柳氮磺吡啶拮抗電離輻射對乳腺癌轉移促進作用的實驗研究

賀 戈，汪國建，趙 娜，龍 爽，王 濤，明 佳 40000重慶，重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院乳甲外科；400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)軍事預防醫(yī)學系防原醫(yī)學教研室，全軍復合傷研究所，創(chuàng)傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶市納米醫(yī)學工程研究中心

乳腺癌是女性比較常見的惡性腫瘤之一。近年來，其發(fā)病率呈現(xiàn)出較快的上升趨勢，雖有較多的治療選擇，乳腺癌仍有10%～20% 的死亡率，其主要的死亡原因是癌癥的浸潤轉移。目前，放射治療是各種惡性腫瘤的基礎治療措施之一。據(jù)統(tǒng)計，超過50%的癌癥患者在患病期間接受放射治療，其對于提高病患整體存活、改善生活質量有重要貢獻。然而，諸多基于體外細胞和在體動物實驗的研究證據(jù)表明電離輻射(ionizing radiation，IR)可以通過多種機制促進腫瘤轉移。研究發(fā)現(xiàn)，IR可通過對腫瘤細胞的直接作用和對腫瘤微環(huán)境的間接影響促進腫瘤上皮-間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)、侵襲、遷移、血管新生乃至轉移。臨床研究表明，特定腫瘤在放射治療后會產(chǎn)生促轉移和促侵襲的信號。因此，開展針對IR促進腫瘤轉移的機制與防治藥物研究具有積極的意義。

柳氮磺吡啶(sulfasalazine, SSZ)為磺胺類抗菌藥，臨床上廣泛用于類風濕性骨關節(jié)炎和炎癥性腸病的治療，其作用機制包括抑制NF-κB活性發(fā)揮抗炎作用和拮抗胱氨酸轉運蛋白體亞基SLC7A11/xCT功能誘導癌細胞鐵死亡。新近研究表明SSZ通過多種途徑抑制腫瘤細胞的轉移，提示其在腫瘤治療中具有潛在的良好應用前景，但關于SSZ對輻照促進腫瘤轉移作用的影響尚不清楚。本研究采用小鼠乳腺癌細胞株4T1和人乳腺癌細胞株MCF-7為研究對象，評價SSZ對IR誘導乳腺癌細胞EMT、遷移、侵襲等表型的影響；并進一步采用4T1細胞乳腺癌肺轉移模型評價SSZ對IR促進腫瘤轉移的拮抗，以期為IR促進腫瘤轉移的藥物防治提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人乳腺癌細胞株MCF-7、小鼠乳腺癌細胞株4T1購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，由陸軍軍醫(yī)大學全軍復合傷研究所實驗室保存。

1.1.2 動物 5～7周齡 BALB/c雌鼠共50只，體質量16～20 g，在陸軍軍醫(yī)大學動物實驗中心無菌條件下飼養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Cytiva公司；電泳凝膠試劑盒、電泳液購自上海雅酶生物醫(yī)藥公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Vimentin抗體(AF0318)、Snail抗體(AF8013)、β-Tubulin抗體(AF1216)購自上海碧云天生物技術公司；E-cadherin抗體(#3195)購自美國CST公司；MMP2抗體(ab86607)、MMP9抗體(ab283575)、xCT抗體(ab175186)、山羊抗小鼠二抗抗體、山羊抗兔二抗抗體購自英國Abcam公司；絲裂霉素購自美國GEN-VIEW公司；SSZ購自美國MCE公司；Transwell實驗試劑盒購自美國CORNING公司；傷口愈合2孔插件購自德國Ibidi公司；結晶紫染色液購自北京索萊寶科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組 人乳腺癌細胞株MCF-7培養(yǎng)于90% DMEM高糖培養(yǎng)基+10% 胎牛血清中。小鼠乳腺癌細胞株4T1培養(yǎng)于90% RPMI 1640培養(yǎng)基+10% 胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 g/mL鏈霉素中。所有細胞株培養(yǎng)于37 ℃、5% CO的恒溫培養(yǎng)箱中。使用陸軍軍醫(yī)大學中心實驗室X射線輻照儀RS2000在160 kV、25 mA的條件下，以1.265 Gy/min的劑量率進行輻照。通過設定X射線(筒稱X線)不同照射時間(95、190、285、379、474 s)以達到不同照射劑量(2、4、6、8、10 Gy)。

