百香果高酯果膠-酚酸衍生物的分子特征、體外抗氧化和免疫活性

高 凡，丁 寧，艾連中，賴鳳羲,*，張 匯，宋子波

（1.上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093；2.云南貓哆哩集團食品有限責(zé)任公司，云南 玉溪 653100）

果膠為優(yōu)良的親水膠體，常作為膠凝劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、可食性薄膜、營養(yǎng)與藥物載體等以及促進腸道健康的膳食纖維廣泛用于食品中。商業(yè)上果膠主要源自柑橘皮、蘋果渣和其他果皮，其主干結(jié)構(gòu)為半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）組成的同型半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG），分枝結(jié)構(gòu)主要為兩種類型的鼠李半乳糖醛酸聚糖（rhamnogalacturonan，RG）（RG I和RG II），依GalA的羧基甲基酯化程度可分為高酯（酯化度（degree of esterification，DE）＞50%）和低酯（DE＜50%）果膠，各具有不同的流變特性與用途。

天然果膠的親水性高，具有良好的凝膠性、增稠性和穩(wěn)定性等重要的功能性，是優(yōu)良的膳食纖維，可改善腸道菌相，但其抗氧化活性和低免疫調(diào)節(jié)活性相對較低，必須經(jīng)酶解或酸熱水解并進行分離和純化等處理才能富集具有高免疫活性的RG I區(qū)域組分及大腸癌細胞高抑制活性的RG II區(qū)域組分。然而上述處理會使果膠分子降解，損失原來的功能特性。因此，采用無降解性方法修飾果膠的結(jié)構(gòu)，以改良生物活性與疏水性相關(guān)的功能性是一重要的策略。

將膳食中常見的酚酸與果膠衍生化制備改性果膠是一種新趨勢。在化學(xué)和生物衍生法中，利用漆酶催化酚酸接枝到果膠的方法備受矚目，其具有天然、綠色安全、可回收性、操作簡單及無需加熱等優(yōu)點，反應(yīng)機理是漆酶將酚羥基氧化成中間產(chǎn)物-酚氧自由基，酚氧自由基進一步氧化斷裂形成醌類物質(zhì)，再親核性作用于果膠分子GalA的自由羧基上形成酯基。初步被研究的果膠-酚酸衍生物有柑橘高酯果膠（citrus high-methoxy pectin，CHP）-阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）、柑橘低酯果膠（citrus low-methoxy pectin，CLP）-FA/咖啡酸（caffeic acid，CaA）與甜菜漿高酯果膠-FA等衍生物，這些衍生物具有較好的疏水性、乳化性與乳化穩(wěn)定性、凝膠強度以及抗氧化活性（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基的清除能力）等。然而果膠結(jié)構(gòu)及酚酸結(jié)構(gòu)對其衍生物的體外抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)活性的影響鮮見研究。此外，對香豆酸（-coumaric acid，CA）和FA都屬于羥基肉桂酸類，廣泛存在于膳食水果和谷物中，均具有良好的抗氧化、抗菌、抗炎活性、抗糖尿病及免疫調(diào)節(jié)等作用。但相關(guān)研究大多以衍生FA和柑橘果膠為主，鮮有有關(guān)百香果果膠-CA衍生物的研究，且百香果果膠（新型果膠）具有與商業(yè)柑橘果膠相似的結(jié)構(gòu)特征，可作為膠凝劑和穩(wěn)定劑等加以應(yīng)用，但目前研究僅限于其結(jié)構(gòu)表征，其功能性亟待深入開發(fā)。

本研究旨在制備具有高體外抗氧化與免疫調(diào)節(jié)活性的果膠衍生物，以漆酶催化合成的百香果高酯果膠（passion fruit high-methoxy pectin，PFP）-CA和FA衍生物為主，并闡明不同衍生處理對產(chǎn)物的分子構(gòu)型與體外生物活性的影響。所得結(jié)果同時與抗壞血酸（vitamin C，VC）衍生物（沒有酚氧化成醌類并鍵結(jié)的作用）和只添加漆酶不加酚酸的對照組作對比，以厘清酚酸組成對衍生物的分子構(gòu)型與體外生物活性的影響與反應(yīng)機理。本研究成果可為改性果膠在藥食同源食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色百香果（Sims f.）果皮由云南貓哆哩集團食品有限責(zé)任公司提供；小鼠巨噬細胞RAW264.7購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

漆酶（酶活力0.84 U/mg） 美國Sigma-Aldrich公司；無水乙醇 上海泰坦科技股份有限公司；DPPH、FA、CA、VC、硫酸亞鐵 上海源葉生物科技有限公司；溴化鉀（光譜級） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硝酸鈉、過氧化氫 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；一氧化氮檢測試劑盒、中性紅細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗 維森特生物技術(shù)（南京）有限公司；DMEM培養(yǎng)基 美國Gibco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效分子篩色譜-多角度激光光散射（high performance-size exclusion chromatography-multiangle laser light scattering，HPSEC-MALLS）儀 美國Wyatt Technology公司；Nicolet 380傅里葉變換紅外光譜儀美國Thermo Fisher Scientific公司；725型紫外-分光光度計上海光譜儀器有限公司；RCT基本型（安全控制型）磁力攪拌器 德國IKA公司；SU8010場發(fā)射掃描式電子顯微鏡 日本Hitachi公司；SpectraMax i3酶標儀美國Molecular Devices公司；SW-CJ-FD超凈工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司；Ardy Bio微孔板振蕩器 梅潔（上海）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 百香果果膠的提取

