甘藍(lán)型油菜BnPHL12基因克隆及功能分析

李 兵，劉志全，王璐琳，胡建軍，唐銘霞，戴 成，王克秀，馬朝芝

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，成都 610066；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070； 3. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，長(zhǎng)沙 410125)

【研究意義】甘藍(lán)型油菜是世界上重要的油料作物，在食品安全中具有重要作用。隨著油菜人工選育進(jìn)程的推進(jìn)，甘藍(lán)型油菜的用途越來(lái)越多樣化，在菜籽榨油、菜薹食用、綠化觀(guān)賞以及土壤改良等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。雜交品種的創(chuàng)制有利于將不同親本材料的優(yōu)良性狀聚合并發(fā)揮作物的雜種優(yōu)勢(shì)，對(duì)作物的品質(zhì)改良和產(chǎn)量提高具有重要的作用。我國(guó)油菜種植面積和產(chǎn)量占世界的1/3，油菜雜種優(yōu)勢(shì)的利用可將油菜產(chǎn)量提高20%～30%[1]。雄性不育系(細(xì)胞質(zhì)雄性不育、細(xì)胞核雄性不育、光溫敏雄性不育和化學(xué)殺雄)及自交不親和系等材料的選育和應(yīng)用是油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用的重要途徑[2]。細(xì)胞核雄性不育是雄性不育的主要類(lèi)型之一，由于細(xì)胞核基因控制的雄配子在花發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)異常，導(dǎo)致無(wú)法產(chǎn)生花粉或者花粉活力喪失，這些核不育系具有敗育徹底、無(wú)不良的胞質(zhì)效應(yīng)及廣泛的恢復(fù)系等特點(diǎn)[3]。細(xì)胞質(zhì)雄性不育現(xiàn)象是一種母性遺傳的性狀，受細(xì)胞核基因和細(xì)胞質(zhì)基因的互作調(diào)控，不育系的選育及分子機(jī)制的解析能夠推動(dòng)眾多作物的雜種優(yōu)勢(shì)利用[4]。波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(pol CMS)的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用，推動(dòng)了油菜雜種優(yōu)勢(shì)的快速利用。盡管自然突變是不育系材料篩選的重要途徑，但自然突變頻率低，很難有效獲得不育系材料；隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及功能基因組學(xué)的研究，利用基因工程的方法創(chuàng)建植物雄性不育材料，不僅能夠推動(dòng)作物育種的發(fā)展，也能加速基因功能的解析?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人在育種過(guò)程中，獲得一些具有雄性不育特性的材料，如S45AB、7365AB、pol CMS 等，通過(guò)細(xì)胞學(xué)觀(guān)察、遺傳分析、圖位克隆、遺傳轉(zhuǎn)化、分子生物學(xué)研究等方法，揭示突變體材料雄性不育的分子機(jī)制，并通過(guò)配制雜交組合及遺傳分析，鑒定不育系材料的恢復(fù)系及其恢復(fù)機(jī)制等研究，推動(dòng)油菜雜種優(yōu)勢(shì)的利用[4-8]。擬南芥是雙子葉植物的模式植物，具有完善的基因組信息和豐富的突變體庫(kù)資源，為擬南芥基因功能的解析提供極大的便利?；ㄋ幨切叟咦影l(fā)育的場(chǎng)所，由4個(gè)花粉囊組成，而花粉囊的囊壁由外向內(nèi)分別為表皮層、花藥內(nèi)表皮、中層和絨氈層細(xì)胞以及小孢子母細(xì)胞[9]。Sanders等[10]將擬南芥的花藥發(fā)育分為15個(gè)時(shí)期，為細(xì)胞生物學(xué)方法觀(guān)察花藥發(fā)育過(guò)程奠定了基礎(chǔ)；絨氈層細(xì)胞由雄蕊原基的L2層及L3層分化而來(lái)，在花藥發(fā)育的第10期開(kāi)始以細(xì)胞程序性死亡(Programmed Cell Death, PCD)的方式降解，在第11～12期完全降解。絨氈層細(xì)胞在小孢子的發(fā)育過(guò)程中具有十分重要的作用，主要體現(xiàn)在以下幾方面：①絨氈層細(xì)胞的降解為小孢子發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等[11]；②合成胼胝質(zhì)壁和花粉母細(xì)胞初生壁降解所需要的酶類(lèi)[12]；③促進(jìn)花粉外被的形成[13]。前人研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在絨氈層細(xì)胞的發(fā)育及分化過(guò)程中起重要作用[14]，如DYT1[15]、MYB33/65[16]、TDF1[17]、AMS[18]和 AtMYB103[19-21]等。GAMYB-like的轉(zhuǎn)錄因子MYB33和MYB65在絨氈層細(xì)胞的PCD過(guò)程中功能冗余；myb33myb65雙突變體的花粉在花粉減數(shù)分裂前敗育[16]；在擬南芥ams、ms1、tdf1、dyt1等基因的突變體材料中，絨氈層細(xì)胞的PCD延遲發(fā)生；而在myb80的突變體材料中，絨氈層細(xì)胞的PCD會(huì)提前發(fā)生，這些轉(zhuǎn)錄因子在絨氈層細(xì)胞的PCD過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，絨氈層細(xì)胞的PCD的提前或者延遲都會(huì)導(dǎo)致花粉發(fā)育的異常，最終影響植物的育性[15, 18, 22-24]。MYB-CC轉(zhuǎn)錄因子因其含有MYB結(jié)構(gòu)域和Coiled-Coiled結(jié)構(gòu)域而得名，AtPHR1(PHOSPHORUSSTARVATIONRESPONSE1)是植物中鑒定的第一個(gè)MYB-CC轉(zhuǎn)錄因子，參與擬南芥的磷饑餓脅迫響應(yīng)；在擬南芥中鑒定到14個(gè)與AtPHR1有相似結(jié)構(gòu)的基因[25]，其中AtPHR1，AtPHL1(PHR1-LIKE1)，AtPHL2(PHR1-LIKE2)，AtPHL3(PHR1-LIKE3)，AtPHL4(PHR1-LIKE4)，在磷饑餓脅迫響應(yīng)中功能冗余[26-28]；在水稻、油菜、番茄、玉米等物種中，AtPHR1同源基因也參與磷饑餓脅迫響應(yīng)[29-33]。除此之外，MYB-CC轉(zhuǎn)錄因子TaMYBsm3參與小麥的干旱脅迫響應(yīng)[34]以及OsPHL3參與水稻花期的調(diào)控過(guò)程[35]等生物學(xué)過(guò)程。然而，關(guān)于MYB-CC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花發(fā)育的報(bào)道還較少。【本研究切入點(diǎn)】采用序列比對(duì)及同源克隆的方法，以擬南芥AtPHL12(At3G12730)為參考基因，在甘藍(lán)型油菜“Westar”中克隆其同源基因，進(jìn)行生物信息學(xué)及組織表達(dá)模式的分析，并將BnA01PHL12在甘藍(lán)型油菜和擬南芥中過(guò)量表達(dá)，檢測(cè)在絨氈層細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)BnA01PHL12是否影響轉(zhuǎn)基因植株的花藥發(fā)育。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用序列比對(duì)和同源克隆的方法克隆了甘藍(lán)型油菜BnPHL12的同源基因，并對(duì)其進(jìn)行組織表達(dá)模式的分析，利用基因工程的手段研究其生物學(xué)功能，創(chuàng)建了新的雄性不育材料，為花藥發(fā)育的研究提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的材料為甘藍(lán)型油菜栽培種“Westar”，用于基因克隆和組織表達(dá)模式的分析，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜工程研究中心提供。哥倫比亞型擬南芥(Col)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用實(shí)驗(yàn)室自交繁種保留，用于遺傳轉(zhuǎn)化和擬南芥原生質(zhì)體的提取。所有材料種植在生長(zhǎng)條件為16 h光照，8 h黑暗，22 ℃的恒溫溫室。