實驗分4組：對照組(Con)、SSZ組、IR組和IR+SSZ組；Con組細胞正常培養(yǎng)，IR組對細胞進行4 Gy的X線照射，SSZ組采用0.5 mmol/L的SSZ處理細胞，IR+SSZ組在對細胞進行4 Gy的X線照射后，采用0.5 mmol/L的SSZ處理細胞。

1.2.2 劃痕愈合實驗 將MCF-7和4T1細胞稀釋至6×10/mL，以每孔1 mL均勻接種于6孔板中(傷口愈合2孔插件內接種密度稍大于插件外)。待傷口愈合2孔插件內細胞長至90% 融合后，進行4 Gy的X線照射。照射后立即加入細胞增殖抑制劑絲裂霉素(10 μg/mL)以及SSZ(0.5 mmol/L)孵育2 h。取下傷口愈合2孔插件，形成劃痕，并拍照記錄劃痕線與插件交匯線兩側劃痕的寬度(記為0 h數(shù)值)。將細胞置于37 ℃、5% CO的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后再次原位測量劃痕寬度并拍照記錄，與0 h數(shù)值做比較。使用TScratch軟件分析測量劃痕面積，24 h劃痕面積與0 h劃痕面積比值代表劃痕愈合面積百分比。

1.2.3 細胞侵襲實驗 將Transwell小室置于6孔板中，消化MCF-7或4T1細胞至細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，用無血清DMEM/ RPMI 1640培養(yǎng)基調整細胞數(shù)至1×10/mL，轉至Transwell小室，每個小室加入200 μL細胞懸液，在小室下層加入含10%胎牛血清的DMEM/RPMI 1640培養(yǎng)基作為趨化劑。6孔板于培養(yǎng)箱中過夜后進行輻照，輻照后SSZ組于小室內加入0.5 mmol/L的SSZ，孵育48 h，用棉簽拭去非侵襲性細胞，采用甲紫(結晶紫)固定并染色，在100倍顯微鏡下計數(shù)細胞。

1.2.4 Western blot檢測 輻照后48 h取材，于細胞孔板中加入300 μL細胞裂解液，隨后收集裂解液于EP管中，將EP管在4 ℃、14 000 r/min的條件下離心10 min后提取上清液，按照BCA法檢測定量蛋白后加入蛋白上樣緩沖液制備樣品。蛋白樣品在SDS-PAGE 凝膠進行電泳分離，隨后轉印至PVDF膜，用5% 脫脂奶粉于37 ℃搖床封閉1 h，加入配置好的一抗于4 ℃搖床孵育過夜，使用PBS在搖床上洗膜后，加入配置好的二抗于37 ℃搖床孵育1 h，再次使用PBS在搖床上洗膜，使用奧德賽顯色儀顯色成像并測量灰度值。

1.2.5 動物模型實驗 選用5～7周齡BALB/c雌鼠進行小鼠乳腺癌4T1荷瘤實驗，小鼠按照體質量順序編號后隨機分為4組：Con組、SSZ組、IR組和IR+SSZ組(每組納入10～13只小鼠)。小鼠按50 μL/20 g腹腔注射2%戊巴比妥進行麻醉，隨后于背部皮下接種4T1細胞(1×10/只)，24 h后，SSZ組及IR+SSZ組小鼠于腹腔注射8 mg/只的SSZ(SSZ在每次注射前新鮮配制)，其余兩組于腹腔注射等體積生理鹽水，2次/d，直至處死小鼠。10 d后，用鉛板擋住IR組和IR+SSZ組小鼠除腫瘤外的其他身體部位，然后用4 Gy的X線照射腫瘤部位。Con組和SSZ組不做照射處理。

