宰后成熟期間結構蛋白對秦川牛肉嫩度的影響

馬旭華，楊 波，李亞蕾，羅瑞明，張杏亞，張 萌

（寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

作為一種低脂肪、高蛋白的食品，牛肉深受消費者喜愛。其中，嫩度是影響消費者滿意度和接受度的主要因素，也是衡量牛肉食用品質的關鍵指標之一。因此，國內外對肉嫩度變化機理的研究一直沒有停止。綜合學者的研究成果，可總結出影響嫩度形成的4 個主要機理：一是肌原纖維蛋白的碎裂或蛋白質結構發(fā)生改變導致Z線弱化；二是通過蛋白酶（鈣蛋白酶、組織蛋白酶）和蛋白酶體裂解蛋白質引發(fā)嫩度變化；三是糖酵解酶在宰后調節(jié)嫩度；四是細胞凋亡和熱休克蛋白參與嫩度形成。

蛋白質組學是指研究一個組織或細胞的所有蛋白質。蛋白質組學起初是用于人體醫(yī)學檢測，隨著技術的發(fā)展，逐漸應用到食品學科中，為研究食品深層變化機理提供了新的方法。此技術不用同位素標記，通過液相色譜-質譜聯(lián)用，分析蛋白質酶解后肽段的信號強度，進而對蛋白質定性定量。在3D蛋白質組學技術中主要從3 個維度（離子強度、質荷比和保留時間）檢測蛋白質，4D-非標記定量（4D-label free quantification，4D-LFQ）蛋白質組學技術則是在3D分離技術基礎上增加了參數離子淌度，其主要根據離子的截面及形狀進行分離，為測定秦川牛肉組織這種復雜體系樣本帶來了更多的可能。李升升利用同位素相對標記和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術研究牦牛平滑肌貯藏過程嫩度的變化機理，結果表明ADP/ATP轉位酶1、鈣蛋白酶抑素、原肌球蛋白-3鏈、細胞色素b-c1復合物亞基1等蛋白可能是牦牛平滑肌貯藏期嫩度變化的指示蛋白。Sawdy等研究表明牛背長肌貯藏7 d后嫩度的變化與肌球蛋白重鏈斷裂有關，結果顯示，在肌肉嫩化過程中，肌球蛋白輕鏈1、2和重鏈1的表達量明顯降低。Alessandro等研究發(fā)現(xiàn)在肉成熟過程中肌動蛋白顯著降解，產生了31 kDa條帶。

本研究主要采用4D-LFQ蛋白質組學技術篩選差異蛋白質，在貯藏0～8 d對秦川牛背最長肌的蛋白質組分進行檢測，分析其涉及的信號通路，探索秦川牛宰后結構蛋白降解對嫩化機制的影響，以更加深入地研究剪切力、肌原纖維小片化指數（myofibrillar fragmentation index，MFI）、肌肉總可溶性蛋白、肌原纖維蛋白、肌漿蛋白的變化機理。實驗選用秦川黃牛背最長肌作為研究對象，秦川黃牛作為陜甘寧地區(qū)優(yōu)勢特色畜種，肉質細膩、瘦肉比例高、大理石紋路明顯，其背最長肌可做成高檔牛排。利用4D-LFQ蛋白質組學技術研究其嫩度變化機理，有望為秦川牛肉工業(yè)加工中對嫩度的控制提供相應的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

25 月齡秦川公牛由甘肅省平涼市涇川縣旭康食品有限責任公司提供。

三乙基碳酸氫銨、尿素、碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇美國Sigma公司；三氟乙酸 美國Sigma-Aldrich公司；胰酶 美國Promega公司；蛋白酶抑制劑 德國Calbiochem公司；乙腈 美國Fisher Chemical公司；甲酸 瑞士Fluka公司；聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒 上海碧云天公司；2X還原性Losding Buffer、考馬斯亮藍G-250、考馬斯亮藍R-250、牛血清白蛋白 中國上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