PFP提取方法參照丁寧等的方法，提取試劑為酸化水溶液（用0.1 mol/L HNO溶液調(diào)節(jié)至pH 2.1）、料液比1∶20（/）、85 ℃加熱3 h。粗提取液經(jīng)離心（6 000 r/min、20 min）得上清液，真空濃縮，以2 倍體積的體積分數(shù)95%乙醇溶液沉淀果膠、離心（6 000 r/min、20 min）收集膠體、冷凍干燥，得到PFP，其組成中半乳糖醛酸物質(zhì)的量分數(shù)為78.5%，DE為75.2%，所用PFP的糖類組成與分子結(jié)構(gòu)特征與商業(yè)CHP極相似。

1.3.2 百香果果膠的改性

果膠與酚酸反應(yīng)的漆酶作用條件參考Karaki等的方法并稍作修改，取1 g PFP溶于90 mL磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L、pH 6.5）中，在80 ℃下磁力攪拌1 h，另將固定量的酚酸（0.18 g FA和0.21 g CA，相當(dāng)于果膠（游離羧基）∶（酚酸）＝1∶1）預(yù)溶解于10 mL純甲醇中，將上述兩種溶液在30 ℃下混合后，添加漆酶10 U（11.91 mg）反應(yīng)4 h，包裹錫箔紙在冰箱4 ℃暗室下反應(yīng)24 h，在蒸餾水中透析（8～14 kDa）24 h，每隔6～8 h換一次水，以除去未衍生的酸，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到百香果高酯果膠-阿魏酸衍生物（PFP-laccase-FA，PFP-L-FA）和百香果高酯果膠-對香豆酸衍生物（PFP-laccase-CA，PFP-L-CA）。另制備只加漆酶的高酯果膠衍生物（PFP-laccase，PFP-L）以及高酯果膠-VC衍生物（PFP-laccase-VC，PFP-L-VC）作為對照組，其中VC的反應(yīng)量為0.19 g。反應(yīng)酸的用量根據(jù)：1 g PFP（脫水半乳糖醛酸相對分子質(zhì)量176）的游離羧基物質(zhì)的量為0.001 1 mol；故（游離羧基）∶（酸）＝1∶1下所需的酸為0.181 g FA、0.214 g CA及0.194 g VC（FA相對分子質(zhì)量194.2、CA相對分子質(zhì)量164.2、VC相對分子質(zhì)量176.1）。

1.3.3 總酚含量的測定

參照Sato等的方法測定總酚含量。以沒食子酸為標準品，線性回歸方程為＝0.033 8-0.029 9（＝0.992），其中為720 nm波長處的吸收度，為沒食子酸質(zhì)量濃度/（μg/mL）。樣品中總酚含量（以沒食子酸當(dāng)量計）計算如公式（1）所示。

式中：為樣品液中多酚的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；為稀釋倍數(shù)；為樣品液總體積/mL；為樣品質(zhì)量/g。

1.3.4 分子質(zhì)量相關(guān)參數(shù)的測定

用流動相（0.1 mol/L NaNO和質(zhì)量分數(shù)0.02%NaN）溶解制備質(zhì)量濃度1 mg/mL PFP及其衍生物溶液，0.22 μm鋁膜過濾后取100 μL注入HPSEC系統(tǒng)分析，該系統(tǒng)配備MALLS檢測器和示差折射（differential refractive index detector，DRI）檢測器，串聯(lián)一支保護管柱和兩支分析管柱，分別為ShodexOHpak SB-G 6B（500 mm×6 mm，10 μm）、SB-805 HQ（300 mm×8 mm，13 μm）和SB-803 HQ（300 mm×8 mm，6 μm），在40 ℃下以流速0.6 mL/min洗脫80 min；折射率增量（d/d）設(shè)置為0.145 mL/g，并采用ASTRA 7.1.3軟件進行數(shù)據(jù)采集、處理和分析。

果膠大分子的構(gòu)象表征通過Mark-Houwink-Sakurada（MHS）方程（式（2））和非均向性構(gòu)型參數(shù)＝/來表示，與分子鏈構(gòu)象的剛性和硬度呈正比，指數(shù)＜0.775、1.5～1.8和＞2分別表示構(gòu)象為緊密的球狀、柔軟的無規(guī)則線狀和伸展性分子，其中和分別通過Flory-Fox公式（式（3））和Einstein-Simha公式（式（4））計算得出。