小鼠肺轉移結節(jié)計數(shù)：注射4T1細胞后第30天使用脊椎脫臼法處死小鼠，隨后從小鼠氣管注射Bouin’s固定液至肺部完全充起，取下肺組織，于PBS液中簡單漂洗后置于Bouin’s固定液中固定，24 h后觀察小鼠肺轉移結節(jié)(肺組織表面的白色凸起點狀物即為肺轉移灶)并計數(shù)。

肺組織按常規(guī)方法制備蠟塊后切片，經(jīng)脫蠟、復水后進行HE染色，于光學顯微鏡下觀察各組小鼠肺轉移灶的病理學改變。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以表示，同一分子在不同輻照劑量下的表達量比較采用

t

檢驗，各組間分子表達量的比較、劃痕實驗、侵襲實驗結果及小鼠原位瘤體積和肺轉移灶數(shù)量的比較采用單因素方差分析。

P

<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IR誘導乳腺癌細胞MCF-7、4T1發(fā)生EMT形態(tài)變化以及相關蛋白標志物的表達

兩種乳腺癌細胞(MCF-7、4T1)在未照射時，細胞形態(tài)正常，細胞間連接緊密，呈“鋪路石樣”(圖1A)。采用2、4、6、8、10 Gy的X線照射后，隨著照射劑量的增加，逐漸失去原有的立方形態(tài)，出現(xiàn)不同程度的EMT形態(tài)學變化；MCF-7細胞變?yōu)椤皵傠u蛋樣”形態(tài)，細胞間間隙增大；4T1細胞失去細胞間的緊密接觸，細胞向“紡錘樣”或多角樣演化，形成偽足。Western blot檢測EMT相關分子的表達，結果顯示，兩種乳腺癌細胞均出現(xiàn)間充質蛋白Snail和Vimentin的表達增高，且在4 Gy的照射劑量下較為明顯(圖1B、C)。

a：P<0.05，與0 Gy組比較A：X線照射后48 h乳腺癌細胞MCF-7、4T1形態(tài)變化；B：Western blot檢測不同劑量的X線照射后MCF-7細胞EMT相關分子Vimentin和Snail的表達及半定量分析；C：Western blot檢測不同劑量的X線照射后4T1細胞EMT相關分子Vimentin和Snail的表達及半定量分析圖1 IR對乳腺癌細胞形態(tài)的影響及EMT相關分子的Western blot檢測結果

2.2 SSZ抑制IR誘導的乳腺癌細胞EMT表型

4 Gy的X線分別照射乳腺癌細胞MCF-7和4T1，然后采用SSZ(0.5 mmol/L)處理乳腺癌細胞2 h，觀察照射后48 h的形態(tài)學改變。結果顯示，單純使用SSZ對細胞形態(tài)學變化的影響不明顯，而IR促進乳腺癌細胞EMT變化的趨勢能夠被SSZ顯著抑制(圖2A)。Western blot檢測乳腺癌細胞EMT相關分子表達的結果顯示，與Con組比較，IR組的細胞上皮標志蛋白E-cadherin表達降低(

P

<0.05)，間充質標志蛋白Vimentin和Snail表達升高(

P

<0.05)；與IR組比較，IR+SSZ組細胞上皮標志蛋白E-cadherin表達升高(

P

<0.05)，而間充質標志蛋白Vimentin和Snail表達降低(

P

<0.05)。與細胞形態(tài)學變化的結果一致，表明SSZ可以抑制IR誘導的乳腺癌細胞EMT(圖2B、C)。

a：P<0.05，與Con組比較；b：P<0.05，與IR組比較A：4 Gy的X線照射后各組MCF-7、4T1細胞形態(tài)變化；B：Western blot檢測各組MCF-7細胞 EMT相關分子的表達及半定量分析；C：Western blot檢測各組4T1細胞EMT相關分子的表達及半定量分析圖2 IR及SSZ對乳腺癌細胞形態(tài)的影響及EMT相關分子的Western blot檢測結果

