自溶對(duì)雙孢菇多糖體外抗氧化和抗腫瘤活性的影響

孫曉燕，郭 慧，余君彤，張廣文，彭喜春

（暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東 廣州 510000）

在食用菌中，雙孢菇（）是世界上種植最廣泛也是消費(fèi)最廣泛的品種，被認(rèn)為是一種重要的食用蘑菇，其具有高蛋白、低脂肪以及豐富的維生素和多糖。新鮮的雙孢菇在貯存過程中會(huì)發(fā)生自溶，釋放一些內(nèi)源性酶來分解雙孢菇多糖（polysaccharides，ABP），降解后的多糖具有不同的生物學(xué)活性。ABP是雙孢菇中的主要生物活性化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖和免疫調(diào)節(jié)的功能。用各種溶劑萃取的不同ABP均表現(xiàn)出強(qiáng)大的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和超氧化物清除能力、金屬螯合能力和還原能力。Jeong等報(bào)道了ABP組分能抑制人乳腺癌細(xì)胞和鼠肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。Zhang Yanqing等證實(shí)ABP可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖并改善脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，說明ABP具有良好的免疫調(diào)節(jié)能力。

分子質(zhì)量、溶解度、構(gòu)象和化學(xué)修飾對(duì)于多糖的活性至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，并非所有天然多糖都具有生物活性。改變多糖的分子質(zhì)量可以增強(qiáng)其生物活性，酶法修飾是改變多糖分子質(zhì)量的主要方法之一，通過酶催化多糖主鏈降解，使其分子質(zhì)量降低。其中，內(nèi)源性和外源性酶在多糖結(jié)構(gòu)中起著重要作用。

目前的研究認(rèn)為引起食用菌菌體自溶的主要原因有兩個(gè)：第一是細(xì)菌作用于菌體組織引起自溶；第二是菌體組織內(nèi)的自溶酶引起自溶。食用菌自溶過程中，細(xì)胞壁及細(xì)胞膜被破壞，一旦膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞器的獨(dú)立性被打破，其自身的酶被釋放出來，與底物相互接觸，迅速發(fā)生酶促反應(yīng)。自溶酶引起的自溶與微生物的繁殖是相互促進(jìn)關(guān)系，自溶導(dǎo)致組織發(fā)生破壞，汁液外流，引起微生物的大量繁殖，微生物的繁殖又進(jìn)一步促進(jìn)自溶過程。雙胞菇子實(shí)體由于含水量較高，組織十分細(xì)嫩，且菌蓋表面沒有明顯的保護(hù)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其易受病菌侵染和機(jī)械損傷等而發(fā)生自溶。自溶過程中雙胞菇細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等發(fā)生破裂，其自身的蛋白酶、聚糖酶及核酸等水解酶等被釋放出來，將自身的蛋白、多糖及核酸降解，導(dǎo)致多糖等大分子物質(zhì)的分子質(zhì)量及聚合度等發(fā)生變化。自溶過程受到溫度、自溶時(shí)間等的影響。

目前，微生物自溶作用的研究主要集中在酵母和霉菌屬，酵母的自溶作用已在啤酒生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。然而，雙孢菇菌體自溶是引起其采后損傷的主要原因，嚴(yán)重影響其食用品質(zhì)和產(chǎn)品價(jià)值，可能帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其自溶后活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化尚未得到深入的研究，尤其是多糖成分。因此，對(duì)雙孢菇自溶后多糖生物活性的研究有利于促進(jìn)雙孢菇的利用，提高其商業(yè)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以ABP為研究對(duì)象，探究自溶對(duì)ABP體外抗氧化和抗腫瘤活性的影響，以期為ABP的利用提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢菇購自廣州市天河區(qū)石牌蔬菜市場(chǎng)。

人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞株和人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株由中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫提供。

鐵氰化鉀 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸、水楊酸 天津大茂化學(xué)試劑廠；DPPH 東京化成工業(yè)株式會(huì)社；CCK-8試劑盒 美國Abmole Bioscience公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品（包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、巖藻糖、木糖、核糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸） 上海源葉生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1140電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DGX-9053B-1電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；4111水套式二氧化碳培養(yǎng)箱、UV-2600紫外全波段掃描儀、NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計(jì)、Countess II細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher公司；HH-4恒溫水浴鍋 江蘇金壇宏華儀器廠；GR60DR全自動(dòng)高壓滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；GT16-3臺(tái)式離心機(jī) 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；Axio Vert.A1倒置熒光顯微鏡 德國Carl Zeiss公司；DBS-100自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠；2424蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）泵 美國Waters公司；1200 HPLC儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 雙孢菇的自溶作用和粗多糖的提取