1.2 載體和菌株

TA 克隆使用的載體是pMD18-T，菌株是 DH5α。構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，使用的載體為 pMDC83；用于遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌為 GV3101。用于酵母實(shí)驗(yàn)的菌株為AH109，用于雙熒光素酶的載體為pBDGAL4，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用實(shí)驗(yàn)室保留。亞細(xì)胞定位的載體為pM999載體。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

高保真DNA聚合酶PrimerSTAR購(gòu)自Takara公司；T4DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自湖北晶茂生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自上海普洛麥格生物制品有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金生物公司；DNA純化回收試劑盒、質(zhì)?？焯嵩噭┖匈?gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；雙熒光報(bào)告(DLR)系統(tǒng)試劑盒購(gòu)自武漢天源惠達(dá)生物科技有限公司；農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞菌株購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)公司。AH109菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 RNA、DNA提取及cDNA第一條鏈的合成 油菜花蕾、根、莖、葉片組織總RNA抽提均采用Trizol Reagent法。油菜不同發(fā)育時(shí)期的花藥總RNA用promega微量RNA提取試劑盒(https://www.promega.com)提取。取洗脫后的RNA樣品1 μL在Nanodrop2000分光光度計(jì)上檢測(cè)其濃度及純度(1.8

1.4.2BnPHL12同源基因克隆 從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)獲得AtPHL12(At3g12730)的序列信息，并在甘藍(lán)型油菜泛基因組數(shù)據(jù)庫(kù)BnPIR(http://cbi.hzau.edu.cn/bnapus/index.php)“Westar”基因組中進(jìn)行AtPHL12同源基因的序列比對(duì)分析。根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果，獲取BnPHL12同源基因的序列信息，設(shè)計(jì)擴(kuò)增BnPHL12編碼序列的引物(表1)，以 “Westar”花蕾的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物連接到TA克隆載體pMD18-T上，并進(jìn)行測(cè)序分析。將克隆的測(cè)序序列與“Wesatr”基因組中獲得的序列信息進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4.3BnPHL12同源基因的生物信息學(xué)分析及進(jìn)化分析 利用數(shù)據(jù)庫(kù)ExPASy-protParam tool (https://web.expasy.org/protparam)對(duì)AtPHL12及BnPHL12同源基因的分子式、分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成等基本信息進(jìn)行分析。利用PSIPRED Workbench (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)對(duì)BnPHL12的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用SWISS-MODEL(https://www.expasy.org/resources/swiss-model)對(duì)BnPHL12的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用十字花科數(shù)據(jù)庫(kù)BRAD (http://brassicadb.cn)在白菜、甘藍(lán)、擬南芥以及琴葉擬南芥中鑒定BnPHL12的同源基因，提取相關(guān)基因序列。利用MEGA-X軟件中的Clustal W對(duì)AtPHL12及BnPHL12同源基因進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用MEGA-X軟件中的Neighbor-Joining構(gòu)建BnPHL12同源基因(擬南芥、琴葉擬南芥、白菜、甘藍(lán)及甘藍(lán)型油菜)進(jìn)化樹(shù)。