NAI-CS150超聲波細胞破碎機 上海那艾精密儀器有限公司；205便捷式pH計 德國德圖集團；MiniVac Alpha冷凍離心機 美國Scan Speed公司；timsTOF Pro質譜儀 德國Bruker公司；Forma 994-80 ℃超低溫冰箱 美國Thermo公司；TA-XT plus質構儀 英國Stable Micro Systems公司；Power Pac基礎電泳儀 美國伯樂公司；c150凝膠成像儀 美國Azure Biosystems公司；JXFSTPRP-CL冷凍研磨儀 杭州優(yōu)嘉科學儀器有限公司；UV-1200紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采樣對象選用3 頭自然放養(yǎng)、發(fā)育正常、健康無病、體質量相近、25 月齡左右的秦川公牛。用體積分數75%乙醇溶液對采樣所需刀具、鑷子等工具進行消殺處理。屠宰后的秦川公牛對胴體修整后，用去離子水沖洗，取3 頭牛的左胴體背最長肌，每個背最長肌樣品平均分割成3 份，共計9 個樣品。樣品分割成塊后用透氣性為23.5 g/（m·d）的聚乙烯薄膜密封，貯存于0～4 ℃的冰箱中。待貯存時間為0、2、4、6、8 d時立即置入液氮中2 h，然后放入-80 ℃低溫冰箱中保存，待檢測分析使用。

1.3.2 秦川牛背最長肌剪切力測定

參考李桂霞等的方法稍作修改。取規(guī)格約3 cm×6 cm×6 cm肉塊除去表面的脂肪和筋膜，將肉樣置于蒸煮袋內，抽去袋內空氣，使肉塊表面緊貼蒸煮袋，肉塊中插入熱電偶溫度計，密封袋口，置于水浴鍋在80 ℃下加熱至中心溫度為70 ℃后立即取出，冷卻至室溫，將肉樣沿肌纖維方向用直徑1.27 cm采樣器平行取4 個肉柱，然后用質構儀V型活動剪切刀架垂直于肌纖維方向測定其剪切力，剪切速率1.5 mm/s，剪切距離40 mm，測定4 次取平均值。

1.3.3 秦川牛背最長肌蛋白質溶解度測定

選取宰后貯藏0、2、4、6、8 d的秦川牛背最長肌樣品，參考Joo等的方法提取總可溶性蛋白和肌漿蛋白，參考李升升的方法提取肌原纖維蛋白，并采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，即為溶解度。

參考焦?jié)崱radford等的方法，以牛血清白蛋白作標準曲線，595 nm波長處測其吸光度，通過Origin軟件線性擬合可得方程＝5.767 6-0.018 2（＝0.996 1）（為吸光度；為蛋白質含量/（mg/g））。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳分析

根據黃峰的方法稍作修改。制備5%（質量分數，下同）的濃縮膠和12%的分離膠，將1.3.3節(jié)所得總可溶性蛋白溶液統(tǒng)一調至質量濃度1.00 mg/mL，加入7.5 μL樣品緩沖液（2×還原性Loading Buffer）和15 μL蛋白質溶液樣品于小離心管中混勻，煮沸加熱5 min，室溫冷卻后加入到上樣孔中。加入10 μL蛋白Marker（10～250 kDa）。濃縮膠電流設置為15 mA，待溴酚藍指示條帶遷移至分離膠與濃縮膠分割線處調整電流為25 mA，蛋白Marker不同條帶均分離后關閉電源，電泳完成。小心取出凝膠置于培養(yǎng)皿中，加入考馬斯亮藍R-250，50 r/min搖床染色1 h后脫色，脫色劑更換3～5 次，每30 min更換1 次。脫色完成后置于凝膠成像儀中成像。

1.3.5 MFI測定

參考Culler等的方法，采用考馬斯亮藍法測蛋白質量濃度。用MFI緩沖液將蛋白溶液稀釋至質量濃度0.5 mg/mL，在595 nm波長處測定吸光度，每個樣品重復3 次，取平均值帶入下式計算MFI。

式中：為MFI；為。

1.3.6 4D-LFQ蛋白質組學技術檢測蛋白質含量

參照張杏亞等的方法提取蛋白質并測定蛋白質含量，參照羅輝等的方法進行數據庫搜索、生物信息學分析篩選差異蛋白質，利用京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG）數據庫（http://www.genome.jp/kegg/）檢索代謝途徑，并利用String 10.0（http://string-db.org/）和Cytoscape 3.6.1軟件繪制差異蛋相互作用網絡圖。

