表達鼠源β-防御素14的植物乳植桿菌減輕小鼠急性結(jié)腸炎

陳小培，田海芝，任正楠，潘禮龍，孫 嘉,*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是特發(fā)性腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩?。–rohn’s disease）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）。近年來，該疾病的發(fā)病率迅速上升，其全球發(fā)病率超過0.3%。除遺傳因素外，環(huán)境因素在IBD的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用，大多數(shù)環(huán)境因素主要通過影響腸道菌群從而介導(dǎo)IBD的發(fā)病過程，如西方飲食的長期攝入會破壞腸道菌群平衡，降低菌群多樣性，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物刺激先天免疫細胞的激活，引起腸道炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而損傷腸道上皮屏障，導(dǎo)致細菌易位，并進一步刺激炎癥反應(yīng)發(fā)生，加速IBD的發(fā)生發(fā)展。目前IBD的臨床治療藥物主要為氨基水楊酸鹽、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑，然而這些藥物可能會引起機會性感染或不良并發(fā)癥等副作用。腸道菌群對于IBD發(fā)病至關(guān)重要，臨床患者體內(nèi)會出現(xiàn)以大腸桿菌為主的致病性細菌異常富集。目前，益生菌的使用已成為IBD防治研究的重點方向之一?；谀c道菌群和炎癥反應(yīng)在IBD發(fā)病中的重要作用，亟待開發(fā)既能調(diào)節(jié)腸道菌群，又能抑制炎癥反應(yīng)的治療方案。

抗菌肽又名宿主防御肽，是生物體先天性防御系統(tǒng)中的重要組成成分，存在于大多數(shù)生物體中。新近研究表明，除維持宿主體內(nèi)的腸道菌群穩(wěn)態(tài)功能以外，部分抗菌肽還具有免疫調(diào)節(jié)作用。臨床數(shù)據(jù)已發(fā)現(xiàn)，IBD患者體內(nèi)抗菌肽（如防御素、導(dǎo)管素和c型凝集素）分泌不足可導(dǎo)致腸道內(nèi)生態(tài)失調(diào)和黏膜屏障損傷。-防御素是脊椎動物特有的防御素之一，主要表達于上皮細胞，人源防御素3（human-defensin 3，hBD3）為防御素家族中抗菌效果最強的抗菌肽，其抑炎作用已在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)中被證實。

在針對UC的臨床試驗中，可分泌hBD2的益生菌大腸桿菌Nissle1917表現(xiàn)出與藥物美沙拉嗪相當(dāng)?shù)寞熜Ш桶踩浴Ｈ欢?，相比hBD2，抗菌效果更強且具有抗炎能力的hBD3在IBD中的作用及其對腸道菌群的影響仍有待挖掘。由于抗菌肽對酸性環(huán)境十分敏感，若直接口服-防御素，胃酸可能會破壞其抑菌活性。植物乳植桿菌（）是國家衛(wèi)生部《可食用的菌種名單》中列出的益生菌之一，被廣泛應(yīng)用于腸道炎癥的干預(yù)研究，其可黏附在腸道黏膜上并存活數(shù)天，是表達生物活性物質(zhì)的良好載體。故本實驗選取植物乳植桿菌為載體構(gòu)建重組菌株，通過Usp45分泌信號驅(qū)動hBD3直系同源蛋白鼠源-防御素14（mouse-defensin 14，mBD14）的分泌，實現(xiàn)mBD14在小鼠結(jié)腸中的靶向遞送。本研究旨在揭示表達mBD14的重組植物乳植桿菌在葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sulfate sodium，DSS）誘發(fā)的小鼠結(jié)腸炎中的作用及其潛在機制，評估益生菌和抗菌肽在UC中的作用，為IBD防治提供新策略。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性BALB/c小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量為（20±2）g，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司（生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2018-0008），飼養(yǎng)于江南大學(xué)實驗動物中心。