式中：[]為特性黏度/（dL/g）；為聚合物-溶劑交互作用參數(shù)/（mL/g）；為果膠的摩爾質(zhì)量/（g/mol）；為構(gòu)形參數(shù)；與均與聚合物構(gòu)象有關(guān)，指數(shù)＞1.4、0.8～1.4、0.5～0.8和0.2～0.5和0.0時，分子構(gòu)象分別為硬桿狀、剛性桿狀、半柔性線圈、無規(guī)則線圈和球狀球體或高度支鏈；為環(huán)動半徑/nm；是Flory-Fox參數(shù)（約為2.6×10kg，無規(guī)則線圈狀聚合物分子），與鏈的剛性有關(guān)；為水合動態(tài)半徑/nm；是阿伏伽德羅常數(shù)（6.02×10mol）。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜測定

采用KBr壓片法，分別將2 mg凍干果膠及其衍生物粉與100 mg KBr置于瑪瑙研缽中研磨壓片制成直徑7 mm的薄片，使用傅里葉變換紅外光譜儀對其進行測定，以空氣作為背景，掃描范圍4 000～400 cm，掃描次數(shù)64 次，分辨率16 cm，使用Omnic軟件進行數(shù)據(jù)采集和分析。

1.3.6 微觀結(jié)構(gòu)觀察

將PFP和4 種衍生物磨成粉末狀，然后取適量粉末置于導(dǎo)電碳膠帶上，噴金處理，冷卻至常溫后用電子顯微鏡掃描，在放大100 倍和1 000 倍下觀察果膠及其衍生物的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.7 DPPH自由基清除率測定

DPPH自由基清除率測定參照Brand-Williams等的實驗方法稍作修改。將2.0 mL新鮮配制的DPPH溶液分別與2.0 mL不同質(zhì)量濃度的果膠及其衍生物溶液（質(zhì)量濃度0～2 mg/mL）充分混勻，室溫避光反應(yīng)30 min后，以體積分數(shù)80%乙醇溶液調(diào)零，在517 nm波長處測定吸光度，以VC為陽性對照，按照公式（5）計算DPPH自由基清除率。

式中：為空白對照（體積分數(shù)80%乙醇溶液代替樣品或VC）的吸光度；為DPPH溶液與樣品或陽性對照VC的吸光度；為體積分數(shù)80%乙醇溶液代替DPPH溶液的吸光度。

1.3.8 超氧陰離子自由基清除率測定

超氧陰離子自由基清除率測定參照Fridovich的實驗方法稍作修改。將1.0 mL樣品溶液（質(zhì)量濃度0～2 mg/mL）、1.0 mL 108 μmol/L氯化硝基四氮唑藍和1.0 mL 468 μmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液混合，混合均勻后加入1.0 mL 60 μmol/L吩嗪硫酸甲酯溶液，將上述混合好的溶液室溫下靜置5 min，在560 nm波長處測定吸光度，以上溶液均用Tris-HCl緩沖液（16 mmol/L、pH 8.0）配制，以VC為陽性對照，按照公式（6）計算超氧陰離子自由基清除率。

式中：為空白對照（Tris-HCl緩沖液代替樣品或VC）的吸光度；為顯色體系與樣品或陽性對照VC的吸光度；為緩沖液與樣品或VC的吸光度。

1.3.9 羥自由基清除率測定

羥自由基清除率測定參照Smirnoff等的實驗方法稍作修改。將0.6 mL 6 mmol/L FeSO·7HO溶液與2.0 mL果膠及其衍生物溶液（質(zhì)量濃度0～2 mg/mL）分別混勻后，加入0.6 mL 6 mmol/L的HO溶液，充分混勻后反應(yīng)10 min，再向各管加入0.6 mL 6 mmol/L水楊酸-無水乙醇溶液，將各管中的溶液充分混合反應(yīng)10 min，在510 nm波長處測定吸光度，以VC為陽性對照，按公式（7）計算羥自由基清除率。

式中：為空白對照（蒸餾水代替樣品或VC）的吸光度；為顯色體系與樣品或陽性對照VC的吸光度；為蒸餾水代替HO溶液的吸光度。

1.3.10 Fe螯合率測定

Fe螯合率測定參照Dinis等的實驗方法稍作修改。將1 mL不同質(zhì)量濃度（0～2 mg/mL）的果膠及其衍生物溶液和0.1 mL 2 mmol/L FeCl溶液、0.2 mL 5 mmol/L啡啰嗪-鈉鹽溶液混合，用3.7 mL蒸餾水補至5 mL混勻。將上述混合好的溶液在室溫條件下進行孵育10 min，在560 nm波長處測定吸光度?？瞻讓φ战M為蒸餾水，乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetra-acetic acid disodium salt，EDTA-2Na）為陽性對照，按公式（8）計算Fe螯合率。

式中：為空白對照（蒸餾水代替樣品或EDTA-2Na）的吸光度；為樣品與顯色體系的吸光度。

1.3.11 總還原力測定

總還原力測定參照Benzie等的方法稍作修改。取2 mL不同質(zhì)量濃度（0.1～2.0 mg/mL）的樣品，加入pH 6.6的0.2 mol/L磷酸緩沖液和質(zhì)量分數(shù)1%鐵氰化鉀溶液各2 mL，混勻，50 ℃水浴反應(yīng)20 min，然后迅速冷卻，添加2 mL質(zhì)量分數(shù)10%的三氯乙酸溶液，然后將上述的混合液振蕩使其均勻，3 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL去離子水和1 mL質(zhì)量分數(shù)0.1%的三氯化鐵溶液，靜置10 min后在700 nm波長處測定吸光度，吸光度的大小直接反映還原性的強弱，以VC作陽性對照。

