不同提取工藝對杏鮑菇多糖結(jié)構(gòu)特征及免疫活性的影響

馬高興，王 晗，楊文建，蘇安祥，裴 斐，馬 寧，胡秋輝

（南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023）

食用菌多糖是近年來研究較多的一種活性高分子，在治療代謝綜合征和作為營養(yǎng)膳食補充劑方面療效好且應用前景廣闊。杏鮑菇是我國廣泛栽培的一種食用真菌，具有多種活性物質(zhì)（如多糖、多酚、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素），營養(yǎng)價值豐富。杏鮑菇多糖的營養(yǎng)活性已得到廣泛研究，主要包括降壓、抗菌、抗炎、抗病毒、抗糖尿病、降血脂、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等活性。然而，目前對不同提取方法獲得的多糖結(jié)構(gòu)和免疫活性進行比較并闡明其構(gòu)效關系的研究較少。

研究表明，不同提取工藝對多糖的結(jié)構(gòu)特征和營養(yǎng)活性有顯著影響。目前，應用于不同來源天然多糖提取的工藝很多。由于蘑菇中的多糖大部分屬于水溶性多糖，因此熱水提取法被廣泛應用。超聲波輔助提取技術由于具有提取效率高、耗時短、操作簡單等優(yōu)點而被廣泛應用。微波具有很強的穿透力，可以破壞真菌的細胞壁，從而能更有效地提取真菌中的有效成分，因此微波提取法也得到了廣泛的應用。真菌的細胞壁可以被酶水解，此外，酶輔助提取具有條件溫和、多糖得率高、能耗低的特點，有利于維持多糖生物活性。但酶的價格較高，因此酶輔助提取的應用受到了限制。近年來，亞臨界液體萃取技術和脈沖電場輔助萃取技術等創(chuàng)新技術也被應用于從不同植物和動物中提取多糖組分，但由于成本和能耗的限制，這些技術還沒有得到廣泛應用。

由于不同提取純化工藝分離的多糖結(jié)構(gòu)特征不同，其生物活性也存在一定差異。綜合考慮提取成本、提取率等因素，本研究采用熱水法、超聲波法和超聲波輔助熱水法提取杏鮑菇多糖。測定總糖、蛋白、糖醛酸和硫酸基質(zhì)量分數(shù)等理化指標。采用高效液相色譜法、傅里葉變換紅外光譜法和紫外光譜法分別對杏鮑菇多糖的單糖組成、分子質(zhì)量、特征官能團進行分析。最后，探究杏鮑菇多糖對RAW264.7細胞的增殖作用和吞噬作用。本研究旨在比較不同提取方法得到的杏鮑菇多糖結(jié)構(gòu)和活性差異，初步闡釋杏鮑菇多糖的結(jié)構(gòu)特征與活性之間的相關性，為制備具有特定營養(yǎng)活性的杏鮑菇多糖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇粉 南京華潤蘇果市場。

小鼠巨噬細胞RAW264.7 中國科學院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。

單糖標準品和T系列葡聚糖標準品（T-500、T-70、T-40和T-10） 瑞典烏普薩拉公司；三氯甲烷、正丁醇、95%（體積分數(shù)，下同）乙醇 上海源葉生物科技有限公司；杜氏改良Eagle（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、pH 7.3、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國賽默飛世爾科技公司；細胞計數(shù)盒-8（cell counting kit-8，CCK-8） 上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；UV-9000紫外-可見分光光度計 上海Metash公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；Allegra-64R型冷凍離心機美國貝克曼公司；KQ-500E型數(shù)控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；Tensor27傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；8000系列CO細胞恒溫培養(yǎng)箱 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲提取杏鮑菇多糖