植物乳植桿菌來自江南大學(xué)食品微生物學(xué)培養(yǎng)物保藏中心。

DSS、SYBR Green Supermix染料 翌圣生物科技（上海）有限公司；熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-dextran，F(xiàn)ITC-Dextran）德國Merck KGaA公司；FastDNA糞便DNA提取試劑盒安倍醫(yī)療器械貿(mào)易（上海）有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）引物 上海生工公司；-actin抗體 武漢愛博泰克生物科技有限公司；Claudin-1抗體、Cleaved-白細胞介素（interleukin，IL）-18抗體 英國Abcam公司；Occludin抗體 美國Bimake公司；ZO-2抗體 美國Proteintech公司；凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）抗體、Cleaved-IL-1β抗體 美國Cell Signaling Technology公司；NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3）抗體 美國HuaBio公司；Caspase-1 p20抗體 美國Santa Cruz Biotechnology公司；mBD14抗體 美國MyBioSource公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ST40R冷凍離心機、MULTISKAN GO全波長酶標(biāo)儀美國Thermo Fisher Scientific公司；1150H組織石蠟包埋機、PM2245手動輪轉(zhuǎn)切片機 德國萊卡公司；Pannoramic MIDI切片電子掃描儀 匈牙利3DHISTECH公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨機 寧波新芝生物科技股份有限公司；qPCR儀、ChemiDoc Touch凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 重組菌株的構(gòu)建及鑒定

采用基因工程技術(shù)將含有Usp45分泌信號肽、連接體Linker和基因序列的融合基因（）克隆到pNZ8148質(zhì)粒中得到重組質(zhì)粒，然后將其電轉(zhuǎn)化到植物乳植桿菌感受態(tài)細胞中后進行培養(yǎng)，得到的陽性克隆體，命名為/pNZ8148-mBD14（/mBD14）。將攜帶空載pNZ8148質(zhì)粒的菌株命名為/pNZ8148（/0）。重組植物乳植桿菌菌株培養(yǎng)于MRS液體培養(yǎng)基中至OD為0.4～0.6獲得重組菌株菌液，對重組菌株菌液進行質(zhì)粒抽提，并通過PCR檢測進行驗證。將重組菌株在含有溶菌酶（質(zhì)量濃度1 g/L）的MRS（Man-Rogosa-Sharpe）培養(yǎng)基中培養(yǎng)（30 ℃、1 h），吸取部分菌液在室溫下離心（12 000×、15 min），分離出的上清液為分泌蛋白，菌體沉淀用2 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸并超聲破碎，再次離心（12 000×、15 min）獲得的上清液即為菌內(nèi)蛋白。

1.3.2 牛津杯法抑菌實驗

在實驗前對MRS瓊脂培養(yǎng)基進行高溫滅菌，冷卻到適宜溫度后加入植物乳植桿菌，隨后倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，待其凝固后在培養(yǎng)皿表面垂直擺放牛津杯，輕輕加壓使牛津杯與培養(yǎng)基無空隙接觸，在杯中分別加入質(zhì)量分數(shù)5.24% MRS培養(yǎng)基、質(zhì)量濃度5 ng/mL氯霉素和/mBD14上清液，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h后，觀察牛津杯周圍有無抑菌圈生成，判斷mBD14是否會影響植物乳桿菌的生長。

1.3.3 動物模型構(gòu)建

全部動物實驗均由江南大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（JN.141 No2020930b0481108），并遵循國家、國際動物實驗倫理原則開展。將BALB/c小鼠隨機分為正常組（Control）、模型組（DSS）、預(yù)處理組（DSS+）、/0預(yù)處理組（DSS+/0）和/mBD14預(yù)處理組（DSS+/mBD14），每組6～8 只。動物干預(yù)實驗為期15 d，在實驗的前7 d，每天通過灌胃分別給予正常組和模型組每只小鼠200 μL PBS，預(yù)處理組每只小鼠200 μL實驗菌懸液（2×10CFU）；第8天，所有小鼠正常飲水；隨后7 d，模型組和預(yù)處理組的小鼠通過自由攝入含有質(zhì)量分數(shù)3% DSS的飲用水誘導(dǎo)結(jié)腸炎。在實驗的第15天，使用質(zhì)量分數(shù)1%異氟烷麻醉小鼠，快速收集血液后頸椎脫臼法處死小鼠，取結(jié)腸組織、血清及腸道內(nèi)容物等樣品保存于-80 ℃冰箱中用于后續(xù)檢測。