1.3.12 小鼠巨噬細胞RAW264.7培養(yǎng)

將小鼠巨噬細胞RAW264.7培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和質(zhì)量濃度100 g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、含有5% CO和95%空氣的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)約24 h（傳代一次），以保持細胞處在對數(shù)生長期。

1.3.13 小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7增殖活性的測定

采用MTT法分析百香果果膠及其衍生物對小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7活力的影響。取對數(shù)生長期的細胞以2×10個/mL接種于96 孔板中，細胞培養(yǎng)24 h后，移去上清液，加入100 μL不同質(zhì)量濃度（0.2～1.0 mg/mL）的果膠、果膠衍生物溶液或100 μL 0.001 mg/mL脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）溶液（陽性對照），將小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7培養(yǎng)24 h，然后向每孔加入20 μL質(zhì)量濃度5 mg/mL MTT溶液，經(jīng)過孵育4 h后，將96 孔板中所有的液體移除，然后使用冷的磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.4）清洗2 次，之后向每孔中加入150 μL二甲基亞砜溶劑，在微孔板振蕩器上振蕩混勻持續(xù)10 min，酶標儀測定570 nm波長處的吸光度。按公式（9）計算細胞存活率。

式中：為果膠及其衍生物在570 nm波長處的吸光度；為空白組（磷酸鹽緩沖液）在570 nm波長處的吸光度。

1.3.14 小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7 NO分泌量的測定

采用Griess法測定果膠及其衍生物對巨噬細胞RAW264.7NO生成量的影響。取對數(shù)生長期的細胞以2×10個/mL接種于96 孔板中，細胞培養(yǎng)24 h后，吸取50 μL上清液加入至新的96 孔板中，加入100 μL不同質(zhì)量濃度（0.2～1.0 mg/mL）的果膠、果膠衍生物溶液或100 μL 0.001 mg/mL LPS溶液（陽性對照），空白組為0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液代替果膠溶液樣品，在室溫下向96 孔板中分別加入50 μL的Griess試劑I和試劑II，緩慢混合均勻，用酶標儀測定540 nm波長處的吸光度。根據(jù)試劑盒的使用方法，繪制NO濃度標準曲線（＝0.005 5+0.056 7，＝0.999 2，其中為，為NO濃度/（μmol/L），測定NO濃度范圍0～100 μmol/L），并計算NO的濃度。

1.3.15 小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7吞噬能力的測定

采用中性紅吞噬實驗法來評價果膠及其衍生物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響。取對數(shù)生長期的細胞以2×10個/mL接種于96 孔板中，將巨噬細胞RAW264.7培養(yǎng)24 h，去除96 孔板中的上清液，加入100 μL不同質(zhì)量濃度（0.2～1.0 mg/mL）的果膠、果膠衍生物溶液或100 μL質(zhì)量濃度0.001 mg/mL LPS溶液（陽性對照），細胞培養(yǎng)24 h后，之后向96 孔板中分別加入100 μL質(zhì)量濃度1 mg/mL中性紅生理鹽水，將上述混合液孵育30 min，然后將96 孔板中的上清液去除，為了去除殘余的中性紅試劑，需要用冷的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3 遍，然后向96 孔板中分別加入100 μL的細胞裂解液，將混合的溶液室溫下靜置2 h，等到96 孔板中的細胞溶解之后，利用酶標儀測定540 nm波長處的吸光度。按公式（10）計算吞噬能力。

式中：為果膠及其衍生物的吸光度；為空白（磷酸鹽緩沖液）的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。顯著性差異分析用SPSS Statistics 24.0軟件通過Duncan法進行多重比較確定，＜0.05時表示具有顯著性差異。用OriginPro 2021b軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠提取物PFP及其衍生物的總酚含量分析

表1顯示PFP的總酚含量為3.66 mg/g，只加漆酶的樣品PFP-L總酚含量顯著降至2.38 mg/g（＜0.05），可能因為漆酶是多酚氧化酶，與酚酸作用后，酚酸被氧化為酚氧自由基，進而氧化形成半醌類物質(zhì)，因此PFP的總酚含量顯著降低。PFP-酚酸衍生物中，PFP-L-CA的總酚含量最高（12.29 mg/g）（衍生率約5.8%），其次為PFP-LFA（11.07 mg/g）（衍生率約6.2%），顯著高于PFP-L-VC（4.68 mg/g）、PFP和PFP-L（＜0.05）。故可推知有大量的FA和CA存在于PFP衍生物上。PFP-L-FA和PFP-L-CA的總酚含量略高于柑橘低酯果膠-咖啡酸交聯(lián)物（citrus low-methoxyl pectin-caffeic acid conjugate，CLP-CaA）的總酚含量（9.6 mg/g）。PFP的總酚含量略高于低溫（50 ℃）水萃取的百香果高酯果膠（DE 57%）的總酚含量（0.71 mg/g）和低酯/高酯柑橘果膠（分別為1.20 mg/g和1.77 mg/g），但低于酸提與汽爆提取的百香果高酯果膠（分別為8.96 mg/g和18.82 mg/g），這可能與果膠的提取方式、DE和種類不同相關(guān)。