杏鮑菇粉先用85%乙醇溶液浸泡12 h，去除色素、小分子脂類等物質(zhì)。離心（4 000 r/min、20 min）除去乙醇，以固液比1∶36（/）向沉淀物中加入蒸餾水。然后在前期預實驗所得最佳工藝條件（464 W、38 ℃、30 min、80 kHz）下進行超聲處理。4 000 r/min、15 min離心后收集上清液。上清液60 ℃蒸發(fā)濃縮至原來體積的一半。然后用3 倍體積的95%乙醇溶液沉淀12 h。離心（8 000 r/min、20 min） 后用10 倍體積的蒸餾水重新溶解沉淀，并將提取液與Sevag試劑按照體積比5∶1混合除去蛋白。離心（10 000 r/min、15 min）后取上層懸浮液。將懸浮液加入透析袋（截留分子質(zhì)量8 000～14 000 Da，后同），置于10 倍懸浮液體積的蒸餾水中透析24 h除去Sevag試劑，然后60 ℃蒸發(fā)濃縮，收集濃縮后的溶液并凍干，所得多糖粉末命名為U。計算多糖提取率（凍干多糖粉末質(zhì)量與杏鮑菇粉末質(zhì)量的比值×100%，后同）。

1.3.2 熱水浸提杏鮑菇多糖

杏鮑菇粉先用85%乙醇溶液浸泡12 h。離心（4 000 r/min、20 min）除去乙醇，以固液比1∶20加入蒸餾水，在60 ℃下水浴加熱2 h。隨后，將混合物離心（4 000 r/min、15 min），收集上清液。上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)并濃縮到原體積的一半。然后用3 倍體積95%乙醇溶液醇沉12 h，離心（8 000 r/min、20 min）后得到沉淀。最后用10 倍體積的蒸餾水重新溶解沉淀，并將提取液與Sevag試劑按照體積比5∶1混合除去蛋白。離心（10 000 r/min、15 min）后取上層懸浮液。將懸浮液倒入透析袋，置于10 倍懸浮液體積的蒸餾水中透析24 h除去Sevag試劑，然后60 ℃蒸發(fā)濃縮，收集濃縮后的溶液并凍干，所得多糖粉末命名為H，計算多糖提取率。

1.3.3 超聲輔助熱水提取杏鮑菇多糖

杏鮑菇粉用85%乙醇溶液浸泡12 h。離心（4 000 r/min、20 min）除去乙醇，以固液比1∶36（/）向沉淀物中加入蒸餾水。然后在最佳工藝條件（464 W、38 ℃、30 min、80 kHz）下進行超聲處理。然后60 ℃水浴加熱2 h。隨后，將混合物離心（4 000 r/min、15 min）并取上清液60 ℃蒸發(fā)濃縮至原來體積的一半。然后用3 倍體積95%乙醇溶液醇沉12 h。離心（8 000 r/min、20 min）后用10 倍體積的蒸餾水重新溶解沉淀，并將提取液與Sevag試劑按照體積比5∶1混合除去蛋白。離心（10 000 r/min、15 min）后取上層懸浮液。將懸浮液倒入透析袋，置于10 倍懸浮液體積的蒸餾水中透析24 h除去Sevag試劑，然后60 ℃蒸發(fā)濃縮收集濃縮后的溶液并凍干，所得多糖粉末命名為U+H，計算多糖提取率。