實(shí)驗(yàn)分3 組，分別為空白組（不自溶）、45 ℃自溶組和50 ℃自溶組。將雙孢蘑菇切碎后，加3 倍體積超純水勻漿。調(diào)節(jié)pH值至6.5，使其在45 ℃下自溶4、8、12、16 h，在50 ℃下自溶4、8 h和12 h。每個(gè)條件制備4 個(gè)平行樣品。自溶后100 ℃加熱10 min使酶失活。采用熱水浸提法提取多糖，100 ℃浸提兩次，每次2 h，通過雙層紗布過濾和真空抽濾收集粗多糖。將濾液濃縮至其原始體積的1/3備用。

1.3.2 多糖的制備

調(diào)節(jié)各組粗多糖溶液質(zhì)量濃度均為25 mg/mL。在各組多糖溶液加入適量無水乙醇至溶液乙醇終體積分?jǐn)?shù)為70%，4 ℃靜置24 h，4 000 r/min離心15 min，得到70%乙醇醇沉的大分子多糖，用少量超純水溶解后得到大分子多糖溶液。取上清液加適量無水乙醇至溶液乙醇終體積分?jǐn)?shù)為80%，按照上述操作，進(jìn)一步沉淀上清液，得到中分子多糖溶液。最后取剩余上清液加適量無水乙醇至乙醇終體積分?jǐn)?shù)為90%，按照上述操作得到小分子多糖溶液。3 個(gè)組分分別命名為hABP---70、hABP---80和hABP---90，其中hABP表示自溶后的多糖組分，表示自溶溫度/℃，表示自溶時(shí)間/h。ABP-Con-70/80/90分別代表空白組（未經(jīng)過自溶的）多糖樣品的3 個(gè)不同分子質(zhì)量組分。將終質(zhì)量濃度為0.4 g/100 mL木瓜蛋白酶加入多糖溶液中，50 ℃酶解2 h，4 000 r/min離心15 min除去酶沉淀。使用Sevag試劑（（正丁醇）∶（氯仿）＝1∶5）去除蛋白質(zhì)。重復(fù)7 次Sevag試劑處理，直到完全去除白色絮狀物。將每個(gè)組分溶解在ddHO中，并用孔徑為0.22 μm的膜過濾，以除去細(xì)菌和雜質(zhì)，得到多糖溶液樣品。用蒽酮硫酸法測(cè)定每個(gè)樣品的多糖質(zhì)量濃度。以蒸餾水為對(duì)照，利用紫外全波段掃描儀在波長(zhǎng)范圍190～350 nm區(qū)間，設(shè)置掃描間距為1 nm，對(duì)多糖溶液進(jìn)行掃描，觀察除蛋白及核酸結(jié)果。

1.3.3 體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.3.1 還原能力的測(cè)定

化合物的抗氧化活性與其還原能力呈正相關(guān)，可以通過測(cè)定樣品的還原能力來反映抗氧化活性。鐵氰化鉀法是通過抗氧化劑將K[Fe(CN)]中Fe還原為Fe的原理來測(cè)定樣品的還原能力。樣品溶液稀釋至0.3 mg/mL，將1 mL樣品溶液與2.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL 1 g/100 mL K[Fe(CN)]溶液混合均勻，50 ℃水浴反應(yīng)20 min。迅速取出冷卻后加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液，混勻后3 500 r/min離心10 min。將3 mL上清液與0.6 mL 0.1% FeCl溶液和3 mL蒸餾水混合，并在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度，以此來表征還原能力。以蒸餾水作為空白對(duì)照，VC溶液作為陽性對(duì)照。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，其清除率被廣泛用于評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物的抗氧化活性。抗氧化劑可將紫色的DPPH自由基還原為黃色的非自由基形式，使溶液的吸光度降低。DPPH自由基清除率的測(cè)定采用Lagouri等報(bào)道的方法稍作修改。取1 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液和3 mL DPPH-乙醇溶液（60 μmol/L）混勻后室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以VC溶液作為陽性對(duì)照。通過式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：表示樣品溶液的吸光度；表示用無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液的吸光度；表示用蒸餾水代替樣品溶液的吸光度。

