動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的緩解作用

馬 巖，王中江，楊靖瑜，李 哲，彭 霞，陳昱鳳，李柏良,*

（1.沈陽(yáng)師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種慢性和復(fù)發(fā)性胃腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩?。–rohn’s disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎。IBD的病因還不明確，其發(fā)病機(jī)制與嚴(yán)重程度受到多種因素影響，其中主要包括遺傳因素、免疫反應(yīng)、腸道菌群和氧化應(yīng)激等因素。在IBD的發(fā)展過(guò)程中，過(guò)度的免疫反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致組織損傷，腸道菌群失調(diào)不僅會(huì)引起腸道炎癥，還會(huì)改變腸道微環(huán)境，并引發(fā)機(jī)體代謝紊亂。目前治療IBD的藥物主要是抗炎或免疫抑制藥物，如氨基水楊酸、皮質(zhì)類固醇和硫嘌呤，但這些藥物往往會(huì)引起嚴(yán)重的副作用。

腸道微生物在人類能量代謝和免疫過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，越來(lái)越多的證據(jù)表明，腸道微生物失調(diào)與某些人類疾病有關(guān)，如肥胖、過(guò)敏、IBD和2型糖尿病等疾病。腸道微生物的組成與宿主免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)IBD患者腸道中厚壁菌門的相對(duì)豐度增加，而擬桿菌門的相對(duì)豐度下降。且有研究證明，與健康受試者相比，潰瘍性結(jié)腸炎患者的潛在致病菌相對(duì)豐度增加。致病菌入侵腸上皮細(xì)胞后會(huì)破壞腸上皮屏障的完整性，并觸發(fā)腸道炎癥反應(yīng)，因此，腸道微生物可能是潰瘍性結(jié)腸炎治療的一個(gè)重要潛在靶點(diǎn)。

益生菌是一類定植于腸道對(duì)宿主健康有益的活的微生物，其中包括具有干預(yù)腸道炎癥作用的乳酸菌和雙歧桿菌。雙歧桿菌在減少條件病原體的定植、維持宿主微生物穩(wěn)態(tài)、保護(hù)腸道黏膜屏障的完整性和調(diào)節(jié)腸道炎癥方面發(fā)揮其特定作用。此外，一些研究已經(jīng)報(bào)道了雙歧桿菌對(duì)結(jié)腸炎具有緩解作用，Chen Yang等研究發(fā)現(xiàn)，短雙歧桿菌可通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞因子、增強(qiáng)腸上皮屏障功能和調(diào)節(jié)腸道菌群有效減輕葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。Din等的研究表明雙歧桿菌ATCC29521可通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA相關(guān)的緊密連接蛋白和核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear transcription factor，NF）-κB通路以及在一定程度上恢復(fù)菌群失調(diào)來(lái)緩解DSS引起的潰瘍性結(jié)腸炎。

本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11具有預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎的作用，因此，本研究旨在探討動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的緩解作用及其潛在機(jī)制，采用體質(zhì)量變化率、結(jié)腸長(zhǎng)度、疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活力和組織病理學(xué)分析評(píng)價(jià)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎的緩解作用，并通過(guò)研究細(xì)胞因子、腸道屏障和核NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)、腸道菌群及短鏈脂肪酸含量探索動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11緩解小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)雄性8 周齡C57BL/6N小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006）。

動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

MPO活力測(cè)定試劑盒 南京建成生物有限公司；白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、IL-10和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 泉州科諾迪生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌總DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；GoScript? Reverse Transcription Mix試劑盒、GoqPCR Master Mix 普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；LDZF-50KB-II立式蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-16G離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠；超低溫冰箱 青島海爾集團(tuán)；Model 680型酶標(biāo)儀美國(guó)Beckman公司；ABI7500熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與飼養(yǎng)

將45 只8 周齡C57BL/6N雄鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為3 組，每組15 只，即正常組、模型組、雙歧桿菌組。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，正常組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段內(nèi)正常攝食與飲水，每天灌胃0.2 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.05 mol/L、pH 7.4，后同）；模型組自由飲用3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）DSS水溶液7 d誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎模型，隨后每天灌胃0.2 mL無(wú)菌PBS，持續(xù)2 周；雙歧桿菌組飲用3% DSS水溶液7 d誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎模型，隨后根據(jù)前期研究結(jié)果，每天每只小鼠灌胃1×10CFU動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11（用PBS調(diào)整菌體濃度為5×10CFU/mL，每次取0.2 mL用于灌胃），持續(xù)2 周。