1.3.4 總糖、蛋白、糖醛酸和硫酸基質(zhì)量分數(shù)的測定

分別采用苯酚硫酸法和考馬斯亮藍試劑盒測定杏鮑菇不同多糖組分的總糖和蛋白質(zhì)量分數(shù)。

參考文獻[11]的方法測定糖醛酸質(zhì)量分數(shù)，在棕色瓶中配制質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL咔唑-乙醇溶液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?.54 mg/mL四硼酸鈉硫酸溶液，室溫保存?zhèn)溆?。? 支試管，分別加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度（0、10、20、30、40、50、60、70 μg/mL）的葡萄糖醛酸標準溶液。然后分別加入5 mL 9.54 mg/mL四硼酸鈉硫酸溶液，充分混勻后沸水浴10 min，待各管室溫下冷卻后再向其中加入0.2 mL 1.25 mg/mL咔唑乙醇溶液，混勻后沸水浴15 min，冷卻后測定530 nm波長處吸光度。以葡萄糖醛酸質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖醛酸標準曲線。取1.0 mL適當質(zhì)量濃度（約0.2 mg/mL）的多糖樣品溶液，參考上述方法測定530 nm波長處的吸光度并代入葡萄糖醛酸標準曲線方程計算多糖樣品溶液中糖醛酸質(zhì)量濃度，按照式（1）計算糖醛酸質(zhì)量分數(shù)。

式中：為多糖樣品溶液中糖醛酸質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為所取多糖樣品溶液中多糖的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

采用氯化鋇-明膠法測定硫酸基質(zhì)量分數(shù)。稱取1.0 g明膠，加入200 mL 60～70 ℃去離子水，待冷卻后置于4 ℃冰箱靜置12 h，得5 g/L明膠溶液。稱取0.5 g氯化鋇溶于100 mL 5 g/L明膠溶液中，得到5 g/L氯化鋇-明膠溶液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。配制不同質(zhì)量濃度（0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL）硫酸鉀標準溶液，分別取1.0 mL加入6 支試管中，依次向各管加入0.7 mL 8%（質(zhì)量分數(shù)）三氯乙酸溶液、0.5 mL 5 g/L氯化鋇明膠溶液，混勻后靜置15～20 min，測定360 nm波長處吸光度。以硫酸鉀質(zhì)量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制硫酸鉀標準曲線。稱取各多糖樣品約10 mg，加至1 mL的1 mol/L鹽酸溶液中，100 ℃水解6 h，60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，向殘渣加入1 mL去離子水使之完全溶解。取0.2 mL水解液于試管中，添加去離子水定容至1.0 mL，再依次加入0.7 mL 8%（質(zhì)量分數(shù)）三氯乙酸溶液、0.5 mL 5 g/L氯化鋇-明膠溶液，混勻后靜置15～20 min，測定360 nm波長處的吸光度。另取0.2 mL水解液，添加去離子水至溶液體積為1.0 mL，再依次加入0.7 mL 8%（質(zhì)量分數(shù)）三氯乙酸溶液、0.5 mL 5 g/L明膠溶液，測定360 nm波長處的吸光度。將兩次反應體系的吸光度之差代入硫酸鉀標準曲線方程可得多糖樣品硫酸鉀的質(zhì)量濃度，最后按式（2）計算多糖樣品中硫酸基質(zhì)量分數(shù)（以硫酸鉀計）。

式中：為多糖樣品中硫酸鉀質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為所取多糖樣品溶液的體積/mL；為所取多糖的質(zhì)量/mg。

1.3.5 紫外光譜分析

配制0.5 mg/mL多糖溶液，采用UV-9000紫外-可見分光光度計在200～400 nm范圍內(nèi)掃描。分析260 nm和280 nm波長處是否有吸收峰，確定樣品中是否含有核酸和蛋白質(zhì)。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

多糖樣品采用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～500 cm掃描32 次，分辨率為2 cm。

1.3.7 單糖組成分析

單糖組成的測定參考文獻[13-14]的方法并稍作修改。用去離子水制備不同單糖標準溶液（2.5 mg/mL）。分別取100 μL不同單糖標準溶液加入試管中，加入100 μL 0.3 mol/L NaOH溶液和100 μL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇溶液，在70 ℃鼓風干燥箱內(nèi)反應2 h。冷卻后，加入100 μL HCl（0.3 mol/L）溶液中和，加入1 mL去離子水。加入1.5 mL氯仿萃取5 min，離心（4 000 r/min、15 min）后棄去氯仿層，按上述步驟重復萃取3 次。處理后的單糖溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后備用。