1.4.4 啟動(dòng)子擴(kuò)增及GUS染色分析 根據(jù)“Westar”參考基因組中BnA01PHL12的序列信息，設(shè)計(jì)擴(kuò)增BnA01PHL12啟動(dòng)子的特異引物(表1)。以“Westar”的葉片DNA為模板，進(jìn)行BnA01PHL12啟動(dòng)子的擴(kuò)增，用SalⅠ和BamHⅠ進(jìn)行酶切、回收并連接在pCAMBIA 2300-GUS(用SalⅠ和BamHⅠ雙端酶切)載體上，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥沾花法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的鑒定。在陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因材料的T2代進(jìn)行GUS染色，分別取生長(zhǎng)14 d及開(kāi)花初期的整株轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行GUS染色分析，并將染色樣品放在裝有CCD相機(jī)的體式顯微鏡中照相。

1.4.5 亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄激活/抑制活性分析 根據(jù)BnA01PHL12的序列信息，設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增其全長(zhǎng)的CDS(去除終止子)序列(表1)，利用XbaⅠ進(jìn)行單酶切后連接到已經(jīng)融合了eGFP的pM999載體上，構(gòu)建BnA01PHL12亞細(xì)胞定位的融合表達(dá)載體。使用天根的質(zhì)粒小提中量試劑盒提取用于亞細(xì)胞定位的質(zhì)粒。提取pM999-BnA01PHL12-GFP和pM999-GHD7-RFP質(zhì)粒，將2種質(zhì)粒均以5 μg混合后進(jìn)行擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，室溫黑暗培養(yǎng)12～16 h，用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光觀(guān)察并照相。利用特異引物(表1)擴(kuò)增BnA01PHL12全長(zhǎng)編碼序列片段，用KpnⅠ和XbaⅠ進(jìn)行酶切后連接到pBDGAL4載體上，構(gòu)建GAL4-BnA01PHL12載體。使用天根的質(zhì)粒小提中量試劑盒提取GAL4-BnA01PHL12及pBDGAL4質(zhì)粒。煙草花葉病毒 35S 啟動(dòng)子(CaMV35S)驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子BnA01PHL12表達(dá)，作為效應(yīng)子；煙草花葉病毒35S 的最小啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒火蟲(chóng)LUC(Luciferase)基因表達(dá)，作為報(bào)告子；擬南芥UBIQUITIN3(AtUBI3)基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)海腎RenillaLUC基因載體作為內(nèi)參。按m(報(bào)告子)∶m(效應(yīng)子)∶m(內(nèi)參)=6∶6∶1 的比例進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，每個(gè)轉(zhuǎn)化重復(fù)3次。使用 Promega公司 Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒對(duì)擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行LUC酶活的檢測(cè)。利用特異引物(表1)擴(kuò)增BnA01PHL12全長(zhǎng)編碼序列片段，用NdeⅠ和SalⅠ 酶切后連接到pGBKT7載體上，構(gòu)建BD-BnA01PHL12載體。將融合蛋白BD-BnA01PHL12、AtbZIP1(具有轉(zhuǎn)錄激活活性[36])及pGBKT7(BD分別轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，并將轉(zhuǎn)化液涂布在SD-Trp和SD-Trp/His培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀(guān)察不同轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)狀況，并將培養(yǎng)皿中的酵母斑點(diǎn)轉(zhuǎn)移到濾紙上添加X(jué)-Gal進(jìn)行染色，觀(guān)察酵母菌斑的染色情況。

表1 引物序列

1.4.6BnA01PHL12表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化 利用BnA01PHL12的序列信息，設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增BnA01PHL12的全長(zhǎng)編碼序列(去除終止子，表1)，用PstⅠ和KpnⅠ進(jìn)行酶切并連接到pMDC83-A9-eGFP載體上，該載體用甘藍(lán)型油菜BnA9的847 bp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，構(gòu)建表達(dá)載體pMDC83::A9-BnA01PHL12，并將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中，采用農(nóng)桿菌侵染介導(dǎo)的油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法和擬南芥沾花法，獲得絨氈層細(xì)胞中高量表達(dá)BnA01PHL12的轉(zhuǎn)基因材料，并進(jìn)行陽(yáng)性苗的鑒定及轉(zhuǎn)基因材料花藥發(fā)育情況調(diào)查。

1.4.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析 根據(jù)BnPHL12同源基因的序列信息，設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增BnPHL12不同拷貝的定量檢測(cè)引物(表1)，對(duì)甘藍(lán)型油菜栽培品種“Westar”的不同組織(根、莖、葉、花蕾及不同發(fā)育時(shí)期的花藥)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析，檢測(cè)BnPHL12同源基因的組織表達(dá)模式。利用BnA01PHL12特異的定量檢測(cè)引物分析轉(zhuǎn)基因油菜和擬南芥中BnPHL12的表達(dá)水平。以BnActin7和AtActin2作為油菜和擬南芥定量檢測(cè)的內(nèi)參(表1)。采用2-ΔCt法計(jì)算不同組織中的表達(dá)量，采用2-ΔΔCt法計(jì)算轉(zhuǎn)基因材料的表達(dá)水平，3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BnPHL12的基因克隆

在擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站TAIR中檢索MYB-CC家族轉(zhuǎn)錄因子AtPHL12(At3G12730)，獲取其序列及基因結(jié)構(gòu)信息。將AtPHL12的CDS序列信息在甘藍(lán)型油菜泛基因組BnPIR中“Westar”的基因組進(jìn)行序列比對(duì)，鑒定到4個(gè)與AtPHL12同源的基因：BnaA01T0279200WE、BnaC01T0385100WE、BnaA05T0372000WE和BnaC05T0451700WE。基因結(jié)構(gòu)注釋顯示AtPHL12含有2個(gè)轉(zhuǎn)錄本：AtPHL12.1和AtPHL12.2; 甘藍(lán)型油菜“Westar”基因組注釋的BnaA01T0279200WE、BnaC01T0385100WE也通過(guò)可變剪切產(chǎn)生2個(gè)轉(zhuǎn)錄本，將甘藍(lán)型油菜BnPHL12的同源基因命名為BnA01PHL12.1、BnA01PHL12.2、BnC01PHL12.1、BnC01PHL12.2、BnA05PHL12和BnC05PHL12。根據(jù)“Westar”參考基因組中BnPHL12同源基因的序列信息，設(shè)計(jì)特異引物并對(duì)其編碼序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得700 bp左右的序列(圖1)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，進(jìn)行克隆序列的測(cè)序分析，結(jié)果表明克隆獲得CDS序列與 “Westar”參考基因組中BnPHL12同源基因的序列一致。