1.3.3.3 ABTS陽離子自由基清除率測(cè)定

2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力通常被認(rèn)為是評(píng)估樣品抗氧化活性的另一個(gè)指標(biāo)。ABTS與KSO溶液反應(yīng)形成藍(lán)綠色的ABTS陽離子溶液后，抗氧化活性物質(zhì)與ABTS陽離子溶液反應(yīng)導(dǎo)致顏色和吸光度發(fā)生變化，可以通過在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度來反映樣品的抗氧化能力。ABTS陽離子自由基清除能力的測(cè)定根據(jù)Miliauskas等的方法稍作改動(dòng)。首先制備ABTS母液：將3.848 g ABTS和0.662 g KSO溶于水后混合定容至1 L，使ABTS溶液終濃度為7 mmol/L、KSO溶液終濃度為2.45 mmol/L。在室溫下避光反應(yīng)12～16 h，得到ABTS母液。將ABTS母液用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.4，下同）稀釋，使其在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.70±0.02，得到ABTS工作液。將0.2 mL樣品溶液和3.8 mL ABTS工作液混勻在室溫下避光反應(yīng)6 min，并在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。VC作陽性對(duì)照。通過公式（2）計(jì)算ABTS陽離子自由基清除率。并計(jì)算清除50%自由基所需的樣品質(zhì)量濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC）。

式中：表示樣品溶液的吸光度；表示用蒸餾水代替ABTS工作液的吸光度；表示用蒸餾水代替樣品溶液的吸光度。

1.3.4 體外抗腫瘤活性測(cè)定

通過CCK-8法分析比較自溶前后雙孢菇不同多糖組分對(duì)HepG2及HeLa細(xì)胞的毒性作用。將多糖濃縮物稀釋至3 mg/mL后備用。HepG2和HeLa細(xì)胞在DMEM完全培養(yǎng)基（含10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）胎牛血清、1%青霉素鏈霉素溶液）中于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞接種到96 孔板上孵育24 h后，樣品組用10 μL ABP溶液處理腫瘤細(xì)胞24 h。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入等體積不含多糖樣品的細(xì)胞培養(yǎng)液）和空白組（加入等體積不含細(xì)胞的培養(yǎng)液），每個(gè)樣品設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，并用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞。隨后每孔加入100 μL含10% CCK-8的DMEM培養(yǎng)基孵育3 h。測(cè)定每個(gè)孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度，并通過公式（3）計(jì)算細(xì)胞活性抑制率。并計(jì)算半抑制濃度（the half maximal inhibitory concentration，IC），即細(xì)胞活性抑制率為50%時(shí)所需的樣品質(zhì)量濃度。

式中：、、分別代表樣品組、對(duì)照組和空白組的吸光度。

1.3.5 ABP的分離與純化

將ABP溶液稀釋至質(zhì)量濃度為3 mg/mL。取5 mL溶液通過0.45 μm濾膜過濾，將其沿著柱壁緩慢滴加到平衡好的DEAE-52纖維素離子柱（3.0 cm×40 cm）中分離樣品溶液中的hABP組分，依次用超純水和系列濃度的NaCl溶液（0.1、0.2、0.3 mol/L和0.5 mol/L）洗脫，流速為1.0 mL/min。濃縮并收集主要洗脫液成分，然后在Sephadex G-100葡聚糖凝膠色譜柱（3.0 cm×40 cm）上用超純水以0.5 mL/min的流速洗脫，收集多糖的洗脫組分，真空濃縮并透析。冷凍干燥備用。

1.3.6 ABP分子質(zhì)量的測(cè)定

依照Cui Wuwei等的方法通過高效尺寸排阻色譜（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）法測(cè)定hABP的分子質(zhì)量。色譜條件：選用TSKgel G5000PWXL、TSKgel G3000PWXL二柱串聯(lián)，同時(shí)配保護(hù)柱TSK PWXL Guard Column，以超純水作為流動(dòng)相等度洗脫，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light scattering detector，ELSD）漂移管溫度設(shè)置為100 ℃，流速為1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL，分析時(shí)間為50 min。校準(zhǔn)曲線繪制使用葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（分子質(zhì)量分別為1 000、5 000、12 000、50 000、150 000、270 000、670 000 Da）。根據(jù)已建立的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出各組分的分子質(zhì)量。