將5 mg的凍干多糖樣品溶于5 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液中，在密封玻璃管中110 ℃水解2 h。水解后蒸發(fā)濃縮干燥，加入5 mL甲醇洗滌5 次，去除多余的三氟乙酸，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機溶劑后，加入1 mL去離子水，得到水解樣品溶液。將100 μL的溶液轉(zhuǎn)移到密封玻璃試管中，按照單糖標準品1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化的方法進行多糖樣品衍生化，用0.45 μm微孔膜過濾后，采用1260高效液相色譜儀（配備C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和紫外檢測器）進行分析。流動相為磷酸鹽-乙腈（體積比83∶17）；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量20 μL。

1.3.8 杏鮑菇多糖分子質(zhì)量測定

參考文獻[15]采用高效液相色譜法對杏鮑菇多糖的分子質(zhì)量進行了分析。用去離子水配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL的不同分子質(zhì)量（12.6、49.6、70.8、126、498 kDa）的葡聚糖標準品溶液，以及3 種多糖溶液（2 mg/mL）。色譜柱：TSK-GEL G4000 SWXL（7.8 mm×300 mm）；蒸發(fā)光檢測器；柱溫25 ℃；流動相：去離子水；流速0.6 mL/min；以各標準葡聚糖分子質(zhì)量的對數(shù)（lg）為縱坐標，保留時間為橫坐標，繪制分子質(zhì)量擬合葡聚糖標準曲線。分別以不同色譜峰的峰面積百分比表征其分子質(zhì)量分布比例。

1.3.9 杏鮑菇多糖的免疫調(diào)節(jié)活性測定

1.3.9.1 小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出小鼠巨噬細胞凍存管在37 ℃水浴15 min，加入1 mL完全培養(yǎng)基（含89%（體積分數(shù)）DMEM高糖培養(yǎng)基、10%（體積分數(shù)）胎牛血清和1%（體積分數(shù)）青霉素-鏈霉素，下同），然后將凍存管中培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至無菌離心管，1 000 r/min離心3 min，棄去上清液，加入2 mL完全培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%（體積分數(shù)，下同）二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄去完全培養(yǎng)基，加4 mL PBS洗去未貼壁細胞后棄去PBS，加入2 mL完全培養(yǎng)基后輕柔地將貼壁細胞吹打下來，800 r/min離心3 min后棄去完全培養(yǎng)基，加入4 mL完全培養(yǎng)液將細胞輕柔吹散，移至T25細胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞處于對數(shù)生長期，然后以1.5×10個/T25瓶的接種量進行傳代，約活化2 次后取對數(shù)生長期細胞進行下一步實驗。

1.3.9.2 3 種杏鮑菇多糖的細胞增殖實驗

用DMEM高糖培養(yǎng)基配制不同質(zhì)量濃度（0、5、10、25、50、100、200 μg/mL）的3 種多糖溶液，用0.22 μm微孔膜過濾后得到不同質(zhì)量濃度的多糖培養(yǎng)基。待細胞生長至對數(shù)生長期，將T25瓶中的培養(yǎng)液棄去，加入4 mL PBS洗去未貼壁細胞后棄去PBS，加入2 mL新鮮完全培養(yǎng)基將貼壁巨噬細胞輕柔吹散，將巨噬細胞懸液接種于96 孔板，每孔加入100 μL細胞懸液（約2×10個/mL），37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后移去培養(yǎng)液。組每孔加入200 μL不同質(zhì)量濃度多糖培養(yǎng)基；組每孔加入200 μL DMEM高糖培養(yǎng)基；組每孔不含細胞，僅加入200 μL DMEM高糖培養(yǎng)基；每組設置8 個平行。在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后移去培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后測定450 nm波長處吸光度，按照式（3）計算細胞增殖率。