M: Maker；A1、C1、A5、C5分別代表BnPHL12同源基因克隆的PCR產(chǎn)物M indicates the maker; A1, C1, A5 and C5 indicate the PCR product of BnPHL12 homologous genes圖1 BnPHL12同源基因的克隆Fig.1 Molecular cloning of BnPHL12 homologous genes in B. napus

2.2 BnPHL12同源基因結(jié)構(gòu)分析

參考“Westar”基因組BnPHL12同源基因的序列信息，繪制BnPHL12同源基因的基因結(jié)構(gòu)示意圖(圖2)。BnA01PHL12與BnC01PHL12基因結(jié)構(gòu)相似；由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子以及非編碼序列組成。核苷酸序列比對(duì)顯示，兩者在基因組上存在26個(gè)SNP的差異，但CDS上僅存在4個(gè)SNP的差異，導(dǎo)致1個(gè)氨基酸的差異(I115-F115)。BnA05PHL12與BnC05PHL12的基因結(jié)構(gòu)差異較大，BnA05PHL12和BnC05PHL12分別由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子及 5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成(圖3)。AtPHL12與BnPHL12同源基因的氨基酸序列比對(duì)及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析顯示，AtPHL12.1與BnA01PHL12.1、BnC01PHL12.1、BnA05PHL12和BnC05PHL12的序列相似性極高，都具有MYB DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Coiled-Coiled結(jié)構(gòu)域，而AtPHL12.2、BnA01PHL12.2及BnC01PHL12.2因可變剪切，導(dǎo)致N端的MYB DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域丟失，而C端的Coiled-Coiled結(jié)構(gòu)域完整。如表2所示，AtPHL12與BnPHL12同源基因的氨基酸序列相似性大于70%，與BnA01PHL12.1氨基酸序列相似性最高，達(dá)到85.17%。BnA01PHL12.1與BnC01PHL12.1的序列相似性高達(dá)99.15%。盡管BnA05PHL12與BnC05PHL12基因結(jié)構(gòu)存在較大差異，但氨基酸的序列相似性為89.18%。

黑色和灰色方框分別表示外顯子和UTR；黑色短線(xiàn)表示內(nèi)含子Black and gray boxes indicate exons and UTR (untranslation region); Black lines indicate the introns圖2 BnPHL12同源基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Genes structure of BnPHL12 homologous genes

AtPHL12通過(guò)可變剪切產(chǎn)生2個(gè)轉(zhuǎn)錄本(AtPHL12.1和AtPHL12.2)。AtPHL12.1編碼的蛋白含有MYB DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和MYB CC 結(jié)構(gòu)域。AtPHL12.2編碼的蛋白缺失部分MYB DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。AtPHL12同源基因BnA01PHL12 和BnC01PHL12也產(chǎn)生兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本。紅色下劃線(xiàn)和綠色下劃線(xiàn)分別代表MYB DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和MYB CC 結(jié)構(gòu)域AtPHL12 could produce two transcripts by alternative splicing (AtPHL12.1and AtPHL12.2). The protein encoded by AtPHL12.1 contains MYB DNA binding domain and MYB CC domain. While the protein encoded by AtPHL12.2 deletes partial MYB DNA-binding domain. BnA01PHL12 and BnC01PHL12 also produce two transcripts. The red and green underline represent the MYB DNA binding domain and the MYB CC domain, respectively圖3 擬南芥AtPHL12與甘藍(lán)型油菜BnPHL12同源基因氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Animo acid sequence alignment between homologous genes of BnPHL12 and AtPHL12

表2 擬南芥AtPHL12與甘藍(lán)型油菜BnPHL12同源基因氨基酸序列相似性統(tǒng)計(jì)

2.3 BnPHL12同源基因的理化性質(zhì)分析

利用ExPASy-protParam tool對(duì)AtPHL12及BnPHL12同源基因的理化性質(zhì)(gDNA、CDS、氨基酸數(shù)目、分子式、分子量、等電點(diǎn)等)進(jìn)行預(yù)測(cè)(表3)。利用PSIPRED Workbench 對(duì)BnPHL12的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(表4)，統(tǒng)計(jì)BnPHL12同源基因中α-螺旋(H)、β-折疊 (E)、無(wú)規(guī)則卷曲 (C) 組成情況，BnPHL12主要以α-螺旋(H)和無(wú)規(guī)則卷曲 (C)組成，僅個(gè)別基因的編碼蛋白有極少數(shù)的β-折疊 (E)。利用SWIDD-MODEL 對(duì)BnPHL12的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖4)，BnPHL12蛋白與水稻的磷饑餓響應(yīng)基因(OsPHR2)模型7e40.2.A蛋白一致性為41.22%，由空間立體結(jié)構(gòu)可知，AtPHL12和BnPHL12主要由α-螺旋(H)和無(wú)規(guī)則卷曲 (C)組成。

a. AtPHL12的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(UniProt)；b. BnA01PHL12蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(SWIDD-MODEL)a. Protein structure prediction of AtPHL12 (UniPort).b. Protein structure prediction of BnA01PHL12 (SWIDD-MODEL)圖4 PHL12三維蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Three dimensional protein structure prediction of PHL12