1.3.4 炎癥嚴重程度評估

通過疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）和結(jié)腸長度綜合評估小鼠結(jié)腸炎的嚴重程度。在DSS誘導(dǎo)期間，每日觀察所有小鼠的身體狀況并以分數(shù)形式記錄，主要包括3 個指標(biāo)：體質(zhì)量減輕率（0：0%；1：1%～5%；2：5%～10%；3：＞10%）、糞便稠度（0：正常；1：軟而結(jié)實；2：較軟；3：腹瀉）和直腸出血情況（0：正常；1：糞便隱血陽性；2：隱血陽性及可見顆粒性出血；3：肛門周圍出血），3 個指標(biāo)的總和即DAI評分。動物處理結(jié)束后，收集每只小鼠的結(jié)腸并測量其長度。

1.3.5 組織病理學(xué)檢測

新鮮的結(jié)腸遠端組織在質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛溶液中避光固定24～36 h后，經(jīng)過脫水和石蠟包埋獲得包有組織的蠟塊，隨后將其切成厚度為5 μm的組織切片并使用蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，H&E）染色法對切片進行處理。待貼有組織切片的載玻片風(fēng)干后，在顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織病理變化，并使用掃描儀拍攝高分辨率切片圖像。對于組織學(xué)評分，本實驗使用的評分系統(tǒng)如下：隱窩結(jié)構(gòu)破壞程度（0：正常；2：＜50%；4：50%～90%；6：＞90%），黏膜水腫程度（0：正常；2：輕度水腫；4：中度水腫；6：嚴重水腫），炎癥范圍（0：無炎癥；2：＜10%；4：10%～50%；6：＞50%）。組織學(xué)評分即為3 項指標(biāo)之和。

1.3.6 qPCR分析

采用TRIzol法提取小鼠結(jié)腸中的總RNA，首先稱取適量的結(jié)腸組織加入1 mL TRIzol，將其置于高通量組織研磨機中快速破碎，隨后加入三氯甲烷進行抽提，離心（12 000×、4 ℃、10 min）后吸取上清液并加入等體積的異丙醇，再次離心得到絮狀白色RNA沉淀，用體積分數(shù)75%乙醇溶液（無酶去離子水配制）清洗兩次沉淀，待殘留乙醇揮發(fā)后用無酶去離子水將沉淀溶解。使用EasyQuick RT MasterMix逆轉(zhuǎn)錄試劑將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，-actin為內(nèi)參，F(xiàn)ast SYBR Green Master Mix混合體系，進行qPCR實驗，反應(yīng)總體系為20 μL，包括SYBR Green Supermix染料（10 μL）、無菌去離子水（7 μL）、正向序列引物（0.5 μL）、反向序列引物（0.5 μL）和cDNA（2 μL）。擴增程序為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，反應(yīng)40 個循環(huán)。按照2法計算目的基因（、、、和）相對內(nèi)參基因（）的表達變化。本實驗使用的引物如表1所示。

表1 qPCR使用的特異性引物Table 1 Specific primers used for qPCR

1.3.7 腸道通透性的測定

本實驗使用熒光示蹤劑FITC-Dextran來檢測小鼠的腸道通透性。在準(zhǔn)備解剖小鼠前，對小鼠進行禁食處理，同時給每只小鼠灌胃500 mg/kg的FITC-Dextran，灌胃4 h后眼球取血法收集血液，將其置于避光處靜置一定時間后離心得到血清。使用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長492 nm和發(fā)射波長525 nm的條件下測定各個樣本的吸光度。通過梯度稀釋FITC-Dextran溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算出血清中的FITC-Dextran質(zhì)量濃度。

