胰腺癌中MUM1蛋白表達及臨床病理意義

施永恒，劉澤兵，劉 強

胰腺癌是一種惡性度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，因其癥狀不具有特異性，早期診斷困難[1]。常見病理類型為導(dǎo)管腺癌[2]，其增長快、易出現(xiàn)周圍淋巴結(jié)及臟器轉(zhuǎn)移，早期不易發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致多數(shù)患者確診時已錯失行手術(shù)根除腫瘤的最佳時機[3]，并且胰腺癌對放、化療及綜合治療方案不敏感，患者預(yù)后極差[4]。多發(fā)性骨髓瘤1(MUM1)/干擾調(diào)節(jié)因子4(IRF4)即多發(fā)性骨髓瘤致癌基因，是干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)家族成員之一，具有抑制細(xì)胞凋亡促進細(xì)胞增殖的作用[5]。與其他癌基因一樣，MUM1在腫瘤組織中過表達是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要原因[6]?，F(xiàn)階段關(guān)于MUM1的研究主要在免疫細(xì)胞領(lǐng)域[7-8]，而在胰腺癌中的研究相對較少。本文采用免疫組化法檢測胰腺癌組織中MUM1的表達，分析其表達與臨床病理特征及生存期的關(guān)系，為胰腺癌患者預(yù)后的早期評估提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2008年1月～2018年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院存檔的胰腺癌樣本及對應(yīng)的癌旁組織145例。所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查明確診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)庫分析從https://genome-cancer.ucsc.edu/下載胰腺癌相關(guān)的TCGA數(shù)據(jù)。通過對數(shù)據(jù)庫中基因與胰腺癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性進行分析，獲得包括MUM1表達和臨床信息的數(shù)據(jù)。

1.3 方法

1.3.1組織芯片制作 將上述石蠟樣本4 μm厚切片，行HE染色，鏡下觀察標(biāo)記典型的腫瘤組織和相應(yīng)的癌旁組織的位置，并在對應(yīng)的石蠟樣本上進行標(biāo)記，用內(nèi)徑0.6 mm的不銹鋼針進行穿刺取樣，深度2～3 mm，將其固定于模具蠟塊的小孔內(nèi)；將蠟塊4 ℃預(yù)冷4 h，修正蠟塊，將模具蠟塊4 μm厚切片，敷貼于載玻片上，進行封蠟保存。

1.3.2免疫組化 將收集的145例胰腺癌石蠟組織芯片標(biāo)本4 μm厚連續(xù)切片，所有白片均經(jīng)APES防脫片預(yù)處理，50 ℃烘片2 h，用于免疫組化染色。免疫組化染色采用MaxVision法，切片脫蠟及脫水處理后，滴加一抗(MUM1)4 ℃過夜，PBS清洗后，滴加二抗試劑，室溫孵育1 h，PBS再次清洗后DAB顯色。結(jié)果判定：蛋白染色呈棕黃色顆粒狀，主要表達于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)果判斷：參照Kohlberger等[9]采用的半定量積分法判斷結(jié)果，每張切片隨機選取10個高倍鏡視野(200×)，計數(shù)100個胰腺癌細(xì)胞并統(tǒng)計分?jǐn)?shù)。(1)按陽性細(xì)胞數(shù)計分：陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；(2)按染色強度計分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。將兩項得分結(jié)果相乘作為最終判斷：>4分為高表達，≤4為低表達。免疫組化染色結(jié)果由本院兩位病理醫(yī)師采用雙盲法進行判定，如結(jié)果不一致，則由第三位病理醫(yī)師復(fù)閱判定。

1.3.3熒光定量PCR法檢測MUM1 mRNA表達水平 用Trizol法提取胰腺癌及癌旁組織中總RNA，在紫外分光光度計上對RNA純度及濃度進行定量。

1.4 隨訪對胰腺癌患者的生存狀況進行定期電話隨訪，術(shù)后總生存期為從胰腺癌患者術(shù)后到死亡日期或隨訪終止日期(2018年12月31日)。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌預(yù)后相關(guān)基因通過單因素Cox回歸分析TCGA數(shù)據(jù)庫中17 220個基因與178例胰腺癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有5個基因與胰腺癌患者的總生存期相關(guān)(P均<0.001)，其中MUM1的相關(guān)性最強(圖1A)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，MUM1 mRNA高表達患者總生存期優(yōu)于MUM1 mRNA低表達患者(P=0.004，HR=0.55)(圖1B)。此外，MUM1 mRNA高表達的患者無瘤生存期也優(yōu)于MUM1 mRNA低表達患者(P=0.001，HR=0.48)(圖1C)。

圖1 全基因組范圍內(nèi)與胰腺癌預(yù)后相關(guān)的基因篩查：A.TCGA胰腺癌數(shù)據(jù)庫單因素Cox回歸分析全基因組內(nèi)與胰腺癌預(yù)后的相關(guān)分子；B.MUM1 mRNA表達量與胰腺癌患者總生存期的相關(guān)性；C.MUM1 mRNA表達量與胰腺癌患者無瘤生存期的相關(guān)性

2.2 胰腺癌及癌旁組織中MUM1的表達基于TCGA數(shù)據(jù)庫比較了179例胰腺癌組織及4例正常胰腺組織中MUM1 mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)正常胰腺組織中MUM1 mRNA的表達量是胰腺癌組織的1.38倍(t=1.93，P<0.05，圖2A)。本實驗采用熒光定量PCR法檢測30對胰腺癌及癌旁組織中MUM1 mRNA的表達量，同樣發(fā)現(xiàn)正常胰腺組織中MUM1 mRNA表達量是胰腺癌組織的1.49倍(t=4.45，P<0.05,圖2B)。免疫組化結(jié)果顯示，MUM1蛋白在胰腺癌組織及癌旁組織組織中均有表達，呈棕黃色，主要表達于細(xì)胞質(zhì)(圖2C)。MUM1蛋白在癌旁組織中的表達(MUM1高表達率為66.9%)高于胰腺癌(MUM1高表達率為48.3%)(χ2=10.29，P<0.05)。