1.3.2 小鼠體質(zhì)量變化率、結(jié)腸長(zhǎng)度、疾病活動(dòng)指數(shù)和結(jié)腸組織MPO活力測(cè)定

實(shí)驗(yàn)的第1天和最后1 d天稱量小鼠的體質(zhì)量，麻醉后，小鼠頸椎脫臼處死，參照文獻(xiàn)[15]測(cè)量小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度/cm，并稱量小鼠結(jié)腸質(zhì)量。體質(zhì)量變化率按下式計(jì)算。

采用MPO生化試劑盒測(cè)定結(jié)腸組織中MPO活力。通過(guò)DAI評(píng)分評(píng)估結(jié)腸炎嚴(yán)重情況。DAI評(píng)分包括體質(zhì)量變化率、糞便性狀和隱血/便血情況，DAI結(jié)果以3 項(xiàng)評(píng)分之和表示，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。每天測(cè)量體質(zhì)量，觀察糞便性狀和隱血/便血情況。糞便隱血情況采用鄰聯(lián)甲苯胺法測(cè)定，具體步驟操作如下：1）盡快收集糞便標(biāo)本涂在白瓷板上；2）滴加鄰聯(lián)甲苯胺液2 滴（約0.1 mL）于糞便不同位置；3）滴加氧化劑2 滴（約0.1 mL），立即計(jì)時(shí)并觀察顏色變化。4）2 min內(nèi)有藍(lán)色出現(xiàn)，糞便隱血實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性，2 min內(nèi)不顯色為陰性。

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for DAI evaluation

1.3.3 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

取小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織用4%（體積分?jǐn)?shù)）甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，經(jīng)二甲苯脫蠟后用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化。

1.3.4 結(jié)腸組織細(xì)胞因子質(zhì)量濃度測(cè)定

結(jié)腸組織細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10）質(zhì)量濃度的測(cè)定分別參照對(duì)應(yīng)ELISA試劑盒說(shuō)明書。

1.3.5 熒光定量PCR檢測(cè)

取適量結(jié)腸組織樣本，利用組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，參照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取結(jié)腸組織內(nèi)的總RNA，按照GoScript? Reverse Transcription Mix試劑盒操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，按照GoqPCR Master Mix試劑盒配制反應(yīng)液，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增。引物信息如表2所示，反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，循環(huán)40 次，根據(jù)2法計(jì)算樣本中目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列的設(shè)計(jì)Table 2 Primer sequences used for quantitative polymerase chain reaction

1.3.6 小鼠腸道菌群分析

取出小鼠結(jié)腸內(nèi)容物置于滅好菌的凍存管中，立即放入液氮中，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，每組隨機(jī)選擇3 個(gè)樣品送到哈爾濱博泰基因有限公司對(duì)小鼠腸道內(nèi)容物的基因V3～V4區(qū)域序列進(jìn)行高通量測(cè)序。按照試劑盒說(shuō)明書提取各組小鼠的腸道內(nèi)容物中的微生物DNA。通過(guò)1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA純度，并使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和總量。以細(xì)菌基因組為模板利用高保真酶擴(kuò)增16S rDNA的V3～V4區(qū)，引物為V3F：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’；V4R：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’，并在引物5’端加上標(biāo)簽序列。將PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證?；厥詹⒓兓疨CR產(chǎn)物，通過(guò)Qubit 3.0熒光光度計(jì)進(jìn)行定量分析，構(gòu)建Miseq文庫(kù)，利用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。過(guò)濾后的數(shù)據(jù)參考文獻(xiàn)[16]使用FLASH（V1.2.7）軟件進(jìn)行拼接并去除沒(méi)有重疊關(guān)系的測(cè)序序列，使用UCHIME算法去除嵌合體序列，以獲得高質(zhì)量的序列標(biāo)簽。使用Uparse軟件對(duì)具有97%序列同源性的序列標(biāo)簽進(jìn)行聚類，得到操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）的代表序列。使用PyNAST軟件與GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列對(duì)比，對(duì)OTU進(jìn)行分類信息注釋。使用MUSCLE軟件生成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并對(duì)OTU豐度信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。通過(guò)QIIME軟件（V1.7.0）和R軟件（V3.4.1）分析物種組成。

1.3.7 結(jié)腸中短鏈脂肪酸含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱?。?.800±0.010）g盲腸內(nèi)容物放入糞便樣本盒中，用HALO-F100糞便處理儀處理，配制10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）懸濁液，取500 μL懸濁液于1.5 mL離心管中，并加入100 μL巴豆酸偏磷酸溶液（75 mmol/L），-30 ℃凍藏24 h，解凍后8 000×離心3 min（4 ℃）去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，取上清液用0.22 μm水系膜過(guò)濾后采用氣相色譜方法測(cè)定短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan多重比較進(jìn)行顯著性差異分析。＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。采用Origin 18.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長(zhǎng)度、疾病活動(dòng)指數(shù)、MPO活力的影響