2.3 SSZ抑制IR對乳腺癌細胞促遷移和促侵襲的作用

采用劃痕實驗和Transwell實驗分別檢測IR后乳腺癌細胞遷移和侵襲能力的變化及SSZ對其的影響。MCF-7細胞劃痕實驗結果顯示(圖3A、B)，與Con組比較，IR組細胞的劃痕愈合速度增快(

P

<0.05)；與IR組比較，IR+SSZ組細胞的劃痕愈合速度減慢(

P

<0.05)。Transwell實驗結果與劃痕實驗結果基本一致(圖4A、B)，與Con組比較，SSZ組的細胞侵襲能力降低(

P

<0.05)，IR組的細胞侵襲能力明顯增加(

P

<0.05)；與IR組比較，IR+SSZ組的細胞侵襲能力顯著降低(

P

<0.05)。4T1細胞的劃痕實驗(圖3C)和Transwell實驗(圖4A、C)得到類似的結果，IR促進4T1細胞的遷移能力和侵襲能力，而SSZ抑制IR的促遷移、侵襲作用。

a：P<0.05，與Con組比較；b：P<0.05，與IR組比較A：劃痕愈合實驗觀察各組MCF-7細胞劃痕愈合情況；B：各組MCF-7細胞劃痕愈合面積；C：各組4T1細胞劃痕愈合面積圖3 IR及SSZ對乳腺癌細胞劃痕愈合速度的影響

2.4 SSZ抑制轉移相關MMP2/9、xCT等分子的蛋白表達

采用Western blot檢測各組細胞轉移相關分子的表達，結果顯示，4 Gy的X線照射明顯促進了乳腺癌細胞MMP2/9和xCT的表達，無論是單純使用SSZ或是IR后使用SSZ，MMP2/9和xCT的表達都被抑制(圖5)。

a：P<0.05，與Con組比較；b: P<0.05，與IR組比較A：MCF-7細胞MMP2/9和xCT的表達及半定量分析；B: 4T1細胞MMP2/9和xCT的表達及半定量分析圖5 Western blot檢測各組乳腺癌細胞MMP2/9和xCT的表達

2.5 IR促進小鼠4T1乳腺癌肺轉移，SSZ有效抑制IR的促肺轉移效應

構建4T1小鼠乳腺癌肺轉移的模型以判斷IR和SSZ對體內腫瘤模型的影響，如圖6A、B所示，Con組、SSZ組、IR組、IR+SSZ組小鼠原位瘤體積分別為(1.70±0.54)、(1.37±0.55)、(1.24±0.32)、(0.83±0.54)cm。與Con組比較，IR組和IR+SSZ組的小鼠原位瘤體積顯著降低(

P

<0.05)，與IR組比較，IR+SSZ組原位瘤體積降低更顯著(

P

<0.05)，而SSZ組原位瘤體積與Con組相比差異無統(tǒng)計學意義。說明IR對原位瘤的生長有明顯抑制作用，且SSZ與IR存在協(xié)同作用。計數(shù)各組小鼠肺轉移結節(jié)，如圖6C、D所示，Con組、SSZ組、IR組、IR+SSZ組小鼠肺轉移結節(jié)數(shù)分別為(8.67±7.88)、(4.30±5.39)、(19.00±8.31)、(6.10±7.78)個。與Con組比較，SSZ組肺轉移結節(jié)數(shù)變化無統(tǒng)計學差異，而IR組小鼠的肺轉移結節(jié)數(shù)顯著增多(

P

<0.05)，與IR組比較，IR+SSZ組的肺轉移結節(jié)數(shù)顯著降低(

P

<0.05)。實驗結果表明：①4 Gy的X線照射對小鼠原位瘤生長的抑制作用顯著，且IR協(xié)同SSZ進一步抑制了原位瘤的生長，但4 Gy的X線照射同時促進了小鼠乳腺癌肺轉移；②SSZ對小鼠乳腺癌的肺轉移無明顯抑制作用，但可以顯著拮抗IR誘導的促轉移效應。

a：P<0.05，與Con組比較；b：P<0.05，與IR組比較A：各組小鼠原位瘤大體觀；B：各組小鼠的原位瘤體積；C：各組小鼠肺轉移灶大體觀；D：各組小鼠肺部轉移結節(jié)數(shù)圖6 IR以及SSZ對小鼠原位瘤以及乳腺癌肺轉移的影響