1.3.8 免疫印跡實驗

稱取適量的結(jié)腸組織于離心管中，加入含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液并在低溫條件下進行組織破碎，經(jīng)過兩次離心（14 000×、4 ℃、15 min）后得到清澈的蛋白溶液，吸取少量蛋白溶液用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，其余蛋白溶液與上樣緩沖液混合。設(shè)置樣本的蛋白上樣量為30 μg，根據(jù)蛋白質(zhì)量濃度計算出各個樣本的上樣體積。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品后，待藍色指示條帶到達膠的底部時停止電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用質(zhì)量分數(shù)5%的脫脂乳溶液封閉結(jié)束后，分別用ZO-2、Occludin、Claudin-1、NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、Cleaved-IL-18和Cleaved-IL-1β蛋白的抗體4 ℃孵育過夜，然后用對應(yīng)的辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗體室溫孵育2 h，顯色液孵育數(shù)秒后置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中曝光觀察。采用Image Lab軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析，以-actin為內(nèi)參蛋白，歸一化處理后確定各個蛋白的表達情況。

1.3.9 結(jié)腸內(nèi)容物DNA提取及細菌定量

在解剖小鼠時，收集所有小鼠的結(jié)腸內(nèi)容物樣品并保存到-80 ℃冰箱中。取適量樣品，使用糞便DNA提取試劑盒提取小鼠結(jié)腸內(nèi)容物中的DNA，通過qPCR檢測結(jié)腸內(nèi)容物中嗜黏蛋白阿克曼菌（）、大腸桿菌（）、具核梭桿菌（）和金黃色葡萄球菌（）相對于總細菌（16S rDNA）的表達量。引物序列如表1所示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。單因素方差分析和雙因素方差分析用于評估各組間的顯著性差異，＜0.05被視為具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均在GraphPad Prism V.8.0.2軟件中進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 mBD14生產(chǎn)菌L. plantarum/mBD14的構(gòu)建及mBD14的表達

將抗菌肽基因編碼的蛋白序列與信號肽序列進行融合，使抗菌肽以融合蛋白從益生菌中自然分泌，是利用益生菌載體傳遞抗菌肽到腸道環(huán)境的有效策略。本實驗選擇Usp45作為分泌信號肽，Usp45與外源蛋白序列或肽連接時可促進它們分泌到胞外。融合基因經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后嵌入pNZ8148質(zhì)粒的I和I位點，得到質(zhì)粒pNZ8148-mBD14，將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入植物乳植桿菌感受態(tài)細胞中得到/mBD14（圖1A）。在含有氯霉素（質(zhì)量濃度5 μg/L）的MRS固體培養(yǎng)基上涂布菌液，培養(yǎng)后得到的單菌落即陽性轉(zhuǎn)化子（圖1B）。挑取單個菌落，經(jīng)培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，通過PCR檢測mBD14基因片段的表達，可見大小約382 bp的擴增條帶，與含融合基因的穿刺菌質(zhì)粒PCR結(jié)果一致（圖1C）。同時，Western blot和抑菌圈實驗表明/mBD14能夠表達和分泌mBD14蛋白，且mBD14蛋白不會影響其載體植物乳植桿菌的生長（圖1D、E）。

圖1 L. plantarum/mBD14的構(gòu)建及mBD14的表達Fig. 1 Construction of L. plantarum/mBD14 and expression of mBD14

2.2 L. plantarum/mBD14對小鼠結(jié)腸炎癥狀的緩解作用

在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中，典型的表觀指標(biāo)包括腹瀉、便血和體質(zhì)量減輕。用DSS處理小鼠7 d后，觀察到與Control組相比，未進行細菌預(yù)處理的DSS組小鼠體質(zhì)量顯著下降（圖2A），DAI評分顯著增加（圖2B）。結(jié)腸縮短也是小鼠結(jié)腸炎模型的關(guān)鍵病理事件之一。對所有小鼠解剖后測量其結(jié)腸長度，發(fā)現(xiàn)DSS組小鼠的結(jié)腸明顯變短，進一步證明小鼠結(jié)腸炎模型建立成功。在誘導(dǎo)結(jié)腸炎前，分別給予小鼠、/0和/mBD14進行預(yù)處理，結(jié)果顯示，與DSS組相比，/mBD14能夠顯著改善體質(zhì)量的減輕（＜0.05），降低DAI評分和緩解結(jié)腸縮短，而攝入和/0的小鼠與DSS組小鼠相比，DAI評分和結(jié)腸長度未表現(xiàn)出明顯差異（圖2B、C）。實驗結(jié)果表明/mBD14能夠緩解由DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，而兩種對照菌株無明顯保護作用。