如圖1所示，相比于正常組小鼠體質(zhì)量變化率和結(jié)腸長(zhǎng)度，DSS可以引起小鼠體質(zhì)量變化率和結(jié)腸長(zhǎng)度的顯著降低（＜0.05、＜0.01），相比于模型組，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11可以顯著（＜0.05、＜0.01）提高體質(zhì)量變化率和結(jié)腸長(zhǎng)度。相比于正常組，模型組的DAI（7.03±0.25）和MPO活力（（0.77±0.04）U/g）均極顯著增加（＜0.01），表明潰瘍性結(jié)腸模型建造成功。相比于模型組，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11可以極顯著降低DAI和MPO活力（＜0.01）。

圖1 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠體質(zhì)量變化率（A）、結(jié)腸長(zhǎng)度（B）、DAI（C）、結(jié)腸組織MPO活力（D）的影響Fig. 1 Effect of B. animalis subsp. lactis intervention on body mass (A),colon length (B), DAI (C) and intestinal MPO (D) activity of mice with ulcerative colitis

2.2 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響

從圖2可觀察到，正常組小鼠杯狀細(xì)胞豐富，腸腺豐富且排列整齊，黏膜下層間隙大小均勻，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而模型組結(jié)腸水腫嚴(yán)重，黏膜層大面積壞死，黏膜層隱窩結(jié)構(gòu)消失，伴有炎性細(xì)胞彌散性浸潤(rùn)；與模型組相比，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11明顯降低炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，改善DSS引起的結(jié)腸組織病理學(xué)變化。

圖2 各組小鼠結(jié)腸HE染色結(jié)果Fig. 2 Hematoxylin-eosin staining of colonic tissue of mice in each group

2.3 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸細(xì)胞因子的影響

本實(shí)驗(yàn)采用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠結(jié)腸中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的質(zhì)量濃度，研究動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎炎癥因子的影響。如圖3所示，與正常組相比，模型組促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的質(zhì)量濃度均極顯著升高（＜0.01），而抑炎細(xì)胞因子IL-10的質(zhì)量濃度極顯著下降（＜0.01）。通過(guò)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11的干預(yù)可極顯著降低TNF-α、IL-1β和IL-6的質(zhì)量濃度（＜0.01），同時(shí)使IL-10質(zhì)量濃度顯著升高（＜0.05）。

圖3 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸中細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的影響Fig. 3 Effect of B. animalis subsp. lactis intervention on cytokine contents in colonic tissue of mice with ulcerative colitis

2.4 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)腸道屏障相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響

結(jié)腸緊密連接蛋白和黏蛋白的mRNA相對(duì)表達(dá)水平如圖4所示，與正常組相比，模型組閉合蛋白-1（Claudin-1）、閉合蛋白（Occludin）、閉鎖連接蛋白（zonula occludens，ZO）-1和黏蛋白2（mucin 2，MUC2）的mRNA相對(duì)表達(dá)水平均極顯著降低（＜0.01），表明上皮完整性已受損。與模型組相比，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11極顯著提高了、、和mRNA相對(duì)表達(dá)水平（＜0.01、＜0.05）。

圖4 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腸道屏障相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig. 4 Effect of B. animalis subsp. lactis intervention on relative expression levels of intestinal barrier-related gene in colonic tissue of mice with ulcerative colitis

2.5 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群物種組成的影響

如圖5A所示，在門水平上，3 組腸道菌群主要由厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）組成，與正常組相比，模型組小鼠的擬桿菌門和變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度增加，厚壁菌門和放線菌門（Actinobacteria）的相對(duì)豐度降低。動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11干預(yù)后可以增加小鼠厚壁菌門和放線菌門的相對(duì)豐度，并且降低擬桿菌門和變形菌門的相對(duì)豐度。

圖5 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腸道菌群物種組成的影響Fig. 5 Effect of B. animalis subsp. lactis intervention on the composition of gut microbiota in mice with ulcerative colitis

如圖5B所示，在屬水平上，相比于正常組，模型組小鼠的腸道菌群中雙歧桿菌屬（）、乳桿菌屬（）、糞桿菌屬（）、布勞特氏菌屬（）、羅斯氏菌屬（）的相對(duì)豐度降低。此外，模型組小鼠腸道菌群中的脫硫弧菌屬（）、幽門螺桿菌屬（）和彎曲桿菌屬（）的相對(duì)豐度增加。動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11的干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)這些菌屬的變化。

