基于生物信息學分析歸屬人參屬化學成分及黑參藥性

劉琳琳，竇德強

遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 大連116600

黑參為五加科植物人參C.A.Mey.的干燥根和根莖經(jīng)多次蒸曬（九蒸九曬）得到的一種人參制品。黑參較生曬參、紅參有更強的生物活性，如抗炎、抗氧化、增強免疫功能、降血糖、抗腫瘤等，但對黑參的相關報道較紅參和生曬參少，《中華人民共和國藥典》關于人參炮制品的記載只有紅參和生曬參。黑參最早產(chǎn)于韓國，近幾年我國也進行了黑參的開發(fā)研究，如本課題組已與遼寧地方企業(yè)實現(xiàn)了黑參產(chǎn)業(yè)化，并制定了遼寧省地方標準《黑參加工技術規(guī)程》，為黑參資源的質(zhì)量控制和開發(fā)應用提供參考。本研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接，以人參屬中藥三七、紅參、人參、西洋參、人參葉為研究對象，對其化學成分、靶點進行挖掘，以特異性通路→靶點→化學成分模式篩選出調(diào)控寒熱藥性的靶點，通過分子對接以熱力值的形式進一步篩選調(diào)控寒熱藥性的關鍵靶點，并進行藥理實驗驗證，利用多元統(tǒng)計分析歸屬黑參的藥性，為臨床用藥提供指導。

1 資料與方法

1.1 網(wǎng)絡藥理學分析

1.1.1 KEGG通路富集分析及反向找靶

人參為五加科植物人參C.A.Mey.的干燥根和根莖，性微溫。紅參為五加科植物人參C.A.Mey.的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖，性溫。西洋參為五加科植物西洋參L.的干燥根，性涼。人參葉為五加科植物人參C.A.Mey.的干燥葉，性寒。三七為五加科植物三七（Burk.）F.H.Chen的干燥根和根莖，性溫。以上人參屬中藥的藥味均為甘、微苦。利用TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）分別查找5味藥的主要活性成分及其相關靶點。利用R3.6.3 軟件對相同藥性藥材的靶點進行KEGG通路富集分析。通過對比去重的方法剔除寒涼、溫性中藥共同涉及的代謝通路，得到寒涼性中藥和溫性中藥的特異性代謝通路。

1.1.2 藥性歸屬及黑參藥性預測

以“特異性通路→靶點”模式，通過通路反向找各藥靶點，剔除寒熱藥共有靶點后得到寒熱特異性靶點，運行化學成分-寒熱特異性靶點-寒熱特異性通路網(wǎng)絡分析各靶點度值（degree），統(tǒng)計相同藥性中同一靶點degree。在此基礎上對藥性賦值（寒＝-2、涼＝-1、微溫＝0.5、溫＝1），并與degree加權(quán)，歸屬排序各靶點所調(diào)控的藥性。統(tǒng)計相同藥性中同一化合物degree，并對其進行加權(quán)處理，歸屬其寒熱藥性。根據(jù)文獻對黑參化學成分及含量的報道，初步預測黑參的藥性及其物質(zhì)基礎。

1.1.3 藥性調(diào)控關鍵靶點篩選

藥性與機體的能量代謝密切相關，即熱性藥促進能量代謝而寒性藥抑制能量代謝。因此，將預測得到的寒熱藥性相關靶點按矢量值大小依次輸入KEGG PATHWAY Database（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html），找出與能量代謝直接相關的靶點（參與糖代謝、氨基酸代謝通路的靶點），取矢量值較大的前5個靶點作為分子對接靶點。借助RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）選擇其最佳靶點蛋白晶體結(jié)構(gòu)，下載靶點的3D結(jié)構(gòu)，采用TCMSP下載寒熱相關成分的結(jié)構(gòu)mol2格式文件。通過AutoDock軟件進行分子對接，以對接評分（docking score）為依據(jù)評價化合物與受體匹配情況，分別找出與寒熱藥性相關的關鍵靶點及其上下游蛋白酶，用于實驗驗證。

1.2 黑參藥性實驗驗證

1.2.1 動物、儀器與試藥

SPF級昆明種雄性小鼠80只，體質(zhì)量18～22 g，5～6周齡，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2020-0001，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗室溫度（23±2）℃、濕度60%～70%環(huán)境，晝夜12 h自然光照，自由攝食飲水。

DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TDZ4-WS臺式低速離心機，湘儀離心機廠；Caretium酶標儀，深圳市凱特生物醫(yī)療電子科技有限公司；UV-2100紫外分光光度計，上海UNICO公司。

人參葉（批號20200910）、紅參（批號20200910）購于吉林省撫松縣，黑參（批號20200910）購于遼寧中書堂黑參有限公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學藥學院王冰教授鑒定，分別為五加科植物人參C.A.Mey.的干燥葉、五加科植物人參C.A.Mey.的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖、五加科植物人參C.A.Mey.的栽培品經(jīng)多次蒸曬（九蒸九曬）后的干燥根和根莖。分別取人參葉、紅參、黑參藥材粉末，加10 倍量蒸餾水，文火煎煮提取2次，第1次提取2 h，濾布過濾，濾液趁熱抽濾，得上清液，第2次提取1 h，濾布過濾，濾液趁熱抽濾，得上清液，合并2次上清液作為水煎液，分別濃縮至0.292 5 g/mL（低劑量）和0.585 0 g/mL（高劑量），4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

BCA 測試盒（批號20201205）、超微量Na-K-ATP 酶測試盒（批號20201208）、乙酰膽堿酯酶（AchE）測試盒（批號20201208）、環(huán)磷酸腺苷（cGMP）測試盒（批號2020122）、環(huán)磷酸鳥苷（cAMP）測試盒（批號2020122），南京建成生物工程研究所；皮質(zhì)酮（CORT）測試盒（批號202012）、三碘甲狀腺原氨酸（T3）測試盒（批號202012）、甲狀腺素（T4）測試盒（批號202012）、細胞色素C氧化酶（COX）測試盒（批號202012），凡科維青島柏舟生物科技有限公司。氫化可的松注射液（20 mL/支，5 mg/mL），天津金耀藥業(yè)有限公司。

1.2.2 分組、造模及給藥

小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量分層隨機分為空白對照組、模型組、紅參低劑量組、紅參高劑量組、黑參低劑量組、黑參高劑量組、人參葉低劑量組、人參葉高劑量組，每組10只。除空白對照組外，各組小鼠每日灌胃氫化可的松溶液25 mg/kg，連續(xù)30 d。造模8 d起，各給藥組分別灌胃相應藥物水煎液，低劑量組5.85 g/kg，高劑量組11.7 g/kg，灌胃體積均為0.4 mL/20 g。空白對照組及模型組灌胃等量蒸餾水，連續(xù)21 d。

1.2.3 指標檢測

1.2.3.1 一般狀況

每7 d稱量小鼠體質(zhì)量，每日觀測小鼠毛發(fā)、行為活動等是否有異常狀況。

1.2.3.2 血清代謝指標含量測定

末次給藥后，小鼠禁食不禁水24 h，摘除眼球取血，2 500 r/min離心10 min，取上清液，分裝，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA 測定T3、T4、CORT、COX、cGMP、cAMP含量，采用紫外分光光度法測定AchE活力，按試劑盒說明書操作。

1.2.3.3 肝組織Na-K-ATP酶活力測定

取各組小鼠肝臟相同部位，稱重后置于勻漿器中，按1∶9比例加入0.01 mol/L生理鹽水，冰浴條件下進行組織勻漿，2 500 r/min離心20 min，取上清液，分裝，于-80 ℃冰箱保存。采用紫外分光光度法測定Na-K-ATP酶活力，按試劑盒說明書操作。

1.3 多指標綜合分析歸屬黑參藥性

1.3.1 主成分分析

利用SIMCA-P軟件對各指標數(shù)據(jù)進行趨向分析，以空白對照組、寒性模型組為基準，各給藥組與基準組之間的距離為主要因素，各給藥組圖形離散程度為次要因素，對黑參的藥性進行歸屬。

1.3.2 聚類分析

將各組指標數(shù)據(jù)與模型組比較：較模型組顯著升高時，＜0.05賦值為1，＜0.01賦值為2；較模型組顯著降低時，＜0.05賦值為-1，＜0.01賦值為-2；無顯著變化賦值為0。采用SPSS25.0軟件對各指標差異有統(tǒng)計學意義的結(jié)果進行聚類分析，從而判斷黑參的藥性。

