基于p38MAPK/NF-κB信號通路的穴位埋線對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜上皮屏障的影響

謝超群，鄒君君，張建偉，朱瑩

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以腹痛、腹瀉及血便為主要臨床表現(xiàn)的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要病理特點(diǎn)是腸道炎癥和潰瘍形成，病情遷延難愈。其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，但有研究表明，腸黏膜屏障功能損傷是UC發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。緊密連接及相關(guān)蛋白，如閉鎖小帶蛋白-1（ZO-1）、咬合蛋白（Occludin）在維持完整的腸上皮屏障方面至關(guān)重要，其功能缺陷導(dǎo)致腸黏膜通透性增加。p38MAPK/NF-κB信號通路可介導(dǎo)腸黏膜屏障炎癥反應(yīng)，改變緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響腸黏膜上皮屏障功能。目前西醫(yī)主要以氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑等藥物治療為主，短期內(nèi)可控制和緩解癥狀，但停藥后易復(fù)發(fā)，長期用藥不良反應(yīng)多。因此，尋找安全有效的治療方法具有重要意義。研究顯示，穴位埋線治療UC療效確切，具有抑制自身免疫反應(yīng)，控制或減輕炎癥作用。課題組前期研究表明，穴位埋線能有效緩解炎癥，改善腸道黏膜損傷。本研究以p38MAPK/NF-κB信號通路對腸黏膜上皮屏障的調(diào)控作用為切入點(diǎn)，探討穴位埋線對UC大鼠的治療作用及效應(yīng)機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級SD 雄性大鼠46 只，2～3 月齡，體質(zhì)量（200±20）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、濕度50%～70%環(huán)境。自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑與儀器

腺嘌呤，上海源葉生物科技有限公司，批號S09S10D97125；2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS），美國Sigma 公司，批號SLCG2384；柳氮磺吡啶（SASP）腸溶片，上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號09 190501；番瀉葉，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，批號 200401；β-actin、Occludin、ZO-1、p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子（NF）-κB p65抗體，武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號分別為GB12001、GB11149、GB111402、GB13490、GB11142；白 細(xì) 胞 介 素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物工程有限公司，貨號分別為ml037361、ml102828、ml002859。7號一次性埋線針，山東博達(dá)醫(yī)療用品股份有限公司，批號20 200515；4-0可吸收膠原蛋白線，山東博達(dá)醫(yī)療用品股份有限公司，批號BD 200801；電泳儀，北京六一儀器廠，型號DYCZ-24DN；快速轉(zhuǎn)膜儀，北京六一儀器廠，型號DYCZ-40DN；多功能酶標(biāo)儀，深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號MB-530；超微量分光光度計(jì)，美國Thermo，型號NanoDrop2000；熒光定量PCR儀，美國ABI，型號7300；勻漿儀，武漢賽維爾，型號KZ-Ⅱ；病理切片機(jī)，德國徠卡，RM2016。

1.3 造模及分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將46 只大鼠隨機(jī)分為空白組（10只）和造模組（36只），參考前期方法造模，造模組先予腺嘌呤10 mL/kg灌胃2周，再以番瀉葉水提液10 mL/kg灌胃2周，空白組予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。第29日大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛腹腔注射（4 mL/kg）麻醉后，按100 mg/kg 予5%TNBS（50 mg/mL）＋50%乙醇0.25 mL制成的混合試劑灌腸，捏緊大鼠肛門并提起大鼠尾部，保持大鼠頭部朝下倒立2 min，放回鼠籠，待其自然清醒，自由攝食飲水。造模結(jié)束后，隨機(jī)選取造模組與空白組各3只大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血及結(jié)腸組織，進(jìn)行血液流變學(xué)檢測、ELISA檢測、HE染色以驗(yàn)證造模是否成功。造模組HE染色顯示結(jié)腸組織炎性浸潤、出血，血清游離三碘甲腺原氨酸、游離甲狀腺素、睪丸酮、皮質(zhì)醇含量降低，血黏度升高，IL-6、IL-8、TNF-α含量增加，提示造模成功。將剩余33只大鼠隨機(jī)分為模型組、SASP組及埋線組，每組11只。

1.4 干預(yù)

造模后第3日進(jìn)行干預(yù)，埋線組參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，選取“足三里”“天樞”“大腸俞”“脾俞”“腎俞”“膈俞”埋線。選穴定位后備皮，絡(luò)合碘消毒，使用一次性埋線針將0.5 cm羊腸線埋入相應(yīng)穴位，確保線頭不外露，操作完成后在對應(yīng)皮膚處覆蓋無菌敷料，穴位埋線每14 d 1 次，共操作3 次；SASP 組予SASP混懸液灌胃（50 mg/kg），灌胃體積5 mL/kg，埋線組、空白組、模型組予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)42 d。

1.5 一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)過程中每日記錄大鼠體質(zhì)量、飲食飲水情況，對大鼠精神狀況、毛發(fā)光澤度、大便性狀等進(jìn)行觀察。