式中：為不添加多糖樣品的組吸光度；為只含有培養(yǎng)基的組吸光度；為添加樣品的組吸光度。

1.3.9.3 3 種杏鮑菇多糖的吞噬能力測定

將巨噬細胞密度調(diào)整為5×10個/mL，以100 μL/孔接種于96 孔板上，在37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后移去培養(yǎng)基，參照1.3.9.2節(jié)實驗進行分組。每孔加入200 μL不同質(zhì)量濃度多糖培養(yǎng)基或DMEM高糖培養(yǎng)基，每組濃度設置8 個平行，培養(yǎng)24 h后，每孔加入中性紅染色液20 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。去除含有中性紅染色液的細胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌3 次。加入200 μL細胞裂解液，室溫下?lián)u床裂解10 min，測定樣品540 nm波長處吸光度。按照公式（4）計算每孔的細胞吞噬率，以細胞吞噬率表征巨噬細胞吞噬能力。

式中：為不加樣品的組吸光度；為只含有培養(yǎng)基的組吸光度；為添加樣品的組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗設置3 個平行，結(jié)果以平均值±標準差表示。采用SPSS 26.0軟件處理數(shù)據(jù)并進行單因素方差分析，采用Duncan檢驗進行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。采用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種杏鮑菇多糖基本理化指標分析結(jié)果

如表1所示，3 種杏鮑菇多糖的提取率分別為3.13%、3.65%和4.57%。結(jié)果表明，3 種提取方法提取率無顯著性差異。在提取率無顯著差異的情況下，與熱水提取法相比，超聲波提取時間短、提取溫度低，這是因為超聲波能破壞真菌細胞壁，促進多糖的溶解。U+H的蛋白和總糖質(zhì)量分數(shù)分別為4.44%和46.79%，高于U和H。超聲波具有機械作用，從而促進了蛋白質(zhì)的溶解，超聲處理后再用熱水提取，進一步促進了杏鮑菇中多糖和蛋白質(zhì)的溶解。3 種多糖中均存在糖醛酸，表明多糖中存在酸性多糖。此外，U、H和U+H的硫酸基含量無明顯差異。

表1 3 種杏鮑菇多糖的理化指標Table 1 Physicochemical properties of three polysaccharides from P. eryngii

2.2 3 種杏鮑菇多糖紫外光譜分析結(jié)果

核酸和蛋白質(zhì)分別在260 nm和280 nm波長處有特征吸收峰。U、H和U+H的紫外吸收光譜如圖1所示。3 種多糖在280 nm波長處有吸收峰，表明多糖中存在蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)量分數(shù)分析結(jié)果相印證。

圖1 3 種杏鮑菇多糖紫外光譜圖Fig. 1 UV spectra of three polysaccharides from P. eryngii

2.3 3 種杏鮑菇多糖傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

傅里葉變換紅外光譜可以顯示多糖各基團的特征吸收峰。U、H和U+H的紅外光譜范圍為4 000～500 cm，如圖2所示。所得峰均為多糖的典型吸收峰。多糖的紅外光譜在3 400 cm附近有1 個寬而強的峰，表明多糖中存在羥基。在3 500 cm附近較寬的吸收峰為羥基的O—H伸縮振動所引起，因此，紅外光譜在該區(qū)域存在吸收說明U、H和U+H含有羥基，表明這些物質(zhì)是多糖。2 930 cm和2 360 cm附近的特征峰是由C-H伸縮振動引起的。在1 650 cm處的強吸收對應羰基的伸縮振動。然而，1 405 cm處寬而強的吸收峰可以歸因于蛋白質(zhì)—CH和—CH的對稱變形。1 260 cm處的吸收峰可能由C—O—C拉伸振動所引起。此外，在1 150 cm和950 cm之間的吸收峰可歸因于磷酸鹽的拉伸振動。3 種多糖在1 100～1 010 cm處有強吸收峰，表明存在吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)。

