電針天樞、大腸俞對(duì)慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸組織ChAT、SCF和c-Kit表達(dá)的影響

鐘峰，匡泓俊，文錢，曹洋，袁楠，楊臘媛，袁楊陽(yáng)，章薇

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007

慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是以結(jié)腸傳輸時(shí)間延遲為特征的腸道疾病，好發(fā)于青年女性和老年群體。STC發(fā)病率逐年提高，全球患病率達(dá)14%。此外，STC纏綿難愈、反復(fù)發(fā)作，降低患者生活質(zhì)量，部分患者通過(guò)服用瀉藥改善癥狀，但長(zhǎng)期服用瀉藥會(huì)導(dǎo)致腎病、心腦血管疾病患病風(fēng)險(xiǎn)增加。

STC發(fā)病機(jī)制尚未明晰，目前認(rèn)為腸神經(jīng)系統(tǒng)、Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC）是治療STC的關(guān)鍵靶點(diǎn)。酪氨酸激酶受體c-Kit能與干細(xì)胞因子（SCF）結(jié)合，形成SCF/c-Kit 通路，調(diào)控ICC 增殖。乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）是膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志酶，是腸神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，電針“天樞”“大腸俞”能改善膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子甲基化狀態(tài)，緩解便秘癥狀。俞募配穴是針灸基礎(chǔ)理論最經(jīng)典的配穴法，大腸俞和天樞分別為大腸俞募穴，被廣泛用于治療消化系統(tǒng)疾病。但電針天樞、大腸俞能否通過(guò)調(diào)節(jié)ChAT、SCF、c-Kit表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)腸動(dòng)力作用并不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立STC大鼠模型，觀察電針天樞、大腸俞對(duì)結(jié)腸組織ChAT和SCF/c-Kit通路表達(dá)的影響，明確電針治療STC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠40 只，5～6 周齡，體質(zhì)量（180±20）g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0003。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度20～25 ℃、濕度40%～60%環(huán)境，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。本實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（LL2021091502）。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol（美國(guó)Invitrogen 公司，貨號(hào)15596018），RIPA 裂解液（北京百奧萊博公司，貨號(hào)MT0066），PVDF 膜（美國(guó)Millipore 公司，貨號(hào)IPVH00010），SCF抗體（美國(guó)GeneTex公司，貨號(hào)31379），c-Kit抗體（美國(guó)ThermoFisher 公司，貨號(hào)14-1172-82），ChAT抗體（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab178850），復(fù)方地芬諾酯片（江蘇常州康普藥業(yè)，批號(hào)1503030）。HANS-200A型電針儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），華佗牌針灸針，0.25 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司，MDF-C8V 超低溫冰箱（日本Sanyo 公司），SJX-402，高溫殺菌恒溫箱（上海躍進(jìn)），CFX96型RTPCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 分組與造模

將復(fù)方地芬諾酯片與生理鹽水混合，制成濃度為15 mg/mL地芬諾酯混懸液。將40只大鼠隨機(jī)分為空白組、鹽水組、模型組和電針組，每組10只。模型組和電針組參照文獻(xiàn)[7]采用復(fù)方地芬諾酯混懸液灌胃建立STC大鼠模型，體積10 mL/kg，空白組不予處理，鹽水組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)21 d。末次灌胃后，大鼠禁食不禁水24 h，予150 g/L活性炭混懸液灌胃，體積1 mL/100 g。第22日記錄首粒黑便排出時(shí)間，排出時(shí)間長(zhǎng)于空白組均值的大鼠為造模成功。鹽水組用于驗(yàn)證生理鹽水對(duì)結(jié)果的影響。

1.4 干預(yù)

造模成功后，剔除電針組大鼠腹部和背部毛發(fā)，碘伏消毒。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，選取雙側(cè)“天樞”“大腸俞”直刺進(jìn)針5 mm，各穴旁開0.5 mm處刺入一輔助針用于固定，淺刺透皮。主針與輔助針?lè)謩e接電針儀正、負(fù)極，疏密波，頻率2/15 Hz，強(qiáng)度0.5～1 mA，以肢體末端輕微抖動(dòng)為度，15 min/次，1次/日，空白組、鹽水組和模型組每日固定15 min。連續(xù)14 d。

1.5 胃排空率和小腸推進(jìn)率檢測(cè)

干預(yù)結(jié)束后，大鼠禁食不禁水24 h，予半固體糊（含活性炭、淀粉、糖、羧甲基纖維素鈉、奶粉等）1 mL（質(zhì)量為W1）灌胃，30 min后腹腔注射20%烏拉坦麻醉大鼠，剖腹，結(jié)扎賁門和幽門，取出胃和小腸，將小腸拉直，用卷尺測(cè)量幽門至半固體糊推進(jìn)處的距離（L1）及幽門到回盲部長(zhǎng)度（L2），稱量胃總質(zhì)量（W2），剪開胃體，沖洗內(nèi)容物，稱量胃凈質(zhì)量（W3），計(jì)算胃排空率和小腸推進(jìn)率。胃排空率（%）＝[1－（W2－W3）/W1]×100%，小腸推進(jìn)率（%）＝L1/L2×100%。