圖2 L. plantarum/mBD14對緩解小鼠急性結(jié)腸炎癥狀的影響Fig. 2 L. plantarum/mBD14 alleviates the symptoms of acute colitis in mice

2.3 L. plantarum/mBD14對結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

利用qPCR檢測小鼠結(jié)腸內(nèi)容物中嗜黏蛋白阿克曼菌、大腸桿菌、具核梭桿菌和金黃色葡萄球菌的相對豐度，結(jié)果如圖3所示，小鼠經(jīng)過DSS處理后，結(jié)腸內(nèi)致病菌大腸桿菌、具核梭桿菌和金黃色葡萄球菌相對豐度顯著增加（＜0.001、＜0.05、＜0.01），下一代益生菌嗜黏蛋白阿克曼菌相對豐度顯著降低（＜0.05），與臨床上IBD患者的變化一致。相比于DSS組，/mBD14預(yù)處理組小鼠結(jié)腸內(nèi)嗜黏蛋白阿克曼菌相對豐度顯著升高（＜0.05），而大腸桿菌、具核梭桿菌和金黃色葡萄球菌相對豐度出現(xiàn)顯著下降趨勢（＜0.001、＜0.05、＜0.01），其相對豐度均接近于Control組，且和/0預(yù)處理能夠顯著抑制大腸桿菌和具核梭桿菌的增加（＜0.001、＜0.05）。本實驗表明/mBD14能夠顯著抑制DSS誘導(dǎo)的多種致病性細菌富集，維持小鼠結(jié)腸內(nèi)腸道菌群平衡。

圖3 L. plantarum/mBD14對調(diào)節(jié)結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群相對豐度的影響Fig. 3 L. plantarum/mBD14 regulates the gut microbiota in mice with acute colitis

2.4 L. plantarum/mBD14對結(jié)腸炎小鼠腸道損傷的保護作用

通過H&E染色對小鼠結(jié)腸組織進行組織病理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)DSS組表現(xiàn)出嚴重的結(jié)腸組織損傷，其隱窩結(jié)構(gòu)明顯消失，結(jié)腸組織周圍水腫，免疫細胞浸潤，且DSS處理小鼠的組織病理學(xué)評分均高度顯著高于Control組（＜0.001）。經(jīng)/mBD14預(yù)處理小鼠的結(jié)腸組織切片有明顯改善，可見其結(jié)腸形態(tài)變化和炎癥浸潤減少（圖4A），且組織學(xué)評分在所有攝入DSS的處理組中最低（圖4B）。此外，有研究表明，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎會帶來腸道屏障功能的損傷，并出現(xiàn)腸道通透性增加、緊密連接蛋白表達下調(diào)等現(xiàn)象。通過檢測小鼠血清中FITC-Dextran的質(zhì)量濃度來評估小鼠的腸道通透性。如圖4C所示，與Control組相比，DSS組小鼠血清中FITC-Dextran質(zhì)量濃度顯著升高（＜0.05），而/mBD14預(yù)處理組與DSS組相比FITC-Dextran質(zhì)量濃度顯著降低（＜0.05），表明/mBD14能夠維持腸道完整性，使FITC-Dextran無法滲透進入血液。緊密連接蛋白在維持腸屏障功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過Western blot檢測緊密連接蛋白（ZO-2、Occludin和Claudin-1）的表達情況來進一步驗證/mBD14對腸道屏障功能的保護作用。如圖4D所示，與DSS組相比，/mBD14能夠顯著提高緊密連接蛋白的表達量（＜0.05），而其他兩種對照菌株未表現(xiàn)出明顯的效果。綜上，/mBD14預(yù)處理能夠改善DSS誘導(dǎo)的腸道屏障。

圖4 L. plantarum/mBD14保護結(jié)腸炎小鼠腸道屏障功能Fig. 4 L. plantarum/mBD14 protects intestinal barrier function in mice with acute colitis