表1 果膠提取物PFP及其衍生物的總酚含量Table 1 Total phenolic contents of PFP and its derivatives

2.2 果膠及其衍生物的分子質(zhì)量及構(gòu)象表征分析

圖1為果膠及其衍生物（PFP-L、PFP-L-FA、PFP-L-CA和PFP-L-VC）在0.1 mol/L硝酸鈉溶液中分子質(zhì)量分布的HPSEC-MALLS色譜圖。圖1A顯示PFP的分子分布，其中折射指數(shù)（refractive index，RI）信號（信號幅度與樣品濃度成正比）顯示單一分子分布，出峰時間在19～28 min之間，而光散射（light scattering，LS）信號（與分子粒徑和濃度成正比）呈雙峰（20.5 min和24 min），顯示有兩種分子構(gòu)型密度或粒徑存在。只添加漆酶的PFP-L（圖1B）的果膠分子的主峰尖峰時間（24 min）與PFP相似，但大粒徑尖峰（LS在20.5min處的肩峰）信號幅值減小，26 min處增加的小粒子肩峰表明PFP分子粒徑或構(gòu)型被部分修飾，而35 min處小尖峰為漆酶的信號峰。PFP-L-FA（圖1C）和PFP-L-CA（圖1D）皆呈現(xiàn)果膠分子LS信號的主尖峰尖銳化且尖峰時間前移到20.5 min，其中PFP-L-FA的大粒徑信號（18 min）幅值減小，明顯增加了小粒徑肩峰（24 min）。PFP-L-VC（圖1E）主尖峰尖銳化且整體出峰時間延后（即分子質(zhì)量和粒徑減?。┣页霈F(xiàn)新的小粒徑區(qū)域組分（33 min），顯示果膠分子部分水解。

圖1 PFP（A）、PFP-L（B）、PFP-L-FA（C）、PFP-L-CA（D）和PFP-L-VC（E）分子分布的HPSEC色譜圖Fig. 1 HPSEC chromatograms for molecular mass distributions of PFP (A), PFP-L (B), PFP-L-FA (C), PFP-L-CA (D), and PFP-L-VC (E)

表2顯示PFP及其衍生物的分子質(zhì)量參數(shù)，PFP的平均重均分子質(zhì)量（）為190.5 kDa，平均數(shù)均分子質(zhì)量（）為175.1 kDa，平均多分散性指數(shù)（polydispersity index，PDI）（PDI＝/）為1.09，固有黏度[]平均為6.09 dL/g，MHS關(guān)系式的參數(shù)＝0.017 mL/g、＝0.875；而假設(shè)果膠分子在0.1 mol/L硝酸鈉溶液中為球狀，將上述和[]值代入Flory-Fox和Einstein-Simha公式，所得平均環(huán)動半徑為44.5 nm、平均水合動態(tài)半徑為25.62 nm、非均向性構(gòu)型參數(shù)為1.74。與PFP比較，PFP-L的、、PDI、[]、和均明顯降低，構(gòu)型參數(shù)和值略降低但仍接近PFP的構(gòu)型參數(shù)；PFP-L-FA的和變化不明顯，明顯降低至19.52 nm，但PFP-L-CA的和均明顯增加，明顯升高至25.95 nm，兩者的PDI、[]、值、以及值均明顯降低，分別降至1.06和1.03、2.77 dL/g和4.65 dL/g、0.393和0.265、28.3 nm和34.0 nm及1.45和1.31。PLP-L-VC的和降至不到PFP的一半，伴隨[]、值、以及大幅降低，分別降至0.97 dL/g、0.290、27.4 nm和10.84 nm；而PDI和值明顯增加，分別為1.14和2.53。整體上，MHS參數(shù)的值隨值降低而增加。

表2 果膠提取物PFP及其衍生物的分子鏈特征Table 2 Molecular chain characteristics of PFP and its derivatives

綜上，CA衍生會促使PFP果膠的分子質(zhì)量增加，而FA衍生對分子質(zhì)量無明顯影響，兩種果膠衍生物的分子粒徑相關(guān)的參數(shù)（[]、和值）與構(gòu)型參數(shù)（值和值）均明顯降低。在0.1 mol/L的硝酸鈉溶液中，PFP和PFP-L（值分別為0.875和0.827）呈剛性短桿狀（值0.8～1.4），但PFP的環(huán)動半徑和非均向性構(gòu)型參數(shù)值較大，顯示鏈段較硬些。PFP-L-FA和PFP-L-CA衍生物（值分別為0.393和0.265）呈無規(guī)則線圈狀構(gòu)型（值0.2～0.5），其值＜1.5顯示分子構(gòu)型均向性較高、偏向柔軟的無規(guī)則線狀鏈。PFP-L-VC的分子質(zhì)量與分子粒徑相關(guān)的參數(shù)大幅降低，但值大幅增加到2.53，表明鏈段比PFP更剛硬，可能是VC導(dǎo)致果膠分子（尤其是中性糖分支）部分水解后，伸展性較高的HG鏈段占比增加所致。