圖2 胰腺癌組織及癌旁正常胰腺組織中MUM1的表達：A.TCGA數(shù)據(jù)庫比較胰腺癌組織及正常胰腺組織中MUM1 mRNA的表達量；B.熒光定量PCR分析胰腺癌組織及癌旁組織中MUM1 mRNA的表達量；C.免疫組化分析胰腺癌組織及癌旁組織中MUM1蛋白的表達，MaxVision法

2.3 MUM1蛋白表達與胰腺癌臨床病理特征的相關(guān)性相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MUM1表達與胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(χ2=7.03，P=0.008)，與患者性別、年齡、腫瘤部位、病理分級、腫瘤最大徑、神經(jīng)侵犯、血管侵犯、脈管癌栓、T分期、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)(P均>0.05，表1)。

表1 MUM1蛋白表達與胰腺癌臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

2.4 MUM1蛋白表達與胰腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，MUM1高表達患者的總生存期明顯高于MUM1低表達患者，Log-rank檢驗結(jié)果顯示，MUM1高表達與患者良好預(yù)后相關(guān)(P=0.002，HR=0.40，圖3)。單因素Cox回歸分析顯示，腫瘤最大徑、血管侵犯、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期和MUM1表達均是胰腺癌患者預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)(P均<0.05，表2)。此外，多因素Cox回歸分析顯示，MUM1表達降低是胰腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素，這提示MUM1表達可作為胰腺癌患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。

表2 Cox回歸分析胰腺癌患者預(yù)后相關(guān)因素

圖3 MUM1蛋白表達與胰腺癌患者總生存期的相關(guān)性

3 討論

胰腺癌作為我國癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[10]，手術(shù)結(jié)合放、化療及綜合治療方案雖然改善了患者預(yù)后，但其生存率仍極低，1年生存率<20%，5年生存率<10%[11]。腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及高轉(zhuǎn)移侵襲特性導(dǎo)致患者預(yù)后差[12]。

MUM1/IRF4基因最先在多發(fā)性骨髓瘤中被識別，患者t(6；14)(p25；q32)易位導(dǎo)致MUM1/IRF4蛋白過表達，從而促進腫瘤形成[13]。其基因產(chǎn)物屬于干擾素調(diào)控因子家族成員，特異性表達于淋巴細(xì)胞，是B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化的重要調(diào)控因子[14]。既往文獻報道MUM1/IRF4在彌漫大B細(xì)胞中的陽性率高達50%～70%[15]，提示MUMI表達很可能與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的組織學(xué)變異有關(guān)[16]，MUM1/IRF4陽性患者的無瘤生存率顯著低于陰性患者。然而，亦有文獻發(fā)現(xiàn)MUMl/IRF4表達與患者預(yù)后無關(guān)[17]。部分學(xué)者認(rèn)為MUM1/IRF4蛋白表達是B細(xì)胞性慢性淋巴細(xì)胞性白血病預(yù)后良好的指標(biāo)之一[18]。

目前針對MUM1/IRF4蛋白與腫瘤預(yù)后的關(guān)系尚無明確定論，MUM1蛋白在實體腫瘤中的表達及意義的相關(guān)性研究較少，并且在胰腺腫瘤中尚未見報道。本實驗首先通過分析TCGA胰腺癌數(shù)據(jù)庫，篩查與患者預(yù)后顯著相關(guān)的基因MUM1，并進一步通過熒光定量PCR證實該基因在胰腺癌組織中表達顯著降低。同時采用免疫組化法首次檢測了MUM1蛋白在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達，并發(fā)現(xiàn)MUM1蛋白在胰腺癌組織中呈低表達，并且其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。生存分析提示，MUM1蛋白高表達患者的總生存期優(yōu)于MUM1蛋白低表達患者，此外，Cox回歸分析顯示，MUM1高表達是胰腺癌患者預(yù)后的獨立保護因素。Sundram等[19]研究發(fā)現(xiàn)MUM1在黑色素細(xì)胞中呈陽性，是黑色素細(xì)胞病變的一種敏感和特異的免疫組化標(biāo)志物。國內(nèi)也有文獻報道MUM1蛋白表達與黑色素瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，是黑色素瘤預(yù)后的不良因素[20-21]?，F(xiàn)有文獻表明，MUM1在實體腫瘤中的表達與功能不盡相同。Mittrucker等[22]發(fā)現(xiàn)在MUM1基因缺失小鼠中，B細(xì)胞和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫過程中均功能失調(diào)，提示MUM1表達對于成熟B細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要。因此，作者推測MUM1在胰腺癌組織中表達降低促進了胰腺癌的進展，可能與其引起的免疫功能失調(diào)相關(guān)，然結(jié)果仍需積累大樣本進行深入探究。

綜上所述，胰腺癌組織中MUM1呈低表達，MUM1表達降低與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生和生存期縮短顯著相關(guān)。Cox生存分析提示，MUM1表達是胰腺癌患者預(yù)后的獨立影響因素。以上結(jié)果提示通過免疫組化法檢測胰腺癌中MUM1的表達水平可用于臨床及病理診斷，為胰腺癌的診治提供新思路和研究方向，為評估胰腺癌的預(yù)后提供可靠的依據(jù)，以期達到改善胰腺癌患者的預(yù)后及生存質(zhì)量。