2.5 L. plantarum/mBD14對結(jié)腸炎小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

DSS直接作用于結(jié)腸上皮，可損傷腸道屏障，導(dǎo)致腸道內(nèi)細菌及其代謝物擴散到黏膜下層組織，從而誘導(dǎo)免疫細胞的激活和細胞因子的產(chǎn)生，引發(fā)腸道炎癥反應(yīng)。利用qPCR檢測小鼠結(jié)腸內(nèi)促炎性細胞因子、、、和基因表達情況，結(jié)果如圖5所示，在DSS組小鼠中這些促炎性細胞因子的基因表達水平高度顯著升高（＜0.001）。而/mBD14預(yù)處理顯著降低了促炎性細胞因子的表達（＜0.01、＜0.001）。同時和在和/0預(yù)處理組的表達量也顯著下調(diào)（＜0.05、＜0.01）。而和的過度表達在IBD發(fā)病機制中起重要作用，本實驗已在mRNA水平上檢測到和的顯著變化。有研究表明在IBD患者和小鼠急性結(jié)腸炎中，NLRP3被激活，與接頭分子ASC和Caspase-1形成炎癥小體復(fù)合體，導(dǎo)致Caspase-1的激活，促進pro-IL-1β和pro-IL-18裂解形成活性的IL-1β和IL-18。采用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)DSS組小鼠結(jié)腸內(nèi)剪切后的IL-18和IL-1β的蛋白表達量極顯著升高（＜0.01），而/mBD14預(yù)處理使剪切后的IL-18和IL-1β的蛋白表達極顯著抑制（＜0.01），進一步檢測其上游通路NLRP3炎癥小體的表達情況，結(jié)果顯示，與DSS組小鼠相比，/mBD14顯著抑制了NLRP3及其下游ASC和Caspase-1的蛋白表達（＜0.01、＜0.05），而或/0均未產(chǎn)生抑制作用（圖5F）。綜上，/mBD14抑制DSS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體及下游炎癥通路的激活，減少IL-1β和IL-18的分泌，進而緩解結(jié)腸炎癥。

圖5 L. plantarum/mBD14抑制結(jié)腸炎小鼠的腸道炎癥反應(yīng)Fig. 5 L. plantarum/mBD14 inhibits the intestinal inflammatory responses in mice with acute colitis

3 討 論

IBD患者腸道內(nèi)存在嚴重菌群失調(diào)，其腸道微生物多樣性明顯低于健康人群。在UC患者中發(fā)現(xiàn)嗜黏蛋白阿克曼菌的豐度降低，可能是由于結(jié)腸黏蛋白的減少。大腸桿菌被認為是IBD的潛在病原體，特別是黏附侵襲性大腸桿菌的某些菌株，在IBD患者中顯著升高。此外，從UC患者體內(nèi)分離出一種高侵入性菌株——具核梭桿菌，該菌株的豐度與UC的發(fā)展呈正相關(guān)。金黃色葡萄球菌在IBD患者的腸淋巴濾泡中發(fā)現(xiàn)，可能與患者發(fā)生感染有關(guān)。在本研究所構(gòu)建的小鼠急性結(jié)腸炎模型中，小鼠結(jié)腸內(nèi)嗜黏蛋白阿克曼菌的豐度顯著降低，而大腸桿菌、具核梭桿菌和金黃色葡萄球菌的豐度顯著升高，這些變化均與UC患者體內(nèi)變化一致。Mergaert等的研究表明抗菌肽在維持腸道生態(tài)平衡方面起重要作用。本實驗發(fā)現(xiàn)/mBD14預(yù)處理能夠抑制致病菌大腸桿菌、具核梭桿菌和金黃色葡萄球菌的擴散及益生菌嗜黏蛋白阿克曼菌的消耗，表明/mBD14能夠有效緩解結(jié)腸炎發(fā)病過程中腸道菌群紊亂的現(xiàn)象。