1.4 數據處理與分析

數據均以平均值±標準差表示，運用SPSS 24軟件進行單因素方差分析和Duncan檢驗，確定數據間是否具有差異顯著性，＜0.05為差異顯著，＜0.01為差異極顯著，利用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏時間秦川牛背最長肌剪切力的變化

肉的嫩度直接影響其食用時的口感，故嫩度是牛肉的重要品質指標之一。在研究中常用剪切力來反映肉的嫩度情況。

由圖1可知，0～8 d貯藏期剪切力總體呈先上升后下降的變化趨勢，且上升的幅度小于下降的幅度。牛肉在貯藏0 d時的剪切力為（120.25±5.15）N，0～4 d時呈現(xiàn)上升趨勢，4 d時最高，剪切力為（157.94±2.53）N；4 d后呈現(xiàn)下降趨勢，8 d時達到整個貯藏期的最低點，剪切力為（93.41±5.08）N。馬秀利在研究牛肉品質變化時剪切力也出現(xiàn)相似的變化趨勢。

圖1 秦川牛背最長肌不同貯藏時間剪切力變化Fig. 1 Changes in shear force of Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle at different storage times

2.2 不同貯藏時間秦川牛背最長肌總可溶性蛋白含量的變化

由圖2可知，0～8 d貯藏期總可溶性蛋白含量呈顯著下降趨勢（＜0.05）。貯藏0 d時含量為（196.44±2.10）mg/g，貯藏8 d時總可溶性蛋白含量達到整個過程的最低點（（128.47±0.87）mg/g），總體下降了34.60%。這一結果表明秦川牛肉貯藏期蛋白質變化較為明顯，宰后貯藏過程中肌肉組織進行代謝，氨基酸側鏈基團的氧化修飾程度高導致蛋白質構象的變化加劇，從而使蛋白質分子內暴露更多的疏水基團，表面疏水性不斷增加。同時由于游離巰基易氧化轉化為二硫鍵，導致蛋白質大量聚集和沉淀，使肌肉組織蛋白發(fā)生降解。

圖2 秦川牛背最長肌貯藏過程中總可溶性蛋白的含量變化Fig. 2 Changes in total soluble protein content of Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during storage

根據秦川牛背最長肌蛋白分子質量選擇蛋白Marker指示范圍（10～250 kDa），共有10 條條帶。電泳前在每個凹糟中加入等質量濃度的溶液，保證有且僅有蛋白降解變化影響條帶的顏色和寬度。

由圖3可知，秦川牛背最長肌條帶眾多，由此可判斷蛋白種類較多。隨貯藏時間延長，150～250 kDa內蛋白條帶逐漸變窄；秦川牛背最長肌總可溶性蛋白100 kDa處I條帶逐漸變淺；37～50 kDa內蛋白條帶逐漸變淺且分散；25～37 kDa內原肌球蛋白條帶逐漸變淺，但II條帶顯著變深；10～25 kDa內III、IV條帶變深，IV條帶明顯變深?？傮w上，高分子質量蛋白條帶逐漸變淺，低分子質量蛋白條帶逐漸變深，這一結果與總可溶性蛋白分析結果結合，可以推測出秦川牛背最長肌總可溶性蛋白出現(xiàn)顯著降解現(xiàn)象，其結構總可溶性蛋白變化可能會影響嫩度的形成。

圖3 秦川牛背最長肌貯藏過程總可溶性蛋白電泳圖Fig. 3 Degradation of total soluble proteins in Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle during storage

2.3 不同貯藏時間秦川牛背最長肌肌漿蛋白含量的變化

利用肌漿蛋白在水溶液和低鹽溶液中具有較高的溶解性提取肌漿蛋白，以此判斷肌漿蛋白含量的變化。由圖4可知，0～8 d貯藏期內肌漿蛋白含量呈上升趨勢，由（43.48±0.43）mg/g增加至（52.97±0.35）mg/g，總體增加了21.83%。

圖4 秦川牛背最長肌貯藏過程中肌漿蛋白含量的變化Fig. 4 Changes in sarcoplasmic protein content in Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle during storage