1.3.7 ABP的單糖組成分析

取0.2 mL 3 mg/mL樣品溶液于水解管中，加入4 mol/L三氟乙酸1 mL，于120 ℃烘箱中水解2 h。取出后，氮?dú)獯蹈?。向吹干后的樣品中? mL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methylpyrazole-5-one，PMP）-甲醇溶液以及0.5 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，70 ℃水浴60 min，冷卻，加入0.5 mL 0.3 mol/L HCl溶液和0.5 mL氯仿振蕩搖勻后靜置20 min，棄去下層，萃取3 次，取水層過膜通過HPLC分析。混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品用PMP標(biāo)記后以相同方法進(jìn)行HPLC分析。

色譜條件：SHISEIDO C柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；流動(dòng)相：A相為0.1 mol/L KHPO溶液（pH 6.8），B相為乙腈，A相與B相的體積比為82∶18；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)器波長(zhǎng)為250 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次以上。采用Origin 9.0軟件繪制圖形，SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及EC和IC的計(jì)算，各組數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用檢驗(yàn)，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 自溶對(duì)ABP聚合度的影響

如表1所示，與ABP-Con對(duì)比，45 ℃/50 ℃自溶后，70%乙醇醇沉得到的大分子多糖質(zhì)量濃度顯著下降；80%乙醇醇沉得到的中分子多糖質(zhì)量濃度顯著上升；90%乙醇醇沉得到的小分子多糖質(zhì)量濃度無顯著變化。推測(cè)雙孢蘑菇在45 ℃及50 ℃條件下自溶過程中，其大分子多糖發(fā)生了一定程度的降解，一部分降解為中分子多糖（80%乙醇醇沉），所以導(dǎo)致自溶后70%乙醇醇沉得到的大分子多糖含量顯著下降，中分子多糖可能降解成小分子多糖，但其發(fā)生降解的多糖含量總體少于大分子多糖降解所得到的中分子多糖含量，所以80%乙醇醇沉得到的中分子多糖質(zhì)量濃度顯著上升。

表1 不同自溶溫度、時(shí)間及不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉所得多糖質(zhì)量濃度Table 1 Concentrations of polysaccharides obtained by ethanol precipitation after different periods of autolysis at differenttemperatures mg/mL

在45 ℃/50 ℃條件下，自溶不同時(shí)間后得到的大分子多糖、中分子多糖和小分子多糖質(zhì)量濃度之間無顯著性差異。推測(cè)自溶過程中的降解主要發(fā)生在自溶的前4 h，4 h后內(nèi)源性酶無法進(jìn)一步降解ABP，或只能輕微降解，所以未造成自溶不同時(shí)間段間多糖含量的顯著性差異?？紤]到時(shí)間、人力、經(jīng)濟(jì)等成本，后續(xù)實(shí)驗(yàn)的自溶時(shí)間全部采用4 h。對(duì)自溶4 h的各組分進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見圖1，各組分在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處均無吸收峰，證明多糖中已不含蛋白質(zhì)和核酸。

圖1 雙孢菇大分子多糖（A）、中分子多糖（B）、小分子多糖（C）的紫外全波長(zhǎng)掃描光譜Fig. 1 UV absorption spectra of polysaccharide samples of large- (A),medium- (B), and small-molecular-mass polysaccharides (C) from Agaricus bisporus

2.2 自溶對(duì)ABP體外抗氧化活性的影響

2.2.1 ABP的還原能力

由圖2可知，與ABP-Con-90相比，hABP-45 ℃-90和hABP-50 ℃-90的還原能力顯著增加（＜0.05）。質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL時(shí)，相同自溶條件下70%乙醇醇沉得到的hABP還原能力最低，90%乙醇醇沉得到的hABP還原能力最高。

圖2 不同溫度自溶后hABP的還原能力Fig. 2 Reducing power of hydrolyzed ABP obtained after different periods of autolysis at different temperatures