腸道屏障的破壞會加劇腸道細菌易位，導(dǎo)致腸道黏膜免疫系統(tǒng)識別細菌抗原并產(chǎn)生過激的免疫反應(yīng)，是IBD的核心病理特征。腸道屏障功能障礙發(fā)生于IBD的早期階段，主要表現(xiàn)為腸道緊密連接功能和蛋白組成的改變。在體外細胞實驗中已報道，hBD3可增強多種緊密連接蛋白的表達。本實驗在小鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，/mBD14通過上調(diào)緊密連接蛋白（ZO-2、Occludin和Claudin-1）的表達抑制DSS誘導(dǎo)的腸道通透性增加，維持屏障功能。同時，在結(jié)腸炎動物模型和IBD患者中，活化的免疫細胞產(chǎn)生多種促炎性細胞因子，包括IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17A和IL-18等，造成腸道炎癥損傷。IL-1家族細胞因子IL-1β和IL-18由單核巨噬細胞（mononuclear macrophages，MNPs）和腸上皮細胞（intestinal epithelial cells，IECs）產(chǎn)生，在腸道炎癥中具有促炎效應(yīng)；IL-1β通過誘導(dǎo)可分泌IL-17A的先天淋巴樣細胞（innate lymphoid cells，ILCs）和輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）細胞激活來促進腸道炎癥；IL-18在結(jié)腸炎中通過調(diào)控杯狀細胞發(fā)育的轉(zhuǎn)錄程序來抑制杯狀細胞成熟，導(dǎo)致腸道黏膜屏障的破壞。IL-6由腸道中的多種免疫細胞（如MNPs、IECs和Th2細胞等）產(chǎn)生，可通過激活I(lǐng)L-6信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT3）通路來增加促炎細胞因子的產(chǎn)生和防止T細胞凋亡。由MNPs產(chǎn)生的IL-12可誘導(dǎo)Th1細胞的分化，促進干擾素（interferon，IFN）-γ的分泌。在本實驗的結(jié)腸炎模型中，結(jié)腸內(nèi)、、、和的mRNA相對表達量均顯著升高。細菌預(yù)處理組中/mBD14能夠顯著抑制結(jié)腸內(nèi)這些促炎性細胞因子的表達，和/0對和也具有顯著抑制作用，可能是由于植物乳植桿菌作為益生菌在小鼠急性結(jié)腸炎中產(chǎn)生有益作用。

NLRP3炎癥小體的形成對IL-1家族細胞因子的產(chǎn)生至關(guān)重要。由微生物誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活已在IBD患者和小鼠急性結(jié)腸炎中被證實。免疫細胞中的NLRP3可感知各種微生物及其代謝物產(chǎn)物。在UC患者中，共生體免疫球蛋白G作用于表達腸道駐留受體FcγR的MNPs，誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的激活和IL-1β的產(chǎn)生。在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中，奇異變形桿菌的細菌毒素溶血素刺激單核細胞內(nèi)NLRP3，誘導(dǎo)IL-1β的釋放。此外，大腸桿菌在IBD患者腸道中富集并通過激活NLRP3炎癥小體來促進IL-1β的產(chǎn)生。這些研究表明腸道細菌可調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的活性。本實驗發(fā)現(xiàn)/mBD14預(yù)處理可顯著抑制NLRP3炎癥小體及其下游炎癥通路的激活，這可能與/mBD14可降低致病菌（如大腸桿菌）在結(jié)腸中異常富集有關(guān)。

工程益生菌的應(yīng)用可實現(xiàn)抗菌肽在腸道中的靶向遞送，其中乳酸菌已成功用作細菌載體，利用重組技術(shù)表達抗菌肽（如表達鼠源導(dǎo)管素相關(guān)抗菌肽的乳酸乳球菌NZ9000）可預(yù)防小鼠自身免疫性糖尿病和結(jié)腸炎的發(fā)展，本實驗中表達mBD14的植物乳植桿菌可緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，表明工程益生菌在改善人類健康方面具有潛在應(yīng)用價值。

4 結(jié) 論

本實驗構(gòu)建了具有Usp45分泌序列的重組菌株，即表達mBD14的植物乳植桿菌/mBD14，實現(xiàn)了mBD14在腸道中的靶向遞送。用/mBD14對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠進行預(yù)處理，可明顯緩解結(jié)腸炎癥狀。同時，/mBD14能夠調(diào)節(jié)腸道菌群，維持腸道屏障完整性，減少促炎性因子的表達，抑制NLRP3炎癥小體及下游炎癥通路的激活，進而減輕炎癥反應(yīng)。這一策略可促進益生菌和抗菌肽對于IBD的臨床應(yīng)用。