由圖5可知，0～8 d貯藏期I（150～250 kDa范圍內兩條蛋白條帶）逐漸變淺；II（100 kDa蛋白條帶）逐漸變淺變窄；III（37 kDa蛋白條帶）由3 條蛋白條帶逐漸變成兩條，中間條帶消失；IV（25 kDa蛋白條帶）在前2 d逐漸明顯加深，2～8 d貯藏期內變化不明顯；V（15 kDa蛋白條帶）在2 d后逐漸變寬，可能是大分子蛋白分解的結果；其他條帶無顯著變化。通過以上5 處條帶的變化也可歸納出，高分子質量蛋白條帶逐漸變淺，低分子質量蛋白條帶逐漸變深變寬?？梢酝茰y出，貯藏過程中秦川牛背最長肌肌漿蛋白中高分子質量蛋白出現(xiàn)分解，含量變少，低分子質量蛋白種類逐漸增多，濃度不斷增大。

圖5 秦川牛背最長肌貯藏過程中肌漿蛋白降解電泳圖Fig. 5 Degradation of sarcoplasmic protein in Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle during storage

2.4 不同貯藏時間秦川牛背最長肌肌原纖維蛋白含量的變化

利用肌原纖維蛋白具有高鹽溶解性提取肌原纖維蛋白，觀察肌原纖維蛋白的變化情況。由圖6可知，0～8 d貯藏期肌原纖維蛋白含量呈下降趨勢，由（136.72±3.06）mg/g持續(xù)下降至（67.60±0.84）mg/g。前期下降速率較快，后期下降速率有所放緩，總體下降了50.56%。

圖6 秦川牛背最長肌貯藏過程中肌原纖維蛋白含量的變化Fig. 6 Changes in myofibrillar protein content in Qinchuan cattle Longissimus doris muscle during storage

由圖7可知，隨貯藏時間延長，分子質量在100～250 kDa范圍內蛋白條帶逐漸變深，蛋白含量逐漸增多；分子質量在37～50 kDa內的蛋白條帶變淺；分子質量在25～37 kDa內出現(xiàn)相對高分子質量蛋白條帶變深、相對低分子質量蛋白條帶逐漸消失或變淡；分子質量在15～20 kDa內的蛋白條帶逐漸變深；10～15 kDa處隨著貯藏期延長逐漸出現(xiàn)漸變蛋白條帶。由以上蛋白條帶變化可知，其發(fā)生降解的肌原纖維蛋白出現(xiàn)在37～75 kDa范圍內，而其含量增加的肌原纖維蛋白出現(xiàn)在10～20、100 kDa以上范圍內，總體變化較為顯著，其變化可能會影響蛋白嫩度的形成。貯藏過程中秦川牛背最長肌總可溶性蛋白在內源酶的作用下被降解，而導致總可溶性蛋白含量下降，肌原纖維蛋白含量減少。這與李婷婷報道大黃魚中不同溶解性蛋白冷藏期間的濃度變化規(guī)律一致。

圖7 秦川牛背最長肌貯藏過程中肌原纖維蛋白降解電泳圖Fig. 7 Degradation of myofibril protein in Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle during storage

2.5 不同貯藏時間秦川牛背最長肌MFI分析

肌纖維降解程度常用MFI來反映。由圖8可知，秦川牛背最長肌在整個貯藏過程中MFI呈上升趨勢，0～2 d和6～8 d貯藏期上升較緩，2～6 d時上升較快。貯藏0 d時MFI為28.50±5.16，之后MFI一直增加，貯藏8 d時達到整個貯藏過程的最高點（99.98±1.20），增長了250.81%。這一結果與李升升對牦牛平滑肌嫩度形成機理的研究中MFI的變化趨勢相一致。

圖8 秦川牛背最長肌不同貯藏時間MFI的變化Fig. 8 Changes in MFI of Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle at different storage times

2.6 結構蛋白對宰后秦川牛背最長肌嫩化影響的機制分析

由表1可知，0～8 d貯藏期表征肌纖維降解程度的MFI與剪切力并無顯著相關性（＝-0.285），D’Alessandro等在牛肉嫩度研究中也出現(xiàn)相同結果。結合大量學者提出的嫩度形成與肌原纖維降解有密切關系，可得貯藏前期肌原纖維小片化程度增大，主要是能量與pH值的變化引起肌肉收縮、組織僵化，進而影響嫩度的降低，對剪切力影響較小。貯藏期內MFI逐漸升高，中后期肌原纖維小片化累積到一定量時對嫩度的形成有貢獻。