表3 BnPHL12同源基因基本信息統(tǒng)計(jì)

2.4 BnPHL12同源基因進(jìn)化樹(shù)分析

利用十字花科數(shù)據(jù)庫(kù)BRAD，在白菜、甘藍(lán)、擬南芥以及琴葉擬南芥中比對(duì)BnPHL12的同源基因，在白菜中鑒定到2個(gè)BnPHL12同源基因：BraA01t04110Z和BraA05t22477Z;在甘藍(lán)中鑒定到2個(gè)BnPHL12同源基因：BolC01g050170.2J和BolC05g053970.2J；擬南芥和琴葉擬南芥的同源基因分別為At3g12730和AL3G24410。如圖5所示，BnA01PHL12和BnC01PHL12與At3G12730和AL3G24410親緣關(guān)系更近，分別來(lái)源于白菜的BraA01t04110Z和BolC01g050170.2J，而B(niǎo)nA05PHL12和BnC05PHL12親緣關(guān)系更近，分別來(lái)源于白菜的BraA05t22477Z和甘藍(lán)的BolC05g053970.2J。

甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)、擬南芥和琴葉擬南芥中BnPHL12同源基因的進(jìn)化樹(shù)分析，采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，樹(shù)枝上的數(shù)值代表1000次重復(fù)產(chǎn)生的自展值Phylogenetic tree of BnPHL12 homologous gene in B.napus, B.rapa, B.oleracea, Arabidopsis thaliana and Arabidopsis lyrata. The values on the branches represents bootstrap value. Phylogenetic trees are constructed using the neighbor-joining method. Bootstrap values from 1000 replicates are shown圖5 甘藍(lán)型油菜BnPHL12同源基因進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of BnPHL12 homologus genes

2.5 BnPHL12同源基因表達(dá)模式分析

為了了解BnPHL12同源基因在甘藍(lán)型油菜中的表達(dá)模式，在“Westar”的不同組織中檢測(cè)其表達(dá)水平。如圖6-a所示，BnA01PHL12和BnC01PHL12具有相似的表達(dá)模式，在“Westar”的根、莖、葉、花蕾中均有表達(dá)，葉片中表達(dá)水平最高。而B(niǎo)nA05PHL12和BnC05PHL12在根、莖、葉、花蕾等各個(gè)組織中的表達(dá)水平相對(duì)較低。為了進(jìn)一步了解BnPHL12同源基因在花藥不同發(fā)育階段中的表達(dá)模式，分別檢測(cè)0～1 mm的花蕾、1～2、2～4、4～6、6～7及>7 mm花藥組織中的表達(dá)水平；如圖6-b所示，花藥發(fā)育早期，BnPHL12同源基因均有較高的表達(dá)水平；隨著花藥發(fā)育，其表達(dá)水平逐漸降低；花藥發(fā)育中后期，其表達(dá)水平逐漸提高，其中BnA01PHL12和BnC01PHL12表達(dá)水平升高顯著，而B(niǎo)nA05PHL12和BnC05PHL12的表達(dá)水平變化不顯著。為了進(jìn)一步了解BnPHL12在植物組織中的表達(dá)模式，克隆BnA01PHL12啟動(dòng)子，融合到GUS報(bào)告載體上并侵染擬南芥。如圖6-c所示，在T2代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉等營(yíng)養(yǎng)器官和花蕾中均檢測(cè)到明顯的GUS染色，在葉片中GUS染色最強(qiáng)，其結(jié)果與“Westar”各組織中的表達(dá)結(jié)果一致。

a. “Westar” 根、莖、葉、成熟花蕾中BnPHL12同源基因的相對(duì)表達(dá)分析;b. “Westar”不同發(fā)育階段的花藥中BnPHL12同源基因的相對(duì)表達(dá)分析;c. BnA01PHL12的1.5 kb啟動(dòng)子在擬南芥中的GUS染色結(jié)果;d. BnA01PHL12在擬南芥原生質(zhì)中的亞細(xì)胞定位a. Relative expression analysis of BnPHL12 homologous genes in roots, stems, leaves and mature flower buds of ‘Westar’; b. Relative expression of BnPHL12 homolog genes in anthers of ‘Westar’ at different developmental stages;c. GUS staining of BnA01PHL12 promoter in Arabidopsis thaliana;d. BnA01PHL12 subcellular localization in the Arabidopsis thaliana protoplast by co-transfection assay圖6 BnPHL12同源基因的組織表達(dá)模式分析及亞細(xì)胞定位Fig.6 Tissue expression analysis and subcellular localization of BnPHL12 homologous genes