2.2.2 DPPH自由基清除能力

不同質(zhì)量濃度的陽性對(duì)照VC溶液及自溶前后的ABP溶液對(duì)DPPH自由基清除率的影響如圖3所示，其EC如表2所示。在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各ABP對(duì)DPPH自由基都有較強(qiáng)的清除效果，且樣品的質(zhì)量濃度越大，對(duì)DPPH自由基的清除率越高。即所有ABP樣品清除DPPH自由基都存在劑量依賴關(guān)系，且所有樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力都不及VC強(qiáng)。從表2可以看出，自溶后小分子多糖中hABP-45 ℃、hABP-50 ℃的EC相比ABP-Con顯著減小，說明自溶后小分子多糖清除DPPH自由基的能力顯著增強(qiáng)；中分子多糖中ABP-50 ℃的EC顯著大于ABP-Con，ABP-45 ℃的EC略大于ABP-Con，說明50 ℃自溶后中分子多糖清除DPPH自由基的能力顯著減弱，45 ℃自溶后清除DPPH自由基的能力則無顯著變化；大分子多糖hABP-45 ℃的EC相比ABP-Con顯著減小，而hABP-50 ℃與ABP-Con相比無顯著差異，說明自溶45 ℃后大分子多糖清除DPPH自由基的能力顯著增強(qiáng)。綜上，45 ℃自溶4 h后的雙孢菇各多糖組分清除DPPH自由基的效果較未自溶時(shí)總體有所增強(qiáng)，50 ℃自溶4 h后的雙孢菇大分子多糖組分清除DPPH自由基的能力無明顯增強(qiáng)，且小、中分子多糖組分清除DPPH自由基能力也比45 ℃自溶4 h低。

圖3 雙孢菇大分子多糖（A）、中分子多糖（B）、小分子多糖（C）對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig. 3 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging capacity of large- (A), medium- (B), and small-molecular-mass polysaccharides (C)from Agaricus bisporus

表2 DPPH自由基清除活性的EC50Table 2 Concentration for 50% of maximal effect for 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging activity mg/mL

2.2.3 ABTS陽離子自由基清除活性

從圖4可以看出，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)各ABP對(duì)ABTS陽離子自由基都有較強(qiáng)的清除效果，且樣品的質(zhì)量濃度越大，對(duì)ABTS陽離子自由基的清除率越高。從表3可以看出，自溶后雙孢菇小分子多糖ABTS陽離子自由基清除能力顯著增強(qiáng)，自溶后中分子多糖ABTS陽離子自由基清除能力則顯著下降；45 ℃自溶后大分子多糖ABTS陽離子自由基清除能力顯著提高，而50 ℃自溶后大分子多糖清除能力反而顯著下降。

圖4 雙孢菇大分子多糖（A）、中分子多糖（B）、小分子多糖（C）對(duì)ABTS陽離子自由基的清除能力Fig. 4 2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) cation radical scavenging capacity of large- (A), medium- (B), and smallmolecular-mass polysaccharides (C) from Agaricus bisporus

表3 ABTS陽離子自由基清除活性的EC50Table 3 EC50 values for 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) cation radical scavenging activity mg/mL

2.3 自溶對(duì)ABP體外抗腫瘤活性影響

在9 種不同組分中，ABP-Con-70和hABP-45 ℃/50 ℃-70對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的抑制作用均較弱，抑制率低于15%（圖5），因此這3 個(gè)組分未在后續(xù)研究中繼續(xù)使用。由圖5可知，ABP-Con-80/90、hABP-45 ℃/50 ℃-80/90表現(xiàn)出對(duì)HepG2及HeLa細(xì)胞較強(qiáng)的抑制作用，抑制率均高于75%。如表4、5所示，自溶后，hABP-45 ℃/50 ℃-90對(duì)HeLa細(xì)胞抑制作用的IC顯著降低（＜0.05）；hABP-45 ℃-80、hABP-45 ℃/50 ℃-90對(duì)HepG2細(xì)胞的IC顯著降低（＜0.05）。綜合來看，自溶后hABP-45 ℃-90對(duì)HeLa和HepG2細(xì)胞具有最強(qiáng)的抑制活性。

圖5 各ABP對(duì)HeLa（A）、HepG2（B）細(xì)胞增殖的體外抑制作用Fig. 5 In vitro anti-proliferation effects of Agaricus bisporus polysaccharides on HeLa cells (A) and HepG2 cells (B)