小鼠肺組織各組轉移灶的HE染色結果顯示，與Con組比較，SSZ組無明顯差異，而IR組的腫瘤肺轉移灶數(shù)量增多，面積增加，邊界欠清，有明顯彌散的趨勢。與IR組比較，IR+SSZ組的肺轉移灶數(shù)量減少，面積減小，邊界清晰(圖7)。

圖7 HE染色觀察各組小鼠肺轉移灶形態(tài)

3 討論

放射治療是包括乳腺癌在內的多種惡性腫瘤的基礎治療措施之一，雖然尚缺乏放射治療是否能促進特定病患腫瘤早期復發(fā)、轉移的臨床試驗證據(jù)，但基于在體動物的研究表明IR能夠通過多種途徑促進腫瘤的轉移。本研究采用乳腺癌細胞的離體細胞模型和在體肺轉移模型，評價SSZ對IR誘導腫瘤轉移的拮抗作用。結果顯示，SSZ能有效抑制IR誘導乳腺癌細胞EMT、遷移、侵襲等轉移相關表型，下調MMP2/9、xCT等蛋白表達水平，其作為治療措施對在體局部照射促進乳腺癌肺轉移的作用顯示顯著拮抗效果。

EMT是指具有極性的上皮樣細胞轉化為具有活動能力的間質樣細胞過程，被認為是腫瘤轉移級聯(lián)反應中早期關鍵事件，在腫瘤轉移侵襲中發(fā)揮重要作用。腫瘤細胞通過EMT丟失上皮細胞樣表征-極性和細胞間接觸等，從而獲得遷移能力以侵襲正常的組織和器官，形成癌癥的遠處轉移和復發(fā)導致病情惡化。

既往研究報道IR能夠誘導體外培養(yǎng)腫瘤細胞出現(xiàn)EMT表型。本實驗結果與之一致，不同劑量的X線照射可誘導人乳腺癌細胞株MCF-7和小鼠乳腺癌細胞株4T1出現(xiàn)EMT表型。兩種乳腺癌細胞4 Gy單次照射即可出現(xiàn)典型EMT表型，因此選取這一劑量開展后續(xù)實驗研究。與照射引起EMT表型相對應，本研究發(fā)現(xiàn)離體細胞4 Gy的X線照射能夠促進乳腺癌細胞遷移與侵襲，而在體實驗顯示荷瘤局部4 Gy的X線照射能顯著促進4T1細胞的肺轉移，表明IR能夠促進腫瘤轉移。但需要指出的是：IR促進腫瘤轉移與放射治療促進腫瘤轉移是兩個概念。臨床上放療的處方劑量雖然單次不大，但連續(xù)照射的累積劑量很高，其作用的目的是在盡量減少對正常組織器官損害前提下以IR殺死腫瘤細胞。在放射治療的作用模式下腫瘤細胞可能出現(xiàn)脫落播散，但這些以EMT或循環(huán)腫瘤細胞形式的播散難以產(chǎn)生轉移灶。譬如最近有研究發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌患者在放療后不同階段均存在患者循環(huán)腫瘤細胞的顯著增多，這些細胞是具有EMT表型、DNA損傷等特征的活細胞，但在體外培養(yǎng)體系增殖能力有限。而本研究顯示，4T1乳腺癌荷瘤局部的4 Gy單次照射即可顯著使得瘤體積縮小，殺死較多腫瘤細胞，但可促進腫瘤的肺轉移。這一結果是單次IR作用的結果，如果以放射治療的方案將可能在肺部轉移之前即將原位瘤全部殺死。