2.6 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸內(nèi)短鏈脂肪酸含量的影響

本研究進(jìn)一步分析腸道中短鏈脂肪酸的含量，結(jié)果如圖6所示，與正常組乙酸、丙酸和丁酸含量相比，模型組的乙酸、丙酸和丁酸的含量均極顯著降低（＜0.01），而動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11的干預(yù)可以極顯著地增加乙酸、丙酸和丁酸的含量（＜0.01）。

圖6 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸內(nèi)短鏈脂肪酸含量的影響Fig. 6 Effect of B. animalis subsp. lactis intervention on fecal short chain fatty acid contents in colonic tissue of mice with ulcerative colitis

2.7 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸NF-?B信號(hào)通路的影響

本研究進(jìn)一步分析NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的變化，結(jié)果如圖7所示，與正常組相比，模型組中kappa B抑制因子激酶（inhibitor of kappa B kinase，IKK）β和的mRNA表達(dá)水平極顯著上調(diào)（＜0.01），NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）-α的mRNA表達(dá)水平極顯著下調(diào)（＜0.01），而動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11能夠極顯著改善以上基因的表達(dá)水平（＜0.01）。

圖7 動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸組織NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響Fig. 7 Effect of B. animalis subsp. lactis intervention on the mRNA relative expression levels of genes related to NF-κB signaling pathway in mice with ulcerative colitis

3 討 論

IBD的患病率在全球范圍內(nèi)不斷增加，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11具有預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎的作用，因此，本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地研究動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11緩解潰瘍性結(jié)腸炎的效果及可能機(jī)制。

DAI對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的臨床進(jìn)展具有重要的評(píng)價(jià)作用。MPO活力可以反映中性粒細(xì)胞的炎癥浸潤(rùn)程度，被認(rèn)為是DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎炎癥水平的標(biāo)志。動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11干預(yù)可以有效地降低以上指標(biāo)，表明動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11具有緩解潰瘍性結(jié)腸炎的作用。DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎與人類潰瘍性結(jié)腸炎的病理學(xué)變化非常類似，本研究發(fā)現(xiàn)DSS可引起結(jié)腸水腫嚴(yán)重，黏膜層大面積壞死，黏膜層隱窩結(jié)構(gòu)消失，伴有炎性細(xì)胞彌散性浸潤(rùn)，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11干預(yù)可有效改善DSS引起的病理學(xué)變化，這與Zhang Dongyang等研究結(jié)果一致。潰瘍性結(jié)腸炎與炎癥因子水平密切相關(guān)，DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎可以產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子，嚴(yán)重破壞上皮細(xì)胞層。因此，本研究采用ELISA法檢測(cè)DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DSS可以顯著地提高小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β和IL-6的質(zhì)量濃度而降低IL-10的質(zhì)量濃度。Alex和Boussenna等的研究也發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）水平會(huì)隨著DSS的暴露而顯著升高，TNF-α還能破壞腸上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，引起腸黏膜損傷，過(guò)量的IL-1β促進(jìn)了其他炎癥因子的表達(dá)，增強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的通透性，加重了腸黏膜的炎癥。IL-6是一種促炎因子，在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。IL-10是一種抗炎因子，可抑制促炎因子的釋放，減少炎癥反應(yīng)，這與Yan Shuang等研究結(jié)果較為一致。

緊密連接在腸道上皮細(xì)胞表面形成黏膜屏障，其異常表達(dá)導(dǎo)致屏障結(jié)構(gòu)破壞，是腸道炎癥的啟動(dòng)因子。緊密連接主要包括Occludin、Claudins、ZO-1和ZO-2，它們是腸黏膜屏障的主要成分，影響腸黏膜的通透性和完整性。Claudins在腸上皮穩(wěn)態(tài)和炎癥的表達(dá)和調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Occludin是一種整體跨膜蛋白，是緊密連接蛋白中最重要的蛋白分子之一，在協(xié)調(diào)細(xì)胞旁路屏障功能和平衡腸道上皮細(xì)胞通透性方面發(fā)揮著重要作用。缺乏緊密連接會(huì)增加腸道屏障的通透性，導(dǎo)致細(xì)菌和潛在有害抗原的入侵，進(jìn)而引發(fā)腸道炎癥的發(fā)生。黏蛋白包括MUC1和MUC2等，在腸道上皮細(xì)胞表面形成黏膜屏障，其異常表達(dá)導(dǎo)致屏障結(jié)構(gòu)破壞，是腸道炎癥的啟動(dòng)因子。在本研究中結(jié)果表明，與正常組相比，DSS干預(yù)顯著下調(diào)了、、和mRNA相對(duì)表達(dá)水平，而動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11干預(yù)可以顯著提高、、和mRNA相對(duì)表達(dá)水平，表明動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11可以通過(guò)提高腸道屏障功能進(jìn)而可以緩解潰瘍性結(jié)腸炎。這與長(zhǎng)雙歧桿菌CCM 7952可以上調(diào)小鼠腸道上皮中ZO-1和Occludin的表達(dá)，降低結(jié)腸通透性的結(jié)果一致。