此外，MFI與總可溶性蛋白、肌原纖維蛋白含量呈極顯著負相關（＜0.01），與肌漿蛋白含量呈極顯著正相關（＜0.01）。這說明MFI變化與肌肉蛋白組成變化有密切的關系，蛋白降解會增大MFI。

表1 秦川牛背最長肌MFI、總可溶性蛋白、肌漿蛋白、肌原纖維及基質蛋白含量和剪切力之間的相關性Table 1 Correlation between MFI and total protein, sarcoplasmic protein, myofibrillar protein and matrix protein contents and shear force in Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle

肌肉所含蛋白質是由肌漿蛋白、基質蛋白和作為結構蛋白的肌原纖維蛋白組成。由圖9可知，貯藏0 d時測得秦川牛背最長肌肌肉中肌原纖維占比69.60%，肌漿蛋白占比22.13%，基質蛋白占比6.60%，符合肌肉組織中蛋白結構組成比例。此外，貯藏0～8 d肌原纖維蛋白所占比例呈持續(xù)減少趨勢，由0 d時的69.60%逐漸降至8 d 時的52.61%；肌漿蛋白所占比例呈持續(xù)上升趨勢，由0 d時的22.13%逐漸增加至8 d時的41.23%，但基質蛋白含量僅有少量變化。由此可得肌肉所含蛋白質中主要是肌原纖維蛋白的降解。而肌原纖維蛋白主要由肌動蛋白（45 kDa）、肌球蛋白重鏈（200 kDa）和原肌球蛋白蛋白（35 kDa）組成，由圖7可知，0～8 d貯藏期肌動蛋白與原肌球蛋白所屬條帶呈顯明顯變淺趨勢，可得肌動蛋白與原肌球蛋白發(fā)生降解，在31 kDa附近出現(xiàn)新條帶有可能是肌動蛋白的分解產物，作為肌動蛋白降解標志物。對于肌球蛋白重鏈的降解情況，在總可溶性蛋白凝膠電泳圖中發(fā)現(xiàn)在200 kDa附近條帶變淺，但在肌原纖維蛋白電泳圖中未發(fā)現(xiàn)有明顯變淺的情況，由此無法判斷肌球蛋白重鏈是否出現(xiàn)降解。肌原纖維蛋白降解可能是因為貯藏過程中受到內源酶（鈣蛋白酶、組織蛋白酶、細胞凋亡酶）作用，同時微生物對肌肉污染和對蛋白質分解利用也有加速肌動蛋白降解的作用。研究表明肉中肌原纖維蛋白降解會導致其在空間結構、溶解度、疏水性等方面發(fā)生改變。肌原纖維是肌肉結構骨架中主要的蛋白質，是肌纖維的物質基礎，其出現(xiàn)降解后，MFI逐漸增加，表明肌原纖維內部結構完整性遭到破壞，結合剪切力4～8 d呈下降趨勢，可推測出肌肉中結構蛋白發(fā)生降解，對嫩度形成可能會有一定影響。

圖9 秦川牛背最長肌貯藏過程中蛋白組成占比Fig. 9 Change in protein composition of Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle during storage

2.7 差異蛋白質篩選

實驗中采用4D-LFQ檢測了秦川牛宰后蛋白質組的變化，對所得的蛋白質二級結構進行質譜檢索，共檢索確定蛋白1 149 個，設置1.2 倍為標準差異倍數，共篩選出120 個符合標準的差異蛋白質，利用KEGG數據庫對這120 種差異蛋白進行生物信息分析，所得的數據利用SPSS 25軟件中Pearson相關性分析，共確定11 種差異蛋白質與嫩度形成機理有關，如表2所示。

表2 秦川牛背最長肌貯藏0、4、8 d嫩度相關差異蛋白對比Table 2 Comparison of tenderness-related differential proteins in Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle at days 0 versus 4 versus 8 of storage