2 結(jié)果

2.1 中藥物質(zhì)基礎藥性歸屬及黑參藥性預測

通過KEGG通路反向找靶，統(tǒng)計相同藥性中同一靶點的degree。將藥性賦值（寒＝-2、涼＝-1、微溫＝0.5、溫＝1）與degree加權(quán)，按單體化合物矢量絕對值大小，歸屬其寒熱藥性。溫性中藥藥性物質(zhì)基礎分析見表1，寒涼性中藥藥性物質(zhì)基礎分析見表2。

表1 人參屬溫性中藥藥性物質(zhì)基礎分析

表2 人參屬寒涼性中藥藥性物質(zhì)基礎分析

經(jīng)對比分析可知，槲皮素、Rh、20(R)-Rg、Rf、20(S)-Rg、Rc、Rg、豆甾醇、Rb、Rh、Ra、Ra、Ra、Ra、Ro、花生四烯酸、Rg、R、La、山槐樹、灌木遠志酮A、蘇齊內(nèi)酯等為溫性成分。Rh、Re、Rg、山柰酚、β-谷甾醇、Rb、罌粟堿、Rh、Rb、Rh、Rg為寒涼性成分。由單體皂苷藥性，結(jié)合前期關于黑參皂苷成分及含量的研究，預測黑參的藥性可能為溫性，其藥性物質(zhì)基礎為Rg、Rb、Rc、20(R)-Rg、Rf、20(S)-Rg、Rg、Rh。

2.2 藥性調(diào)控關鍵靶點

將預測出的靶點按矢量值輸入KEGG PATHWAY Database，找出與能量代謝直接相關的溫熱靶點及寒涼靶點，前5位靶點見表3。將藥性物質(zhì)基礎分別與寒熱靶點蛋白進行分子對接分析，結(jié)果見圖1。可知化合物分子與溫熱靶點GSK3B、PFKFB3及寒涼靶點PTGS1和AchE結(jié)合性能較好。選用PTGS1和AchE及其上下游蛋白酶進行后續(xù)藥理實驗。

圖1 人參屬中藥化合物與寒熱藥性靶點分子對接分數(shù)熱圖

表3 人參屬中藥寒熱藥性與能量代謝直接相關的靶點（前5位）

2.3 動物實驗結(jié)果

2.3.1 一般狀況

空白對照組小鼠眼睛有神，活動迅速，背毛濃密、有光澤。造模第7日，體質(zhì)量降低，出現(xiàn)畏寒蜷縮、閉目無神、精神狀態(tài)萎靡、少動、大便溏稀及反抗力減弱。造模第14日，小鼠上述狀態(tài)加重。與模型組比較，各給藥組體質(zhì)量、反應活躍程度均有一定程度改善。

2.3.2 指標測定結(jié)果

各組小鼠血清AchE、Na-K-ATP酶活力，COX、cGMP、cAMP含量及cAMP/cGMP水平見圖2，各組小鼠血清CORT、T3、T4測定結(jié)果見表4。分析可知，紅參主要通過調(diào)節(jié)Na-K-ATP酶活力、COX含量對機體能量代謝產(chǎn)生作用，并通過升高下調(diào)的cAMP/cGMP水平緩解陽虛證。黑參主要通過調(diào)節(jié)CORT含量對內(nèi)分泌激素水平產(chǎn)生一定影響，并通過調(diào)節(jié)COX含量對機體能量代謝產(chǎn)生一定作用。人參葉可上調(diào)AchE活力，降低cAMP含量，使cAMP/cGMP水平較模型組有下調(diào)趨勢。

表4 各組小鼠內(nèi)分泌激素水平比較（x±s，每組10只）

圖2 各組小鼠AchE、Na+-K+-ATP酶、COX、cAMP、cGMP及cAMP/cGMP比較（x±s，每組10只）

2.4 主成分分析

利用SIMCA-P軟件，對各組小鼠能量代謝指標數(shù)據(jù)的平均值歸一化處理后分別進行主成分分析，高劑量組和低劑量組數(shù)據(jù)分析結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，黑參組與紅參組較為趨近。