大量的研究表明腸道菌群在IBD中起關(guān)鍵作用。潰瘍性結(jié)腸炎通常會(huì)引起腸道菌群紊亂，其中厚壁菌門和擬桿菌門是腸道內(nèi)相對(duì)豐度最多的兩個(gè)菌門，與腸道健康密切相關(guān)。在本研究中，與正常組相比較，模型組小鼠的擬桿菌門和變形菌門相對(duì)豐度增加，厚壁菌門和放線菌門的相對(duì)豐度降低，這與Shi Jialu和Fujio-Vejar等研究結(jié)果一致。在屬水平上，模型組小鼠腸道菌群中的脫硫弧菌屬、幽門螺桿菌屬和彎曲桿菌屬的相對(duì)豐度增加，這與Yu Peng等的研究結(jié)果較為一致。以上菌屬均屬于致病菌，腸道致病菌可以侵襲腸道黏膜，導(dǎo)致腸道內(nèi)微生態(tài)紊亂，破壞腸道黏膜正常功能。此外，有研究報(bào)道，幽門螺桿菌屬和彎曲桿菌屬于變形菌門，而且可以分泌具有特定的脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)的脂多糖，脫硫弧菌可以分泌脂多糖，從而加重潰瘍性結(jié)腸炎和CD。相比于正常組，模型組小鼠的腸道菌群中雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、糞桿菌屬、布勞特氏菌屬、羅斯氏菌屬的相對(duì)豐度降低，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11的干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)這些菌屬的變化。雙歧桿菌屬是一種廣泛使用的益生菌，可以產(chǎn)生乙酸，而且雙歧桿菌可以緩解小鼠腸道炎癥。乳桿菌屬是知名的益生菌，其代謝產(chǎn)物乳酸可以轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸，通過(guò)小鼠模型已經(jīng)證明其具有減輕潰瘍性結(jié)腸炎的作用。糞桿菌屬和布勞特氏菌屬是丁酸產(chǎn)生菌，糞桿菌屬與腸道健康完整性密切相關(guān)，也有研究表明糞桿菌屬在潰瘍性結(jié)腸炎患者中顯著降低。布勞特氏菌屬與促炎細(xì)胞因子呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Tan Bei等報(bào)道羅斯氏菌屬可以通過(guò)產(chǎn)生短鏈脂肪酸緩解潰瘍性結(jié)腸炎。

基于以上腸道菌群的變化，本研究進(jìn)一步分析短鏈脂肪酸含量的變化，結(jié)果表明動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11的干預(yù)可以極顯著提高短鏈脂肪酸的含量（＜0.01），Tayyeb等研究表明短鏈脂肪酸可以通過(guò)抑制NF-κB通路抑制潰瘍性結(jié)腸炎。NF-κB是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌乳亞種XLTG11的干預(yù)可以顯著上調(diào)的表達(dá)，而下調(diào)和的表達(dá)。IKK主要包括IKKα和IKKβ亞基，可以控制NF-κB的活性，IKK的活性主要由其IKKβ亞基的磷酸化決定。IκB是NF-κB的抑制因子，二者在細(xì)胞質(zhì)中緊密結(jié)合，當(dāng)IκB被IKKβ磷酸化后，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，激發(fā)炎癥反應(yīng)。以上結(jié)果表明動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11的干預(yù)可以通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路緩解潰瘍性結(jié)腸炎，這與Ghadimi等關(guān)于動(dòng)物雙歧桿菌R101-8緩解潰瘍性結(jié)腸炎的結(jié)果相一致。然而，與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路途徑不僅是NF-κB，因此，后續(xù)研究需要進(jìn)一步分析其他炎癥相關(guān)信號(hào)通路，如c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路等。

綜上，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種XLTG11可以提高DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的體質(zhì)量變化率、結(jié)腸長(zhǎng)度，降低DAI、MPO活力和促炎細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度，調(diào)節(jié)腸道菌群組成，提高短鏈脂肪酸含量，上調(diào)腸道屏障相關(guān)基因的表達(dá)并抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。