與商業(yè)CLP（＝226 kDa、PDI＝2.62、[]＝2.23 d L/g、＝0.436、＝0.552、＝38.9 nm、＝16.35 nm、＝2.38）相比較，本研究PFP的、PDI、和值較低，而[]、值、及較高，顯示PFP比CLP有較均一的分子質(zhì)量分布、較大的分子粒徑、較剛硬又較均向的分子鏈段。PFP-L-CA與同樣是漆酶催化的CLP-CaA（＝271 kDa、PDI＝2.38、[]＝1.83 dL/g、＝0.479、＝0.524、＝30.6 nm、＝16.24 nm、＝1.88）發(fā)生的分子性質(zhì)變化極為相似，均為分子質(zhì)量與增加，伴隨PDI、[]、值、和值減小，且無明顯變化。不同的是，PFP-L-Ca的和值的變化程度相當(dāng)大，但CLP-CaA變化程度相當(dāng)小。綜上，酚酸（FA、CA、CaA）衍生或不影響或增加果膠衍生物分子質(zhì)量，但會修飾衍生物的分子構(gòu)型使分子體積/粒徑減小、鏈段較柔軟、分子構(gòu)型呈更緊密的無規(guī)則卷曲線圈狀。漆酶催化合成果膠-酚酸衍生物不會發(fā)生降解現(xiàn)象，增稠和凝膠特性優(yōu)于VC衍生物和化學(xué)衍生的阿拉伯木聚糖-兒茶素，后兩者在衍生后分子質(zhì)量降低，會損失增稠和凝膠特性。

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析

圖2為衍生前后果膠的傅里葉變換紅外光譜圖，果膠PFP在3 446 cm處附近的寬峰為O-H的伸縮振動所引起，為糖類的特征吸收峰。在2 932 cm處為多糖C-H鍵的伸縮振動所引起；1 747 cm和1 641 cm處的伸縮振動分別對應(yīng)于甲酯化和游離羧基中的C＝O鍵的拉伸振動信號；1 437 cm處是COO的不對稱伸縮振動吸收峰；1 385 cm和1 242 cm處是C-H伸縮振動吸收峰；1 110 cm和1 023 cm處的吸收峰與糖環(huán)和側(cè)鏈上的C-C-O拉伸振動有關(guān)，為GalA的特征信號；1 200～800 cm波數(shù)之間的光譜被認為是碳水化合物的“指紋”區(qū)域。和PFP相比，PFP-L的吸收峰位置和峰面積無明顯變化；然而衍生物在1 625 cm附近處的峰面積明顯減小，1 739 cm附近處的峰面積明顯增加，此結(jié)果表明衍生物發(fā)生了羧基酯化現(xiàn)象，類似CLP-FA或CLP-CaA、白蘿卜果膠-FA以及羧基化可得然膠-FA衍生物的情形，其特征峰變化在1 519 cm或1 518 cm（CaA或FA）和1 616 cm或1 732 cm（分別為自由或酯化羧基）處，表明酚酸極可能通過酯鍵結(jié)合到果膠的羧基上。PFP-L-VC為無酚氧化成醌類并鍵結(jié)的參考組，圖譜與PFP-L相似。

圖2 果膠提取物PFP及其衍生物的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of PFP and its derivatives

2.4 果膠提取物PFP及其衍生物的微觀形態(tài)分析

圖3顯示果膠PFP及其衍生物的干燥粉粒的微觀形態(tài)。PFP在放大100 倍下（圖3A）呈現(xiàn)不規(guī)則形狀的碎片與顆粒，在放大1 000 倍下（圖3A）清楚可見這些碎片黏附緊密。PFP-L在放大100 倍下（圖3B）表面呈現(xiàn)出松散的不規(guī)則絮狀碎片，在放大1 000 倍下（圖3B）碎片顯得松散且部分卷曲。PFP-L-FA在放大100 倍下（圖3C）呈光滑的大片折疊、松散并稍微卷曲，放大1 000 倍下（圖3C）片狀非常光滑。PFP-L-CA（圖3D）和PFP-L-VC（圖3E）在放大100 倍下都呈現(xiàn)不規(guī)則長條的絮狀片，介于PFP-L和PFP-L-FA的中間混合形態(tài)。以放大1 000 倍觀之，PFP-L-CA（圖3D）的絮狀片呈不規(guī)則的斷層狀，而PFP-L-VC（圖3E）絮片呈大片折疊且平整光滑。顯然，百香果皮果膠經(jīng)過添加漆酶和酚酸衍生和VC作用后，粉粒的微觀結(jié)構(gòu)會明顯改變，呈松散且大片絮狀化。此現(xiàn)象與CLP-CaA干燥膜的結(jié)構(gòu)呈絮狀片且比CLP松散的現(xiàn)象一致。