2.6 BnA01PHL12亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄活性分析

為了確定BnA01PHL12是否具有轉(zhuǎn)錄因子核定位信號(hào)特征，將BnA01PHL12與pM999-GFP融合質(zhì)粒與已知具有核定位的Marker基因GHD7[37](pM999-GHD7-RFP)共同轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞，并用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察其亞細(xì)胞定位情況。如圖6-d所示，BnA01PHL12-GFP和GHD7-RFP共同定位在擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞的細(xì)胞核中，表明BnA01PHL12是一個(gè)定位在細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄因子。將BnA01PHL12的全長(zhǎng)CDS與pGBKT7載體融合，將融合蛋白BD-BnA01PHL12、BD-AtbZIP1 (具有轉(zhuǎn)錄激活活性)[36]及pGBKT7(BD)分別轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，并將轉(zhuǎn)化液分別涂布在SD-Trp和SD-Trp/His培養(yǎng)基上，觀(guān)察不同轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)狀況。如圖7-a所示，陽(yáng)性對(duì)照BD-AtbZIP1和BD-BnA01PHL12的轉(zhuǎn)化子在SD-Trp和SD-Trp/His培養(yǎng)基中均正常生長(zhǎng)；而陰性對(duì)照BD的轉(zhuǎn)化子只在SD-Trp的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，而在SD-Trp/His培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到抑制。利用X-Gal對(duì)酵母菌斑進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)僅BD-AtbZIP1和BD-BnA01PHL12菌株可以被染成藍(lán)色，表明AtbZIP1和BnA01PHL12可以激活報(bào)告基因lacZ表達(dá)，該結(jié)果表明BnA01PHL12具有轉(zhuǎn)錄激活活性。同時(shí)，采用雙熒光報(bào)告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter，DLR)進(jìn)行BnA01PHL12轉(zhuǎn)錄活性分析。如圖7-c所示，與對(duì)照相比，pGAL4BD-BnA01PHL12與報(bào)告子結(jié)合，使Luc酶活性提高7.5倍，進(jìn)一步表明BnA01PHL12具有轉(zhuǎn)錄激活活性。以上結(jié)果表明，BnA01PHL12是一個(gè)定位在細(xì)胞核中且具有轉(zhuǎn)錄激活活性的MYB-CC轉(zhuǎn)錄因子。

a. BD-BnA01PHL12、BD-AtbZIP1和BD轉(zhuǎn)化AH109后在SD/-Trp和SD/-Trp-His培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況;b.DLR系統(tǒng)中效應(yīng)子和報(bào)告子載體構(gòu)建示意圖;c. DLR系統(tǒng)檢測(cè)BnA01PHL12轉(zhuǎn)錄活性， LUC相對(duì)酶活性代表BnA01PHL12的轉(zhuǎn)錄活性，GAL4BD的LUC相對(duì)酶活性作為對(duì)照a. Growth status of AH109 transformed by BD-BnA01PHL12, BD-AtbZIP and BD on SD/-Trp and SD/-Trp-His media; b.Schematic diagram of effector and reporter vector construction in DLR system; c. BnA01PHL12 transcription activity was detected in DLR system and indicated by relative LUC activity in DLR system, the value of GALBD effector was used as negative control圖7 BnA01PHL12轉(zhuǎn)錄激活/抑制活性分析Fig.7 Transcriptional activation/repression analysis of BnA01PHL12

2.7 BnA01PHL12過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致甘藍(lán)型油菜和擬南芥的雄性不育

本研究利用BnA9基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)BnA01PHL12在花藥絨氈層中表達(dá)，研究BnA01PHL12是否參與花藥的發(fā)育調(diào)控過(guò)程。構(gòu)建BnA01PHL12過(guò)量表達(dá)的融合載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將融合片段分別轉(zhuǎn)入“Westar”和擬南芥(Col)中，并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鑒定。在甘藍(lán)型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化中，共獲得56株材料，其中52株為陽(yáng)性單株，陽(yáng)性率達(dá)92.8%，將這些轉(zhuǎn)基因材料種植于轉(zhuǎn)基因材料種植基地，開(kāi)花期調(diào)查顯示35株陽(yáng)性植株表現(xiàn)為雄性不育。如圖8-a～圖8-e所示，在花藥發(fā)育的早期和中期，轉(zhuǎn)基因不育株花蕾的大小及外觀(guān)與野生型植株沒(méi)有明顯差異；在花藥成熟及開(kāi)裂時(shí)，轉(zhuǎn)基因不育植株則表現(xiàn)為花絲不伸長(zhǎng)、花藥干癟、不能產(chǎn)生花粉且不育植株的角果不能伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，顯現(xiàn)出雄性不育的特性。將野生型花粉與不育植株雜交，將雜交后代種植并進(jìn)行陽(yáng)性鑒定和表達(dá)水平檢測(cè)。在雜交種的后代中鑒定出大量的雄性不育植株；以上結(jié)果表明，利用絨氈層特異表達(dá)基因BnA9的啟動(dòng)子過(guò)量表達(dá)BnA01PHL12，導(dǎo)致的雄性不育性狀可以穩(wěn)定遺傳。qRT-PCR結(jié)果表明，不育植株(OE-1 和OE-2)的BnA01PHL12表達(dá)水平極顯著高于野生型材料；而在某些陽(yáng)性植株中，BnA01PHL12的表達(dá)水平雖然提高了(OE-3和OE-4)，但不能導(dǎo)致雄性不育(圖9-a)。同時(shí)，將BnA01PHL12的融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，獲得7株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株；轉(zhuǎn)基因植株在苗期和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期與野生型植株沒(méi)有明顯差異；在開(kāi)花期，轉(zhuǎn)基因植株均不能產(chǎn)生花藥，角果不能正常伸長(zhǎng)，為徹底的雄性不育表型(圖8-f～圖8-i)；qRT-PCR檢測(cè)表明，不育植株中BnA01PHL12的表達(dá)水平顯著提高(圖9-b)。以上結(jié)果說(shuō)明，利用絨氈層特異表達(dá)基因BnA9的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)BnA01PHL12在花藥絨氈層中過(guò)量表達(dá)，影響花藥的正常發(fā)育，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜和擬南芥的雄性不育表型。

a～e：油菜轉(zhuǎn)基因材料雄性不育表型；f～i：擬南芥轉(zhuǎn)基因材料雄性不育表型a-e indicated the male sterility phenotype in transgenic line of B. napus. f-i indicated the male sterility in Arabidopsis thaliana 圖8 野生型和過(guò)表達(dá)BnA01PHL12植株雄性不育表型調(diào)查Fig.8 Investigation of male sterility phenotypes of wild-type and overexpressed BnA01PHL12 plants

a.轉(zhuǎn)基因油菜中BnA01PHL12表達(dá)水平檢測(cè); b.轉(zhuǎn)基因擬南芥中BnA01PHL12表達(dá)水平檢測(cè)a. Relative expression level of BnA01PHL12 in B. napus; b. Relative expression level of BnA01PHL12 in Arabidopsis thaliana 圖9 轉(zhuǎn)基因材料中BnA01PHL12的表達(dá)水平Fig.9 Relative expression level of BnA01PHL12 in transgenic plants