圖2 3 種杏鮑菇多糖傅里葉變換紅外光譜Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of three polysaccharides of P. eryngii prepared by different methods

2.4 3 種杏鮑菇多糖單糖組成分析結(jié)果

3 種杏鮑菇多糖樣品單糖組成如圖3所示。當保留時間為29 min時，3 種多糖均有較大的吸收峰，與標準品進行比較，證實該物質(zhì)為葡萄糖，說明U、H和U+H主要由葡萄糖組成。保留時間為13 min時的吸收峰為甘露糖，保留時間為34.18 min時的吸收峰為半乳糖，保留時間為37.80 min時的吸收峰為木糖，保留時間為42.16 min時的吸收峰為巖藻糖。根據(jù)單糖組成分析，3 種多糖均由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和巖藻糖組成，但物質(zhì)的量比不同。如圖3所示，U中甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和巖藻糖的物質(zhì)的量比為8.60∶80.90∶7.41∶2.68∶0.57。而另外兩種多糖H和U+H的甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和巖藻糖物質(zhì)的量比分別為9.36∶79.72∶8.18∶2.60∶0.42和6.75∶82.66∶7.14∶2.30∶1.12。其差異可能與提取方法不同有關。

圖3 混合標準品（A）和3 種杏鮑菇多糖樣品（B）單糖組成高效液相色譜圖Fig. 3 High performance liquid chromatogram of mixed monosaccharde standard (A) and monosaccharide composition of three polysaccharides (B)from P. eryngii prepared by different extraction methods

2.5 3 種杏鮑菇多糖的分子質(zhì)量分析結(jié)果

利用高效液相色譜儀測定U、H和U+H的分子質(zhì)量分布，結(jié)果如圖4所示。U、H和U+H的洗脫峰均為多重峰，但都不是單一的對稱峰，說明3 種多糖都不是均勻多糖。根據(jù)標準分子質(zhì)量擬合葡聚糖的線性回歸方程為lg＝-3.392 5+29.413（＝0.993 3）。U在5.26、10.90 min和13.21 min處出現(xiàn)色譜峰，分子質(zhì)量分別為13 152、281、53 kDa，分子質(zhì)量分布比例分別為83.61%、3.02%、13.37%。H在5.62、10.89 min和13.16 min處出現(xiàn)色譜峰，分子質(zhì)量分別為10 232、281、61 kDa，分子質(zhì)量分布比例分別為93.15%、1.94%、4.90%。U+H在5.59 min和13.17 min處出現(xiàn)色譜峰，分子質(zhì)量分別為10 471 kDa和60 kDa，分子質(zhì)量分布比例分別為98.59%、1.40%。

圖4 3 種杏鮑菇多糖高效液相色譜圖Fig. 4 High performance liquid chromatograms of three polysaccharides from P. eryngii prepared by different extraction methods

2.6 3 種杏鮑菇多糖對RAW264.7細胞的增殖作用

采用CCK-8試劑盒測定3 種杏鮑菇多糖干預后巨噬細胞的增殖率以分析杏鮑菇多糖的毒性作用。由圖5可知，U在低質(zhì)量濃度（5、10 μg/mL）條件下對巨噬細胞有毒性作用，可能因為在超聲作用下，不斷有較大分子質(zhì)量的多糖被提取出來，而隨著超聲時間的延長，部分大分子質(zhì)量多糖會被降解為小分子質(zhì)量多糖。不同分子質(zhì)量多糖對巨噬細胞表現(xiàn)出不同的受體親和力，而大分子質(zhì)量多糖通常表現(xiàn)出較強的刺激活性。U在50～200 μg/mL范圍內(nèi)對巨噬細胞增殖有促進作用。H在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對巨噬細胞均無毒性作用，H在高質(zhì)量濃度（50～200 μg/mL）范圍內(nèi)對巨噬細胞增殖有顯著促進效果（＜0.05）。U+H在測試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均能顯著促進巨噬細胞增殖，且在0～25 μg/mL范圍內(nèi)呈劑量-效應關系，在25 μg/mL時達到最大值，在50～200 μg/mL范圍內(nèi)有增殖效果但不呈濃度依賴性。本研究中3 種多糖對RAW264.7細胞的影響均表明U、H和U+H可以激活免疫細胞。