圖3 果膠提取物PFP及其衍生物的微觀形態(tài)Fig. 3 Scanning electron micrographs of PFP and its derivatives

2.5 果膠提取物PFP及其衍生物的體外抗氧化活性分析

圖4顯示PFP及其酚酸衍生物對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除率以及Fe螯合率和總還原力均呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。圖4A說明質(zhì)量濃度0.1～2.0 mg/mL的PFP對DPPH自由基的清除率達到18%～27%，與PFP-L接近。質(zhì)量濃度1.5～2.0 mg/mL的PFP-L-CA DPPH自由基清除率高達65%～70%，約達到VC的70%（陽性對照）。然而，與PFP相比，PFP-L-FA和PFP-L-VC在所研究的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)DPPH自由基清除率明顯較低。對于超氧陰離子自由基的清除率（圖4B），PFP-L-CA和PFP-L-FA的清除率隨著質(zhì)量濃度（1～2 mg/mL）增加而升高，與PFP相比明顯升高，在質(zhì)量濃度2.0 mg/mL時均達到100%，與VC的清除率接近。質(zhì)量濃度0.1～2.0 mg/mL PFP的超氧陰離子自由基清除率（40%～50%）在所有樣品中處于中等水平，且PFP-L和PFP-L-VC的超氧陰離子自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的提高平穩(wěn)增加，在質(zhì)量濃度2.0 mg/mL時達到約50%，與PFP相同。超氧陰離子自由基清除率對所有樣品都表現(xiàn)出明確的濃度依賴性。對于羥自由基的清除能力（圖4C），所有改性果膠，尤其是PFP-L-FA，在質(zhì)量濃度0.1～2.0 mg/mL時清除率為40%～78%，明顯高于PFP（15%～40%），且呈樣品濃度依賴性。與PFP相比，所有改性果膠都顯示出Fe螯合能力（圖4D）和還原能力（圖4E）增強。

圖4 果膠提取物PFP及其酚酸衍生物的抗氧化活性Fig. 4 Antioxidant activities of PFP and its derivatives with phenolic acids

本研究發(fā)現(xiàn)CA和FA的衍生作用可賦予果膠更強的體外抗氧化活性，能明顯提高超氧陰離子自由基和羥自由基的清除率。以半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC）評價抗氧化活性，從DPPH自由基清除率方面考量，PFP-L-CA的抗氧化活性（IC＝1.4 mg/mL）高于PFP-L-FA，略高于化學(xué)衍生的CHP-兒茶素或蘆丁衍生物（IC＝1.6～1.8 mg/mL），與果膠-FA衍生物及羧基可得然膠-FA衍生物（兩者IC均為1.4 mg/mL）相同，略低于CLP-CaA和化學(xué)衍生的CHP-槲皮素衍生物（兩者均IC＝0.8 mg/mL）。對超氧陰離子自由基清除率的抗氧化活性方面，PFP-L-FA抗氧化活性（IC＝0.45 mg/mL）高于PFP-L-CA、CLP-CaA與化學(xué)法衍生得到的殼聚糖-FA（綜合IC＝0.7～0.8 mg/mL）。在羥自由基清除率的抗氧化活性方面，PFP-L-FA的抗氧化活性（IC＝1.0 mg/mL）高于PFPL-CA（IC＝1.5 mg/mL），略低于CLP-CaA（IC＝0.92 mg/mL），低于殼聚糖-FA衍生物（IC＝0.76 mg/mL）。PFP-L-FA和PFP-L-CA的Fe螯合率與還原力雖不高，但仍優(yōu)于PFP，與CLP-CaA的相似。

比較本研究和高凡等的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，天然低酯果膠CLP羥自由基清除力（IC＝2.0 mg/mL）優(yōu)于對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除力，且高于天然高酯果膠PFP，這可能與CLP含游離羧基較多有關(guān)。酚酸衍生處理明顯提高果膠衍生物的抗氧化活性，且CLP衍生物提升效果優(yōu)于PFP衍生物，超氧陰離子自由基清除率＞羥自由基清除率；對醇溶體系的DPPH自由基清除力的促進效果為PFP-L-CA和CLP-CaA作用明顯，而PFP-L-FA作用不明顯；但FA衍生對水溶液體系的超氧陰離子自由基和羥自由基清除力的抗氧化活性促進效果優(yōu)于CA衍生。由于總酚含量在上述樣品中相差不多（PFP-L-FA總酚含量11.07 mg/g、PFP-L-CA總酚含量12.29 mg/g、CLP-CaA總酚含量9.6 mg/g），說明酚酸結(jié)構(gòu)對抗氧化活性有重要的影響，可能是因為CaA、CA和FA都是羥基酚酸，只有在苯環(huán)上的官能團不同，CA有1 個羥基，CaA有2 個羥基，而FA有1 個羥基和1 個甲氧基。綜上，酚酸衍生可提高果膠的抗氧化活性，提高的效率主要隨酚酸結(jié)構(gòu)、衍生程度（或總酚含量）及自由基種類而異，其次受果膠的結(jié)構(gòu)特性影響。