2.8 生物信息學分析

圖10是利用Cytoscape 3.6.1和String 10.0軟件制作篩選出的與嫩度相關的蛋白質互作網絡圖。此網絡圖聚類系數為0.759，蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）富集值為1.0×10。ACTN1、MYH9、MYLPF、MYL12B、MYH13、MYL2、MYH6、ACTC1、TNNI1、TNNI2、MYH15的相互作用強烈。以上11 種蛋白在肌球蛋白結合、鈣離子結合、細胞骨架蛋白結合的肌原纖維組裝、骨骼肌組織發(fā)育過程等途徑調控細胞的生理狀態(tài)。

圖10 蛋白質互作網絡圖Fig. 10 Protein-protein interaction network diagram

2.9 結構蛋白變化對秦川牛背最長肌嫩度形成的影響

利用蛋白質組學技術篩選出11 種肌肉結構蛋白（ACTN1、ACTC1、TNNI1、TNNI2、MYH9、MYH13、MYH6、MYH15、MYL2、MYL2B、MYLPF）出現(xiàn)異常表達，豐富度發(fā)生了不同程度變化。

實驗中發(fā)現(xiàn)異常表達的ACTN1與ACTC1均屬于肌動蛋白家族。ACTN在細胞骨架蛋白家族廣泛表達，通常是以反向平行二聚體形式存在。據報道，ACTN有4 種亞基，ACTN2和ACTN3在肌肉細胞中表達，ACTN1和ACTN4與細胞膜上肌動蛋白偶聯(lián)。ACTN1被認為能將肌動蛋白錨定在多種細胞內結構上，是一種捆綁蛋白，0～8 d貯藏期內呈現(xiàn)顯著上調趨勢，推測是由于在肌原纖維束過于松散時的應激反應試圖重新固定松散的纖維束，增強骨架結構；ACTC1也屬于肌動蛋白家族，與肌原纖維細絲的聚集和形成有關，謝珊珊利用多組學技術整合分析梅山豬，發(fā)現(xiàn)ACTC1與肌原纖維形成有關。實驗中0～8 d貯藏期內ACTC1表達量顯著下調，其低表達可能會影響肌纖維聚集度和結構，進而導致肌原纖維骨架網抗剪切能力降低。

TNNI1與TNNI2均屬于肌鈣蛋白家族，分別為肌鈣蛋白的1型和2型，是肌鈣蛋白的重要組成部分。有研究表明TNNI1與TNNI2在肌肉放松和收縮時發(fā)揮重要作用，同時影響肌原纖維的直徑、類型、形態(tài)，肌原纖維這些特征會直接影響肉質，尤其是肌纖維的類型與直徑會直接影響牛肉的嫩度。由表2可知，TNNI1與TNNI2表達量在0～8 d貯藏期內均出現(xiàn)顯著下調，呈現(xiàn)低表達現(xiàn)象。有研究證明，TNNI1在脊椎動物排酸成熟過程中比較容易降解，且TNNI1發(fā)生降解后會伴隨著肉品嫩度的增加。綜上可得秦川牛宰后肌肉組織通過TNNI1與TNNI2低表達，調節(jié)肌肉纖維的直徑與形體，進而參與嫩度的形成。

MYH6、MYH9、MYH13、MYH15、MYL2、MYL12B與MYLPF 7 種蛋白均屬于肌球蛋白家族。MYH6、MYH9、MYH13與MYH15均屬于肌球蛋白激酶ATPase超家族。Fang Xinhui等應用對比實驗將敲除，發(fā)現(xiàn)在缺氧情況下未敲除組基因的表達量明顯上調，與敲除組相比細胞葡萄糖消耗量與乳酸產生量明顯增多，這一結果表明MYH9可能會參與糖酵解過程。在本研究中MYH9表達量在0～4 d顯著上調，可以看出，秦川牛宰后缺氧情況下，會通過調節(jié)MYH9的表達量，增強無氧呼吸的強度，增加產能。MYH6屬于肌球蛋白重鏈家族。付睿琦利用蛋白質組學技術對北京油雞肌肉基因篩選，結果表明MYH6可能是肌肉細胞骨架結構組成成分，穆琳等研究也表明MYH6可能參與肌纖維發(fā)育過程，當肌肉組織的生長速度加快時，MYH6表達水平也會提高。有研究表明，MYH6的低表達會影響心肌的收縮，造成心肌衰竭，由此可判斷MYH6還可能與纖維收縮有關。本實驗發(fā)現(xiàn)MYH6表達量在0～8 d顯著下調，其低表達可能會影響秦川牛背最長肌肌肉纖維的再生速度，減少生成量，較難維持肌肉纖維骨架原有狀態(tài)，并影響了肌肉的收縮功能，增加肌肉的松弛度。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，對MYH13的研究較少，主要集中在眼外肌和喉肌上，MYH13的表達可以使肌肉具有更強的收縮能力和較小的張力。本實驗發(fā)現(xiàn)MYH13表達量在4～8 d顯著下調，可推斷出，其低表達可能會使肌肉收縮能力減弱、張力發(fā)生變化、肌肉松弛、質地變軟、彈性減小、剪切力變小和嫩度變大。MYH15被認為是一種慢性肌球蛋白，參與肌肉的收縮和細胞骨架的重塑，是哺乳動物橫紋肌纖維收縮的動力分子。MYH15表達量在0～8 d內顯著下調，其低表達可能會降低秦川牛背最長肌橫紋肌纖維的收縮能力，使得肌肉長期處于舒張狀態(tài)。