圖5 3 種杏鮑菇多糖對巨噬細胞增殖作用影響Fig. 5 Effects of three polysaccharides from P. eryngii prepared by different extraction methods on the proliferation of macrophages

2.7 3 種杏鮑菇多糖對RAW264.7細胞吞噬能力的影響

吞噬作用可作為巨噬細胞活化的指標。巨噬細胞被激活后會增強增殖、吞噬作用，促進一氧化氮和細胞因子的產(chǎn)生以及細胞形態(tài)的改變，并抑制多種腫瘤細胞和微生物的生長。用中性紅試劑盒測定3 種多糖對巨噬細胞吞噬能力的影響。由圖6可知，與培養(yǎng)基中未添加多糖的巨噬細胞相比，3 種多糖對巨噬細胞吞噬能力均有顯著的促進效果（＜0.05）。U在25、200 μg/mL條件下吞噬率分別為173.87%、193.45%，吞噬效果最佳。H在低質(zhì)量濃度（5～50 μg/mL）條件下吞噬率最大為127.27%，在高質(zhì)量濃度（100、200 μg/mL）下吞噬率分別為151.34%、163.64%。即H在低質(zhì)量濃度條件下對吞噬率的影響顯著低于高質(zhì)量濃度（＜0.05）。U+H在低質(zhì)量濃度（5～25 μg/mL）下吞噬效果最佳，最高可達到187.62%，在50、100、200 μg/mL條件下，吞噬效果顯著下降（＜0.05）。相同質(zhì)量濃度的3 種杏鮑菇多糖對巨噬細胞吞噬率的影響有明顯差異，推測吞噬率的差異與多糖的結(jié)構(gòu)差異相關。

圖6 3 種杏鮑菇多糖對巨噬細胞吞噬作用的影響Fig. 6 Effects of three polysaccharides of P. eryngii prepared by different extraction methods on phagocytosis of macrophages

3 結(jié) 論

本實驗采用不同方法制備杏鮑菇多糖，并對多糖的結(jié)構(gòu)進行了初步表征，最后通過杏鮑菇多糖對增殖和吞噬作用的影響評價了杏鮑菇多糖的免疫活性。研究表明，不同提取工藝對多糖的結(jié)構(gòu)特征和營養(yǎng)活性有顯著影響。本實驗結(jié)果表明3 種方法提取的多糖理化特性無明顯差異，但單糖組成的物質(zhì)的量比和分子質(zhì)量有明顯差異。在超聲作用下，杏鮑菇中大分子質(zhì)量多糖會被提取出來，隨著超聲時間的延長，部分大分子質(zhì)量多糖會被降解為小分子質(zhì)量多糖，所以超聲提取多糖與水煮提取、超聲輔助水煮提取多糖分子質(zhì)量與分布比例有明顯差異。而不同分子質(zhì)量的多糖對巨噬細胞的刺激活性也有差異，大分子質(zhì)量多糖通常表現(xiàn)出較強的刺激活性，所以超聲提取多糖在低質(zhì)量濃度下會表現(xiàn)出輕微毒性，水煮提取多糖和超聲輔助水煮提取多糖在所有實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對RAW264.7細胞無毒性作用，并能激活細胞吞噬活性。綜上，3 種杏鮑菇多糖均具有一定的免疫活性，可以激活巨噬細胞并增強其吞噬活性，但作用效果差異明顯。免疫活性的差異可能與多糖的單糖組成和分子質(zhì)量有關。未來關于3 種杏鮑菇多糖增強免疫活性的機理有待進一步研究。