2.6 膠提取物PFP及其衍生物的體外免疫活性分析

圖5A顯示，質(zhì)量濃度0.2～1.0 mg/mL PFP及其衍生物處理后，RAW264.7細胞存活率大都維持在85%～110%，樣品組間的差異不顯著（＞0.05），與0.001 mg/mL LPS處理組相比，除0.8～1.0 mg/mL PFP-L-CA處理組細胞存活率顯著降低外，其他組比無顯著變化（＞0.05）。說明在所探討的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)PFP果膠及其酚酸衍生物（0.8～1.0 mg/mL PFP-L-CA除外）對RAW264.7細胞無顯著抑制作用（＞0.05）。在RAW264.7細胞對中性紅的吞噬能力方面（圖5B），所有樣品刺激的細胞吞噬能力都有濃度依賴性。與LPS處理組相比，質(zhì)量濃度0.2～1.0 mg/mL PFP及0.2 mg/mL PFP-L處理會高度顯著降低細胞吞噬能力（＜0.001）；而0.6～0.8 mg/mL PFP-L、0.4～1.0 mg/mL PFP-L-FA、0.4～1.0 mg/mL PFP-L-CA和0.8～1.0 mg/mL PFP-L-VC處理會顯著促進細胞吞噬能力（＜0.05、＜0.001），酚酸（FA和CA）衍生組細胞吞噬能力最高達118%。在刺激RAW264.7細胞分泌NO方面（圖5C），大部分樣品刺激NO分泌量都有濃度依賴性。和空白組相比，0.2～1.0 mg/mL PFP處理組的NO生成量差異不顯著（＞0.05）；0.2～0.6 mg/mL PFP-L、0.4～0.6 mg/mL PFP-L-FA、0.4～0.8 mg/mL PFP-L-CA和0.2～0.8 mg/mL PFP-L-VC處理組的NO生成量顯著增加（＜0.05、＜0.01、＜0.001），且PFP-L、PFP-L-FA和PFP-L-CA的刺激效果相似，在0.6～0.8 mg/mL質(zhì)量濃度下刺激的NO生成量達最大（36～42 μmol/L），相當(dāng)于0.001 mg/mL LPS組的72%～85%。說明過高劑量（質(zhì)量濃度0.8～1.0 mg/mL）反而降低NO生成量，抑制免疫活性。

圖5 小鼠巨噬細胞RAW264.7模型中果膠提取物PFP及其衍生物的免疫活性Fig. 5 Immunostimulatory activities of PFP and its derivatives in murine macrophage line RAW264.7

綜上，添加漆酶與酚酸衍生的PFP具有顯著增強體外免疫活性的作用，刺激RAW264.7細胞的吞噬和NO生成，酚酸（FA和CA）衍生物的活化作用比VC衍生組高。其免疫活性具有濃度依賴性，可能與酚酸和漆酶的存在有關(guān)，與樣品的總酚含量（表1）和分子質(zhì)量（表2）的變化無關(guān)。相比于具有免疫活性的RG-I區(qū)域組分類果膠或富含阿拉伯半乳聚糖的區(qū)域組分類多糖，果膠-酚酸衍生物因制備過程簡單、成本低、綠色環(huán)保，并且仍具有果膠原本功能性（如凝膠、增稠、穩(wěn)定性）等特點，故更具有研發(fā)與應(yīng)用優(yōu)勢。

3 結(jié) 論

本研究主要分析了PFP及其CA與FA衍生物的分子特性和紅外光譜差異，并研究了酚酸結(jié)構(gòu)對PFP衍生物抗氧化活性和免疫活性的貢獻差異關(guān)系。結(jié)果表明酚酸衍生可使PFP-L-FA和PFP-L-CA的總酚含量分別顯著提高至11.07 mg/g和12.29 mg/g；分子性質(zhì)方面，PFP-L-CA的提升至256.5 kDa，而PLP-L-FA的無明顯變化（187.8 kDa），且兩者的分子構(gòu)象均由PFP的剛性短桿狀變?yōu)殒湺屋^柔軟的無規(guī)則線圈狀；紅外光譜顯示衍生物分別在1 625 cm和1 739 cm的峰面積減少和增加均證明了酚酸通過酯鍵與PFP共價接枝，且衍生物粉粒的微觀結(jié)構(gòu)趨于松散和絮狀化。此外，CA與FA衍生物的體外抗氧化活性（羥自由基、超氧陰離子自由基清除率和總還原力）和細胞免疫活性顯著增強，體現(xiàn)在小鼠巨噬細胞NO生成量的增加和中性紅吞噬能力的提升。綜上，本研究所制備PFP酚酸（CA與FA）衍生物具有活性膳食纖維和保健食品的應(yīng)用前景，研究為改性果膠的商業(yè)化應(yīng)用提供理論參考，未來研究可詳細解析衍生果膠與生物活性（如免疫和抗癌）的構(gòu)效關(guān)系、機理、流變特性與加工穩(wěn)定性。