1.6 結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)評分

干預(yù)結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，暴露腹腔，取距肛門6～10 cm結(jié)腸段，進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評分。無損傷0分；黏膜充血、水腫，未出現(xiàn)潰瘍1分；黏膜充血、水腫、輕度糜爛，無潰瘍2分；黏膜充血、水腫、中度糜爛，有單個(gè)潰瘍3分；黏膜充血、水腫、高度糜爛，有多處潰瘍4分；黏膜充血、水腫、重度糜爛，有＞1 cm潰瘍5分。

1.7 結(jié)腸長度測量

取大鼠回盲部至肛門結(jié)腸，測量長度。

1.8 HE染色

取距肛門6～10 cm結(jié)腸，置于4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，封片，顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化。

1.9 ELISA檢測

腹主動(dòng)脈取血后，靜置1 h，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，吸取血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.10 PCR檢測

取距肛門6～10 cm結(jié)腸（約25 mg），Trizol法提取總RNA，以總RNA 為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃循環(huán)15 s，60 ℃循環(huán)30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參，采用2法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

表1 各基因PCR引物序列

1.11 Western blot檢測

取約0.02 g結(jié)腸組織研磨成勻漿，加入RIPA裂解液，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法檢測蛋白濃度。電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入p38MAPK一抗（1∶1 000）、NF-κB p65一抗（1∶5 000）、Occludin 一抗（1∶1 000）、ZO-1一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h；PBST清洗3次，每次10 min；滴加ECL發(fā)光液曝光，采用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 穴位埋線對模型大鼠一般情況的影響

空白組大鼠精神及活動(dòng)度均良好，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)光澤，體質(zhì)量增加，糞便成形，無稀便及血便；模型組大鼠蜷臥嗜睡，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)粗糙散亂、晦黯無光澤，飲食減少，體質(zhì)量明顯減輕，并伴有不同程度腹瀉、黏液膿血便；SASP組和埋線組大鼠癥狀、體征均有不同程度改善。與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著減輕（＜0.01）；與模型組比較，SASP組和埋線組大鼠體質(zhì)量顯著增加（＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量比較（，每組6～7只）

2.2 穴位埋線對模型大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)評分的影響

空白組大鼠結(jié)腸黏膜光滑粉嫩，未見明顯異常；模型組大鼠結(jié)腸黏膜顏色偏黯，充血水腫明顯，腸腔內(nèi)可見多處潰瘍灶；SASP組和埋線組大鼠結(jié)腸黏膜充血水腫較輕，少數(shù)腸壁可見糜爛及小潰瘍灶。與空白組比較，模型組大鼠CMDI評分顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，SASP組和埋線組大鼠CMDI評分顯著降低（＜0.01）。見表2、圖2。

圖2 各組大鼠結(jié)腸形態(tài)

表2 各組大鼠CMDI評分比較（，分）

2.3 穴位埋線對模型大鼠結(jié)腸長度的影響

與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸長度顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，SASP組及埋線組大鼠結(jié)腸長度顯著增加（＜0.01）。見圖3。

圖3 各組大鼠結(jié)腸長度比較（，每組6～7只）

2.4 穴位埋線對模型大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響

空白組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，無充血水腫、潰瘍等異常；模型組大鼠結(jié)腸組織局部潰瘍，結(jié)構(gòu)模糊，腺體破壞、排列紊亂，有充血及水腫，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，各層分界不清；SASP組及埋線組大鼠結(jié)腸黏膜病變明顯緩解，可見潰瘍面恢復(fù)，有肉芽組織增生，腺體排列較連續(xù)，炎性浸潤減輕。見圖4。

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)（HE染色，×200）

2.5 穴位埋線對模型大鼠血清炎癥因子含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，SASP組及埋線組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量顯著減少（＜0.01）。見圖5。

圖5 各組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量比較（，每組6～7只）

2.6 穴位埋線對模型大鼠結(jié)腸組織p38MAPK、NF-κB p65、Occludin和ZO-1 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織p38MAPK、NF-κB p65 mRNA 表達(dá)顯著升高，Occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，SASP 組及埋線組大鼠結(jié)腸組織p38MAPK、NF-κB p65 mRNA 表 達(dá) 顯 著 降 低，Occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。見圖6。

圖6 各組大鼠結(jié)腸組織p38MAPK、NF-κB p65、Occludin和ZO-1 mRNA表達(dá)比較（，每組6～7只）

2.7 穴位埋線對模型大鼠結(jié)腸組織p38MAPK、NF-κB p65、Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織p38MAPK、NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著升高，Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，SASP 組及埋線組大鼠結(jié)腸組織p38MAPK、NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低，Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。見圖7、圖8。

圖7 各組大鼠結(jié)腸組織p38MAPK、NF-κB p65、Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)比較（，每組6～7只）