3 討 論

本研究根據(jù)MYB-CC家族轉(zhuǎn)錄因子AtPHL12的序列信息，采用序列比對(duì)和同源克隆的方法在甘藍(lán)型油菜“Westar”中克隆到4個(gè)BnPHL12的同源基因：BnA01PHL12、BnC01PHL12、BnA05PHL12和BnC05PHL12，TA克隆BnPHL12同源基因的測(cè)序序列與甘藍(lán)型油菜泛基因組BnPIR提供的序列信息一致，表明“Westar”參考基因組信息的開(kāi)放為甘藍(lán)型油菜基因克隆及功能驗(yàn)證奠定了良好的基礎(chǔ)，加速了甘藍(lán)型油菜基因功能的解析。利用十字花科數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站BRAD，獲得不同物種BnPHL12同源基因的序列信息并進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，BnA01PHL12、BnA05PHL12、BnC01PHL12和BnC05PHL12分別來(lái)源于白菜的BraA01t04110Z和BraA05t22477Z及甘藍(lán)的BolC01g050170.2J和BolC05g053970.2J，BnA01PHL12、BnC01PHL12與擬南芥的AtPHL12具有更近的親緣關(guān)系。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，BnPHL12同源基因的編碼蛋白均含有保守的MYB DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Coiled-Coiled結(jié)構(gòu)域。前人研究[26-28]表明，擬南芥中存在15個(gè)MYB-CC家族轉(zhuǎn)錄因子，該家族基因的編碼蛋白均含有MYB DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Coiled-Coiled結(jié)構(gòu)域，其中AtPHR1、AtPHL1、AtPHL2、AtPHL3、AtPHL4等基因以功能冗余的方式參與擬南芥的磷饑餓脅迫過(guò)程，當(dāng)土壤環(huán)境中出現(xiàn)缺磷或低磷脅迫時(shí)，AtPHR1及AtPHR1-Like基因快速?gòu)霓D(zhuǎn)錄水平上對(duì)磷饑餓脅迫作出響應(yīng)，并通過(guò)其MYB DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域靶向磷饑餓脅迫響應(yīng)基因啟動(dòng)子的順式作用原件P1BS(GNATATNC)，激活靶基因表達(dá)，進(jìn)而維持植物的正常生命活動(dòng)。因此，推測(cè)BnPHL12的同源基因可能存在某些相似的基因功能，可能參與甘藍(lán)型油菜的磷饑餓脅迫等生物學(xué)過(guò)程。近期研究[39]表明，生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF7和ARF19通過(guò)生長(zhǎng)素信號(hào)正向調(diào)控PHR1的表達(dá)，影響側(cè)根的發(fā)育，進(jìn)而響應(yīng)磷脅迫。MYC-CC家族的其他轉(zhuǎn)錄因子 (AtPHL1、AtPHL3、AtPHL12等)的啟動(dòng)子上也含有生長(zhǎng)素響應(yīng)的順式原件AuxRE，ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ARF7和ARF19靶向MYB-CC家族的轉(zhuǎn)錄因子，推測(cè)BnPHL12也可能受生長(zhǎng)素響應(yīng)，參與磷脅迫響應(yīng)。