表4 ABP對(duì)HeLa細(xì)胞體外抗增殖作用的IC50Table 4 IC50 values for in vitro anti-proliferation effects of Agaricus bisporus polysaccharides on HeLa cells mg/mL

表5 ABP對(duì)HepG2細(xì)胞的體外抗增殖作用的IC50Table 5 IC50 values for in vitro anti-proliferation effects of Agaricus bisporus polysaccharides on HepG2 cells mg/mL

2.4 ABP的分離純化結(jié)果

選擇具有良好抗氧化和抗腫瘤活性的組分hABP-45 ℃-80和hABP-45 ℃-90以及具有較差抗腫瘤活性的組分hABP-50 ℃-70進(jìn)行分離純化。所有組分分別通過纖維素DEAE-52陰離子交換柱分離。hABP-50 ℃-70的2 個(gè)組分（hABP-50 ℃-70-1和hABP-50 ℃-70-2）、hABP-45 ℃-80的1 個(gè)組分（hABP-45 ℃-80-1）和hABP-45 ℃-90的一個(gè)組分（hABP-45 ℃-90-1）通過超純水和不同濃度NaCl溶液連續(xù)洗脫分別獲得（圖6）。在Sephadex G-100色譜柱上分離上述洗脫組分，每種組分進(jìn)一步洗脫得到一個(gè)單一的洗脫峰，分別編號(hào)為hABP-50 ℃-70-11、hABP-50 ℃-70-22、hABP-45 ℃-80-11、hABP-45 ℃-90-11（圖7）。

圖6 不同ABP醇沉樣品的DEAE-52洗脫曲線Fig. 6 Elution curves of ABP on DEAE-52 column

圖7 不同DEAE-52洗脫組分的Sephadex G-100洗脫曲線Fig. 7 Sephadex G-100 elution curves of each DEAE-52 elution fraction

2.5 自溶且分離純化后的ABP分子質(zhì)量

多糖分子質(zhì)量通過HPSEC法進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫曲線（圖8A），建立洗脫時(shí)間（）與分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值（lg）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：lg＝-0.375 7+10.603，＝0.982 2。hABP-50 ℃-70-11、hABP-50 ℃-70-22、hABP-45 ℃-80-11和hABP-45 ℃-90-11的HPSEC洗脫曲線分別如圖8B～E所示，其分子質(zhì)量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算，分別為77 375.42、88 861.78、1 281.70、619.72 Da。

圖8 葡聚糖和ABP組分的HPSEC-ELSD圖譜Fig. 8 High performance size exclusion chromatography-evaporative light scattering detector profiles of dextran and hydrolyzed ABP

2.6 自溶后ABP的單糖組成

hABP-50 ℃-70和hABP-45 ℃-80均由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖組成。對(duì)于hABP-50 ℃-70，葡萄糖和半乳糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為42.49%和40.19%。hABP-45 ℃-80組分不僅含葡萄糖（67.54%）和半乳糖（10.00%），而且含較高比例的甘露糖（8.41%）和核糖（5.61%）。hABP-45 ℃-90中最主要的單糖是葡萄糖（60.09%）和半乳糖（10.68%），其他主要單糖是甘露糖（8.68%）、核糖（8.93%）和鼠李糖（9.16%）。此外，hABP-45 ℃-90不含巖藻糖（表6）。

表6 hABP組分的單糖組成Table 6 Monosaccharide composition of hydrolyzed ABP fractions

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過探究自溶對(duì)ABP的體外抗氧化和抗腫瘤活性的影響，篩選具有強(qiáng)抗氧化性能和抗腫瘤能力的ABP組分，通過測(cè)定其分子質(zhì)量和單糖組成，對(duì)不同的ABP組分進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果表明，在45 ℃或50 ℃自溶4 h后，高分子質(zhì)量多糖的質(zhì)量濃度顯著下降，而中分子質(zhì)量多糖的質(zhì)量濃度顯著增加（＜0.05）。葡聚糖酶在食用真菌生命周期的所有階段都具有活性，包括自溶階段。而雙孢菇的多糖提取物含有-(1,6)、-(1,4)連接的葡聚糖，-(1,6)連接的葡聚糖和甘露半乳聚糖。因此，推測(cè)葡聚糖酶類會(huì)降解ABP，從而導(dǎo)致多糖分子質(zhì)量的降低。Feng Yuqin等總結(jié)了先前有關(guān)ABP的大量研究成果，發(fā)現(xiàn)通過不同提取方法獲得的ABP平均分子質(zhì)量不同。堿性多糖的分子質(zhì)量為2.53×10～10.0×10Da；超聲輔助提取多糖的分子質(zhì)量為15.8×10Da，熱水提取多糖的分子質(zhì)量為4.7×10～20.0×10Da。而hABP-45 ℃-80-11和hABP-45 ℃-90-11的分子質(zhì)量分別為1 281.70 Da和619.72 Da。這提供了ABP在自溶過程中降解的證據(jù)。