圖3 各組小鼠指標數(shù)據(jù)主成分分析

2.5 聚類分析

利用SPSS25.0軟件，進一步對各組差異性指標數(shù)據(jù)進行聚類分析，樹狀圖見圖4。聚為兩類時，人參葉高、低劑量組為一類，黑參高、低劑量組，紅參高、低劑量組，以及空白對照組為一類。

圖4 各組小鼠差異性指標數(shù)據(jù)聚類分析

3 討論

化學成分是中藥藥效的物質(zhì)基礎，是藥性表達的一個方面。同一類藥性藥物的物質(zhì)基礎可能有共性，結(jié)構(gòu)類似的化合物或成分可能表現(xiàn)出同類藥性。本研究以藥味、歸經(jīng)、功能、主治相似而藥性（氣）有顯著差別的三七、紅參、人參、西洋參、人參葉為研究對象，以特異性通路→靶點模式，通過通路反向找靶，剔除寒熱藥共有靶點后得到寒熱特異性靶點，分析化學成分-寒熱特異性靶點-寒熱特異性通路網(wǎng)絡找出各靶點degree，統(tǒng)計相同藥性中同一靶點、化合物degree，在此基礎上對藥性賦值并與degree加權(quán)，歸屬排序各靶點、化合物所調(diào)控的藥性。

在預測的寒熱相關靶點中找出與能量代謝直接相關靶點，取矢量值較大的前5個靶點作為分子對接靶點，經(jīng)分子對接得到溫熱靶點GSK3B、PFKFB3及寒涼靶點AchE、PTGS1與各化合物對接熱力值較高，這些可能是揭示寒熱藥性的關鍵分子基礎。前期研究發(fā)現(xiàn)，陽虛模型大鼠AchE活力有降低趨勢，給予溫性藥后AchE活力有升高趨勢。酶活力越大，酶含量越高，同時酶的蛋白表達越高。PTGS1、PTGS2作為同工酶分別編碼COX1、COX2，是將花生四烯酸合成為前列腺素的關鍵酶，同時與炎癥的發(fā)生有著密切聯(lián)系，表明抗炎解熱功效是寒性藥性的重要體現(xiàn)。戴逸飛研究表明，寒性中藥對酵母致熱小鼠下丘腦中PTGS2蛋白表達有一定的下調(diào)作用。

當機體處于腎陽虛狀態(tài)時，全身機能降低，代謝下降，體溫降低，免疫功能減退。腎陽虛癥與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)的功能變化相關。下丘腦-垂體-靶腺軸（腎上腺軸、甲狀腺軸和性腺軸）功能障礙或低下是腎陽虛證的基礎，任何一軸功能下降，均可引起腎陽虛證。氫化可的松作為外源性糖皮質(zhì)激素，可升高糖皮質(zhì)激素水平，從而反饋性地抑制垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放，使腎上腺皮質(zhì)分泌激素減少，導致腎上腺及性腺器官萎縮、免疫器官損害等。動物會出現(xiàn)一系列“耗竭”現(xiàn)象，即體質(zhì)量下降、活動減少、拱背、蜷縮、被毛疏松無光澤、畏寒等陽虛癥狀。本研究采用氫化可的松灌胃給藥制備陽虛小鼠模型，選取寒涼關鍵靶點及其上下游蛋白酶作為研究對象，并分別灌胃給予高、低劑量的紅參、黑參及人參葉水煎液，觀察各組小鼠體征指標及體內(nèi)指標的變化。結(jié)果表明，人參葉與紅參和黑參相比，作用效果不顯著，可能與其藥性為寒性相關。

槲皮素、Rh、20(R)-Rg、Rf、20(S)-Rg、Rc、Rg、豆甾醇、Rb、Rh、Ra、Ra、Ra、Ra、Ro、花生四烯酸、Rg、三七皂苷R、La、山槐樹、灌木遠志酮A、蘇齊內(nèi)酯等成分藥性為溫性。Rh、Re、Rg、山柰酚、β-谷甾醇、Rb、罌粟堿、Rh、Rb、Rh、Rg等成分藥性為寒涼性。對動物實驗結(jié)果進行多元統(tǒng)計分析可知，黑參的藥性為溫性，其藥性物質(zhì)基礎為Rg、Rb、Rc、20(R)-Rg、Rf、20(S)-Rg、Rg、Rh。