最近研究報道IR可以誘導xCT的表達上調，通過拮抗鐵死亡促進細胞存活。先前有報道認為xCT在乳腺癌細胞株的表達水平與EMT密切相關，而SSZ能通過抑制xCT逆轉EMT表型。由此，我們推測IR誘導腫瘤細胞的轉移能力增強表型可能與xCT相關，故而嘗試以SSZ為防治藥物評價其對IR促進腫瘤轉移表型的影響。本研究結果表明，SSZ對乳腺癌細胞株MCF-7和4T1的本身形態(tài)及EMT相關分子表達的影響均有限，但能夠顯著降低IR誘導的Snail、Vimentin等間質蛋白表達，促進E-cadherin等上皮來源蛋白表達，同時可以從形態(tài)上部分逆轉EMT表型。與之類似，遷移和侵襲實驗結果也表明，SSZ對非照射細胞的作用有限，但能顯著抑制IR誘導的促轉移相關表型。新近研究報道，SSZ在具有典型間質特征的乳腺癌細胞MDA-MB-231能夠抑制其EMT表型，與本研究僅在照射細胞起作用的結果不盡相同，可能與本研究采用的細胞具有典型上皮特征有關。

本研究初步探討SSZ抑制電離輻射誘導的乳腺癌細胞EMT、遷移、侵襲等轉移相關表型增強的可能機制。發(fā)現(xiàn)IR能促進基質金屬蛋白酶MMP2/9、xCT等蛋白水平的表達，而SSZ能抑制上述蛋白的基礎水平和輻射誘導后的表達。研究表明IR誘導表達的基質金屬蛋白酶對于IR促進腫瘤轉移發(fā)揮了重要作用，而SSZ可以通過抑制NF-κB活性下調其表達，在本實驗體系可能存在類似的機制。xCT的水平與腫瘤細胞的轉移能力密切相關，作為xCT抑制劑的SSZ發(fā)揮拮抗腫瘤轉移的作用或與此有關。然而，到底何種因素在SSZ抑制IR誘導乳腺癌細胞增強的轉移相關表型中發(fā)揮核心關鍵作用，尚待更加深入系統(tǒng)的研究。需要指出的是，雖然SSZ能夠抑制上述分子在乳腺癌細胞的基礎表達水平，但對未照射細胞的遷移、侵襲表型影響有限，提示其發(fā)揮作用或有其他機制存在。

與離體細胞的實驗結果一致，SSZ治療在動物實驗中也顯示較好效果。將4T1乳腺癌細胞在背部皮下進行接種荷瘤會出現(xiàn)肺部轉移，而4 Gy單次荷瘤局部照射后能夠顯著促進肺部轉移。SSZ能夠顯著抑制IR導致的肺部轉移促進作用。照射的兩組小鼠原位瘤大小均顯著降低，但SSZ組比單純照射的IR組瘤體積降低更顯著，提示二者在殺傷腫瘤細胞方面存在協(xié)同作用。SSZ能夠顯著降低原位瘤局部照射導致的肺轉移結節(jié)數(shù)目，但其與未照射小鼠在肺轉移結節(jié)數(shù)目上差異無統(tǒng)計學意義。鑒于本實驗僅采用1個給藥劑量，而SSZ本身具有較寬泛的安全劑量，后續(xù)的量效關系值得進一步摸索。需要指出的是，雖然SSZ治療對未照射腫瘤顯示出減少原位瘤體積和肺轉移結節(jié)數(shù)目的趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學意義。

綜上所述，本研究表明SSZ顯示出較好的抑制IR誘導乳腺癌細胞株EMT、遷移、侵襲等轉移相關表型的作用，其作為治療措施對在體局部照射乳腺癌的肺轉移促進作用具有顯著拮抗效果，提示其或可作為腫瘤放射治療時聯(lián)合用藥以降低潛在的腫瘤轉移風險。

作者貢獻聲明：

賀戈參與設計研究方案，實驗操作，采集、清理以及分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；汪國建參與實驗，采集、清理以及分析數(shù)據(jù)；趙娜和龍爽參與實驗；王濤提出研究思路，設計研究方案，采集、清理以及分析數(shù)據(jù)，論文修改；明佳提出研究思路，設計研究方案，論文修改。