多糖自溶是一種內(nèi)源性酶修飾作用，酶促修飾能夠提高抗氧化活性、溶解性和抗菌活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，自溶后小分子質(zhì)量和中分子質(zhì)量多糖hABP的還原能力更強(qiáng)，大分子質(zhì)量hABP的還原能力最弱；中、小分子質(zhì)量多糖hABP的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率也高于大分子質(zhì)量多糖。在自溶過程中，雙孢菇釋放內(nèi)源性酶水解多糖，從而導(dǎo)致活性基團(tuán)暴露和抗氧化能力的改變，多糖的分子質(zhì)量降低并且抗氧化能力提高。這個(gè)結(jié)果與之前的報(bào)道一致。Li Shangshang等報(bào)道了雙孢菇粗制水溶性多糖（crudepolysaccharide，CABP）對(duì)DPPH自由基清除率的EC為0.55 mg/mL。在本實(shí)驗(yàn)中，組分hABP-45 ℃-70、hABP-45 ℃-80和hABP-45 ℃-90對(duì)DPPH自由基清除能力的EC分別為0.09、0.10 mg/mL和0.04 mg/mL?？寡趸阅芘cEC呈負(fù)相關(guān)，因此hABP的DPPH自由基活性高于CABP?？傊?，由于自溶作用ABP的抗氧化活性得到提高。

雙孢菇對(duì)部分癌癥具有特定的預(yù)防作用，包括肉瘤、前列腺癌、乳腺癌和肝癌。本研究結(jié)果表明，ABP在45 ℃自溶4 h后，高分子質(zhì)量多糖對(duì)HeLa和HepG2細(xì)胞活性的抑制作用較弱，而中分子質(zhì)量和小分子質(zhì)量多糖對(duì)HeLa和HepG2細(xì)胞活性的抑制作用較強(qiáng)。在45 ℃自溶4 h后，中、小分子質(zhì)量hABP對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)。這與Tsai等的結(jié)果一致，表明自溶作用降低了多糖的分子質(zhì)量并增強(qiáng)了抗腫瘤活性。特別是在45 ℃下自溶4 h后，小分子質(zhì)量hABP的抗腫瘤活性得到顯著改善。

He Jinzhe等報(bào)道CABP主要由甘露糖（36.68%），半乳糖（20.70%）和葡萄糖（34.85%）組成，還包含少量的阿拉伯糖（1.26%）、巖藻糖（1.10%）、鼠李糖（0.62%）、核糖（1.00%）和木糖（3.10%）。與CABP相比，本實(shí)驗(yàn)所提取的hABP還包含葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。hABP-45 ℃-90中核糖、鼠李糖和葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于CABP，而半乳糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，并且沒有果糖。高糖醛酸含量多糖的抗氧化活性較強(qiáng)，這可能是—COOH的存在所致，糖醛酸殘基可以改變相關(guān)共軛多糖的理化性質(zhì)和溶解度。不同單糖含量的多糖表現(xiàn)出不同的生物活性，如鼠李糖含量較高的多糖可能生物活性更強(qiáng)；Su Yue等報(bào)道了草菇多糖的總抗氧化能力與巖藻糖和半乳糖含量呈顯著負(fù)相關(guān)。因此，自溶作用可能通過從ABP中去除一些單糖（例如巖藻糖）來增強(qiáng)抗氧化活性。

綜上所述，自溶過程使ABP發(fā)生降解，引起其分子質(zhì)量的變化，提高了ABP的抗氧化和抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)分離并純化出具有最佳抗氧化活性和抗腫瘤活性的組分hABP-45 ℃-90-11，主要成分是葡萄糖、半乳糖和鼠李糖，其分子質(zhì)量約為619.72 Da。本研究可為自溶ABP的利用提供一定的參考。