表達(dá)水平是一個(gè)基因行使正常功能的基礎(chǔ)，組織表達(dá)模式的研究將促進(jìn)基因功能的解析。根據(jù)基因的表達(dá)模式，可以分為組成型表達(dá)、誘導(dǎo)型表達(dá)以及組織特異性表達(dá)，基因的組織表達(dá)模式與基因啟動(dòng)子密切相關(guān)，據(jù)此將啟動(dòng)子類(lèi)型分為組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)性啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子。 組成型啟動(dòng)子，如煙草花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子[40]，玉米的泛素基因(Ubiquitin)啟動(dòng)子[41]；誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，如與鹽誘導(dǎo)相關(guān)的甜菜堿合成相關(guān)基因BADH啟動(dòng)子[42]，與低溫誘導(dǎo)相關(guān)的rd29A啟動(dòng)子[43]；組織特異性啟動(dòng)子，如根特異表達(dá)啟動(dòng)子AtPyk10[44]，種子特異表達(dá)基因Napin啟動(dòng)子[45]，花藥特異表達(dá)基因(SlLat52[46]、A9[38]、SCR[47])啟動(dòng)子，這些不同類(lèi)型啟動(dòng)子的鑒定及應(yīng)用促進(jìn)了基因功能的解析。前人利用花藥絨氈層特異表達(dá)基因BnA9的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)半胱氨酸蛋白酶BnaC.CP20.1以及單酰基甘油酯酶BnaC.MAGL8.b，在擬南芥中異位表達(dá)這些基因，破壞了絨氈層的正常功能，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥雄性不育現(xiàn)象的產(chǎn)生[48-49]。在本研究中，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及GUS染色等方法對(duì)BnPHL12同源基因進(jìn)行組織表達(dá)模式分析，結(jié)果表明BnPHL12同源基因在根、莖、葉、花蕾及花藥中均有表達(dá)，推測(cè)BnPHL12同源基因可能在植物的多個(gè)組織中行使功能，但目前對(duì)BnPHL12基因的功能研究較少。PHOSPHATESTARVATIONRESPONSE1(PHR1)是磷饑餓脅迫響應(yīng)過(guò)程的一個(gè)關(guān)鍵基因，可特異性結(jié)合到磷饑餓響應(yīng)基因的啟動(dòng)子上調(diào)控磷脅迫響應(yīng)[25]。MYB-CC家族的進(jìn)化分析顯示，AtPHL12與AtAPL(At1g79430)具有更近的親緣關(guān)系，可能參與到微管組織的發(fā)育過(guò)程[50]。在花藥發(fā)育的不同時(shí)期檢測(cè)BnPHL12同源基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明BnA01PHL12和BnC01PHL12具有相似的表達(dá)模式，在花藥發(fā)育的早期和晚期有相對(duì)較高的表達(dá)水平，而B(niǎo)nA05PHL12和BnC05PHL12在花藥發(fā)育的早期表達(dá)水平較高，而在花藥發(fā)育后期表達(dá)水平較低，推測(cè)BnPHL12同源基因可能參與花藥的發(fā)育調(diào)控過(guò)程。前人在分析甘藍(lán)型油菜半胱氨酸蛋白酶在花藥中的表達(dá)情況，鑒定出2個(gè)基因(BnCP21和BnCP13)僅在可育材料中表達(dá)，而2個(gè)基因(BnCP1和BnCP20)僅在不育材料中表達(dá)。利用絨氈層特異表達(dá)啟動(dòng)子BnA9在擬南芥中異位表達(dá)BnCP20和BnCP13，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥雄性不育現(xiàn)象的產(chǎn)生[3]。同樣，利用BnA9啟動(dòng)子在絨氈層中表達(dá)BnaC.MAGL8.b基因，在花藥發(fā)育的后期(第13期)，花粉粒無(wú)法從花藥中釋放，也導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥產(chǎn)生雄性不育[51]。在本研究中，基于BnA01PHL12的表達(dá)模式及在花藥中的表達(dá)水平，利用BnA9啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子BnA01PHL12在轉(zhuǎn)基因油菜“Westar”和擬南芥(Col)中表達(dá)，均獲得了雄性不育材料，且其不育特性可穩(wěn)定遺傳，但在絨氈層細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)BnA01PHL12導(dǎo)致雄性不育的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。轉(zhuǎn)錄因子在花藥的發(fā)育過(guò)程中具有重要的作用，AMS和DYT1是bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子，TDF1、MS188(AtMYB80/MYB103)是R2R3型的MYB轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子位于同一條信號(hào)通路中，有如下的上下游關(guān)系：DYT1、TDF1、AMS、MYB103/MS188。DYT1可結(jié)合到TDF1的啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)控下游的AMS表達(dá)，而AMS可控制大量花粉壁形成相關(guān)基因的表達(dá)，包括胼胝質(zhì)、脂肪酸延長(zhǎng)、酚類(lèi)化合物的合成以及脂類(lèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)萚52]，MS188/MYB103參與絨氈層發(fā)育和花粉外壁的形成，突變?cè)摶蛑苯訉?dǎo)致胼胝質(zhì)無(wú)法降解，總之，這些轉(zhuǎn)錄因子可參與絨氈層 PCD 過(guò)程和花粉壁的形成，突變這些基因均可導(dǎo)致絨氈層的液泡化和花粉壁結(jié)構(gòu)的異常，導(dǎo)致雄性不育的產(chǎn)生[53]。轉(zhuǎn)錄激活/抑制活性分析及亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，BnA01PHL12具有轉(zhuǎn)錄激活活性且定位在細(xì)胞核中，是MYB-CC類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄因子。MYB-CC轉(zhuǎn)錄因子含有MYB 結(jié)構(gòu)域和Coiled-Coiled結(jié)構(gòu)域，兩分子的MYB結(jié)構(gòu)域可特異性結(jié)合靶基因順式元件P1BS(GNATATNC)，而Coiled-Coiled結(jié)構(gòu)域在蛋白的二聚體形成中起重要作用[25, 54]，推測(cè)BnA01PHL12可能形成同源二聚體或與其他轉(zhuǎn)錄因子形成異源二聚體，參與植物的花藥發(fā)育過(guò)程。本研究中，利用基因工程的方法，在絨氈層發(fā)育過(guò)程中過(guò)量表達(dá)BnA01PHL12，影響了絨氈層發(fā)育或降解等相關(guān)基因的正常表達(dá)，最終導(dǎo)致雄性不育的產(chǎn)生，但MYB-CC家族的轉(zhuǎn)錄因子BnA01PHL12如何參與花藥發(fā)育及影響雄性不育有待進(jìn)一步的分析。

4 結(jié) 論

擬南芥MYB-CC家族的轉(zhuǎn)錄因子AtPHL12(At3g12730)在甘藍(lán)型油菜中存在4個(gè)同源基因，這些基因均含有MYB DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Coiled-Coiled結(jié)構(gòu)域，屬于甘藍(lán)型油菜MYB-CC家族的重要成員；BnA01PHL12是一個(gè)定位在細(xì)胞核且具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子，在營(yíng)養(yǎng)器官(根、莖、葉)以及生殖器官(花蕾、花藥)中均有表達(dá)，通過(guò)在絨氈層細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)BnA01PHL12，創(chuàng)建了油菜和擬南芥新的雄性不育材料，為花藥發(fā)育和雄性不育的研究提供了良好的基礎(chǔ)。