MYL2、MYL12B和MYLPF為肌球蛋白輕鏈家族。MYL2參與調解肌原纖維的活性，對肌肉纖維的生長發(fā)育有重要的調節(jié)作用，通過增加肌球蛋白杠桿臂剛度和促進肌球蛋白頭部擴散，從而增加最大收縮力和收縮力的鈣敏感性。MYL2表達量在0～8 d顯著下調，低表達可能會影響新纖維的生成及損傷纖維的修復過程。MYLPF可磷酸化，屬于快速骨骼肌。劉瑞莉等在對布萊凱特黑牛與魯西黃牛背最長肌中基因表達量的變化規(guī)律進行研究時發(fā)現(xiàn)，MYLPF可能起調節(jié)骨骼肌生長發(fā)育的作用。實驗中MYLPF表達量在0～4 d顯著下調。MYL12B通過磷酸化在調節(jié)平滑肌和非肌肉細胞收縮活動中發(fā)揮重要作用，還與胞質分裂、受體封頂和細胞運動有關，Park等通過基因敲除實驗發(fā)現(xiàn)缺失后會導致細胞結構和形態(tài)發(fā)生顯著變化，肌動蛋白纖維的形成會被嚴重破壞，纖維突起和長度明顯增加，MYL12B對于維持MYH9、MYH10和MYL6的穩(wěn)定性也至關重要，進而對細胞肌動球蛋白的正常功能也具有一定影響。本實驗中MYL12B表達量在0～4 d顯著上調。通過基因本體注釋（gene ontology，GO）分析可以看出MYL2、MYL12B和MYLPF 3 種蛋白共同參與了細胞組分的肌動蛋白細胞骨架和肌球蛋白復合體條目，生物過程中的鈣離子結合條目。以上3 種蛋白在貯藏0～8 d出現(xiàn)不同程度調控，對受損纖維修復、纖維再生、肌動蛋白細胞骨架產生不同程度影響，改變肌纖維原有的穩(wěn)定狀態(tài)，最終影響纖維骨架強度，使剪切力下降，嫩度上升。

3 結 論

4D-LFQ蛋白質組學分析結果表明，貯藏0～8 d秦川牛背最長肌所含結構蛋白溶解度降低，蛋白質碎片從膜和肌纖維網絡如肌纖維網絡中釋放出來，其中ACTN1、MYH9、MYLPF、MYL12B、MYH13、MYL2、MYH6、ACTC1、TNNI1、TNNI2、MYH15豐富度發(fā)生變化，相互作用強烈，在肌球蛋白結合、鈣離子結合、細胞骨架蛋白結合的肌原纖維組裝、骨骼肌組織發(fā)育、肌肉器官發(fā)育、橫紋肌組織發(fā)育過程等途徑調控細胞的生理狀態(tài)，進一步說明貯藏期間，構成肌肉骨架的結構蛋白發(fā)生降解，影響肌肉收縮，引起肌肉僵直，從而造成肌肉剪切力增大、MFI增加，對秦川牛肉貯藏中后期嫩度的提高具有一定影響。