要分布在Ⅱa、Ⅲ、Ⅱb和Ⅰa，其中亞家族Ⅱa和Ⅲ全部成員，Ⅱb大部分成員均在莖中呈現(xiàn)高表達(dá)，在葉和根中低表達(dá)；亞家族Ⅰa的大部分成員在根中表達(dá)量較高，在葉和莖中表達(dá)量很低。Ⅰa中IbHAK22、IbHAK6、IbHAK8和IbHAK9在根中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于莖和葉，這幾個(gè)IbHAK基因在甘薯根的生長發(fā)育過程中起至關(guān)重要的作用。

圖7 甘薯KUP/HAK/KT基因在不同組織(A)和逆境脅迫(B)中的表達(dá)Fig.7 Expression profiles of sweetpotato KUP/HAK/KT genes in different tissues (A) and under adversity(B)

同時(shí)利用‘徐薯18’在干旱、鹽、冷、水楊酸、脫落酸和茉莉酸甲酯脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，解析IbHAK基因在逆境脅迫下的生物學(xué)功能。如圖7-B所示，在干旱脅迫下50%(11/22)的KUP/HAK/KT基因表達(dá)量上調(diào)，IbHAK1和IbHAK2表達(dá)量明顯上調(diào)；在鹽脅迫下36.4%(8/22)的IbHAK基因表達(dá)量上調(diào)，其中IbHAK10和IbHAK18表達(dá)量明顯上調(diào)；在冷脅迫下59.1%(13/22)的IbHAK基因表達(dá)量上調(diào)，其中IbHAK22表達(dá)量顯著上調(diào)；在脫落酸處理下81.8%(18/22)的IbHAK基因表達(dá)量均上調(diào)；在水楊酸和茉莉酸甲酯處理下除IbHAK4表達(dá)量略有上調(diào)外，其余IbHAK基因均呈現(xiàn)表達(dá)量下調(diào)。

3 討 論

甘薯是世界上重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物,中國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國[16]。而鉀作為植物生長所需的三大營養(yǎng)元素之一，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用，因此研究甘薯K+吸收機(jī)制和培育鉀高效品種對(duì)甘薯的生產(chǎn)具有重要意義[24-25]。本試驗(yàn)利用甘薯基因組信息和生物信息學(xué)手段，對(duì)甘薯KUP/HAK/KT基因家族進(jìn)行分析，在甘薯全基因組內(nèi)共發(fā)現(xiàn)22個(gè)甘薯IbHAK基因，數(shù)量相比水稻(27)、大豆(30)和玉米(27)相差不多。所有的IbHAK基因定位結(jié)果都顯示位于質(zhì)膜，與GO注釋顯示的所有IbHAK基因都具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能相對(duì)應(yīng)，這與前人對(duì)小麥和大豆研究結(jié)果一致[26]。此外對(duì)家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析來看，甘薯KUP/HAK/KT基因家族可分為4個(gè)進(jìn)化簇(ClusterⅠ～Cluster Ⅳ)，各進(jìn)化簇的成員分布差異較大，其中77.3%的IbHAKs來源于ClusterⅢ和ClusterⅣ，只有22.7%的IbHAKs來源于ClusterⅠ和ClusterⅡ。在22個(gè)甘薯IbHAK基因中共發(fā)現(xiàn)3對(duì)片段重復(fù)的同源物(IbHAK1，IbHAK2；IbHAK2，IbHAK13；IbHAK10，IbHAK11)，說明基因復(fù)制是導(dǎo)致甘薯HAK/KUP/KT基因家族擴(kuò)張的主要因素。

KUP/HAK/KT鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族開始于細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)[27]，后續(xù)研究表明此家族僅在植物、真菌和細(xì)菌中存在，在原核生物和動(dòng)物中未曾發(fā)現(xiàn)[28]。IbHAKs基因表達(dá)具有組織特異性，其中IbHAK6，IbHAK8，IbHAK9和IbHAK22在根中超優(yōu)勢表達(dá)，其他組織表達(dá)量很低，這與其大豆GmHAK30[14]和擬南芥AtHAK5基因[29]的表達(dá)模式一致。此外前人研究表明KUP/HAK/KT基因廣泛參與植物多種逆境脅迫的響應(yīng)[30]。其中，擬南芥AtHAK5、AtKUP4和AtKUP11等多個(gè)基因在植物受到鹽脅迫中高度表達(dá)[31]；水稻OsHAK5基因在煙草中的過表達(dá)，可以通過提高K+在地下部分到地上部分的運(yùn)輸能力，進(jìn)一步提高耐鹽性[32]；蘆葦PhaHAK2基因在耐鹽材料和對(duì)照中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)存在明顯差異[33]。在生長激素的處理下，水稻OsHAK5的K+/H+協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)活性得到了顯著提升[34]。本研究通過對(duì)‘徐薯18’干旱、鹽、冷、水楊酸、脫落酸和茉莉酸甲酯脅迫下的表達(dá)模式分析表明，IbHAKs基因在甘薯中存在組織表達(dá)特異性，同時(shí)在逆境脅迫下也有表達(dá)量的變化，說明了IbHAKs積極參與甘薯的生育進(jìn)程以及和在逆境脅迫下的響應(yīng)。

4 結(jié) 論

甘薯全基因組共鑒定到22個(gè)IbHAK基因，全部定位于質(zhì)膜上，系統(tǒng)進(jìn)化將其分為4個(gè)進(jìn)化簇，22個(gè)IbHAK基因定位在11條染色體上。各成員均含有調(diào)控植物生長發(fā)育、光響應(yīng)、逆境響應(yīng)和激素響應(yīng)等相關(guān)元件，并在不同組織和逆境脅迫下表現(xiàn)出特異性。這為進(jìn)一步分析甘薯KUP/HAK/KT基因功能提供了生物學(xué)依據(jù)。