圖8 各組大鼠結(jié)腸組織p38MAPK、NF-κB p65、Occludin和ZO-1蛋白免疫印跡

3 討論

UC是一種累及結(jié)直腸的彌漫性炎癥性疾病，腸黏膜上皮屏障緊密連接缺陷是重要致病因素。穴位埋線是將羊腸線植入相應(yīng)穴位，起到持續(xù)刺激作用，從而達(dá)到“深納而久留之，以治頑疾”之效。中醫(yī)認(rèn)為本病病位在腸，涉及脾腎之臟，病機(jī)屬本虛標(biāo)實(shí)，即脾腎陽虛為本，血瘀為標(biāo)。本研究在經(jīng)穴-臟腑相關(guān)理論及臨證經(jīng)驗(yàn)的指導(dǎo)下，取“足三里”“天樞”“大腸俞”“脾俞”“腎俞”“膈俞”埋線治療。足三里為足陽明經(jīng)合穴、胃之下合穴，《四總穴歌》云“肚腹三里留”，其在治療胃腸疾病中發(fā)揮重要作用；天樞為大腸募穴，凡屬六腑之病癥皆可取位于胸腹部腹募穴治療；兩者合取遠(yuǎn)近配穴之義，可達(dá)健脾止瀉之效；脾俞、腎俞、大腸俞為背俞穴，功善溫陽，脾腎陽虛為發(fā)病之本，此三者共達(dá)調(diào)整臟腑虛實(shí)、扶正補(bǔ)虛之效；膈俞為八會(huì)穴之血會(huì)，主活血化瘀生新。六穴合用，共奏溫陽止瀉、活血化瘀之功。本研究結(jié)果顯示，穴位埋線可明顯改善UC大鼠體質(zhì)量、CMDI評分及結(jié)腸組織病理損傷，對“虛、瘀”狀態(tài)下UC大鼠具有明顯的保護(hù)作用。

緊密連接是腸上皮屏障的重要組成部分，其完整性和穩(wěn)定性是腸道發(fā)揮屏障功能的基礎(chǔ)Occludin是構(gòu)成緊密連接的重要跨膜蛋白，負(fù)責(zé)調(diào)控緊密連接穩(wěn)定性和通透性，并與ZO-1形成緊密連接的基本結(jié)構(gòu)。ZO-1是一種外周膜蛋白，其C端可與Occludin、actin等結(jié)合，在Occludin與actin細(xì)胞骨架之間形成穩(wěn)定的連接復(fù)合物，從而維持緊密連接穩(wěn)定，阻止有害物質(zhì)和病原體進(jìn)入。研究表明，UC大鼠腸黏膜組織Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)顯著降低，腸黏膜通透性增加，是導(dǎo)致UC炎癥反應(yīng)的主要因素。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠結(jié)腸組織局部潰瘍，腺體破壞，有充血及水腫，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，Occludin、ZO-1表達(dá)明顯降低；經(jīng)穴位埋線干預(yù)后，大鼠結(jié)腸黏膜病變緩解，潰瘍面恢復(fù)，炎性浸潤減輕，Occludin、ZO-1表達(dá)明顯升高，提示穴位埋線具有維護(hù)緊密連接完整性和穩(wěn)定性、降低腸黏膜通透性、修復(fù)腸黏膜上皮屏障的作用。

p38MAPK是MAPK家族的成員，通過酪氨酸和蘇氨酸雙磷酸化激活后，參與炎癥因子NF-κB、TNF-α等的調(diào)控，與炎癥因子形成正反饋調(diào)節(jié)，加劇腸道炎癥反應(yīng)，引起緊密連接斷裂，腸黏膜屏障損傷，增加腸黏膜通透性。NF-κB作為與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活因子，可被p38MAPK磷酸化后的特異性底物激活，是p38MAPK通路下游的重要因子，在真核生物結(jié)腸上皮細(xì)胞中以p65和p50組成的異二聚體存在，其中p65是NF-κB最常見的活性形式。正常狀態(tài)下，NF-κB處于未激活狀態(tài)，當(dāng)受到炎癥信號刺激時(shí)，刺激信號依賴NF-κB抑制因子（IκB）激酶降解IκBs，進(jìn)而活化NF-κB通路，釋放IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子，NF-κB p65又與促炎因子相互作用，形成正反饋調(diào)節(jié)，進(jìn)而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，加劇腸黏膜屏障破壞。本研究結(jié)果顯示，穴位埋線通過抑制p38MAPK/NF-κB信號通路激活，減少炎癥因子釋放，提高Occludin、ZO-1表達(dá)，修復(fù)緊密連接，進(jìn)而維護(hù)腸黏膜上皮屏障功能。

綜上所述，穴位埋線能有效緩解UC大鼠結(jié)腸黏膜炎癥反應(yīng)，修復(fù)腸黏膜上皮屏障，發(fā)揮治療UC的作用。其作用可能是通過抑制p38MAPK/NF-κB通路激活，上調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)，維護(hù)腸上皮緊密連接完整性和穩(wěn)定性，降低腸黏膜通透性實(shí)現(xiàn)。