1.6 免疫熒光檢測(cè)

大鼠結(jié)腸組織用4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片。切片二甲苯脫蠟，過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性酶，PBS浸泡，熱修復(fù)法修復(fù)抗原，滴加山羊血清室溫封閉30 min，分別加入ChAT、c-Ki t一抗（均為1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜。加入熒光二抗（1∶200），37 ℃避光孵育30 min，DAPI避光孵育5 min，抗熒光衰減劑封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照。ChAT標(biāo)記膽堿能神經(jīng)元，陽(yáng)性表達(dá)為紅色，c-Kit標(biāo)記ICC，陽(yáng)性表達(dá)為綠色。Image J 1.8.0軟件計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。

1.7 Western blot檢測(cè)

取結(jié)腸組織，加入RIPA裂解液，置于冰上裂解20 min，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，取上清液，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。上樣，電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入c-Kit、SCF一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，PBST洗膜3次。加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，PBST洗膜3次。加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，采用Image J 1.8.0軟件分析條帶灰度值。以β-tubulin為內(nèi)參，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 RT-PCR檢測(cè)

取結(jié)腸組織，加入1 mLTrizol研磨，加入氯仿振蕩15 s，室溫靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移水相，按RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取RNA。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、50 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，用2法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)模型大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率的影響

空白組與鹽水組大鼠胃排空率、小腸推進(jìn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；與空白組比較，模型組大鼠胃排空率、小腸推進(jìn)率顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠胃排空率、小腸推進(jìn)率顯著升高（＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率比較（，%）

2.2 電針對(duì)模型大鼠結(jié)腸組織乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶和酪氨酸激酶受體c-Kit表達(dá)的影響

空白組與鹽水組大鼠結(jié)腸組織ChAT和c-Kit表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織ChAT和c-Kit表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠結(jié)腸組織ChAT和c-Kit表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。見圖1、圖2、表3。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織ChAT和c-Kit表達(dá)比較（，熒光強(qiáng)度）

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織ChAT陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色）

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織c-Kit陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色）

2.3 電針對(duì)模型大鼠結(jié)腸組織干細(xì)胞因子和酪氨酸激酶受體c-Kit蛋白表達(dá)的影響

空白組與鹽水組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。見圖3、表4。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit蛋白表達(dá)比較（）

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織SCF、c-Kit蛋白免疫印跡

2.4 電針對(duì)模型大鼠結(jié)腸組織干細(xì)胞因子和酪氨酸激酶受體c-Kit mRNA表達(dá)的影響

空白組與鹽水組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit mRNA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit mRNA表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit mRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。見表5。

表5 各組大鼠結(jié)腸組織SCF和c-Kit mRNA表達(dá)比較（）

3 討論

STC屬中醫(yī)學(xué)“便秘”范疇，病機(jī)以大腸傳導(dǎo)失職為主，涉及脾、腎、肝等臟腑。病機(jī)可概括為情志失衡致氣機(jī)滯留、飲食失潔致濕熱陰寒積于胃腸、年老勞倦致氣血兩虛不濡胃腸等。五臟六腑之氣匯聚于俞募穴，天樞歸胃經(jīng)，為大腸之募穴?！鹅`樞·本輸》有“大腸小腸，皆屬于胃，是足陽(yáng)明也”，故論治腸病可從胃經(jīng)出發(fā)。刺激天樞可補(bǔ)益脾胃、益精養(yǎng)血，氣血充盈推動(dòng)有力，從而促進(jìn)胃腸傳導(dǎo)。從解剖學(xué)上分析，天樞深部為小腸，深刺天樞可調(diào)節(jié)腸功能，且安全性較高。大腸俞是大腸之背俞穴，屬膀胱經(jīng)，可調(diào)節(jié)腸道傳導(dǎo)。兩穴相配，共奏疏通腸腑氣機(jī)之效。團(tuán)隊(duì)前期臨床研究表明，電針天樞、大腸俞對(duì)功能性腸病有雙向調(diào)節(jié)作用。基礎(chǔ)研究表明，電針“天樞”“大腸俞”能減輕STC大鼠結(jié)腸損傷，修復(fù)ICC結(jié)構(gòu)。

腸神經(jīng)系統(tǒng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成胃腸道動(dòng)力的基本單位。膽堿能神經(jīng)元是一種廣泛分布的神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元，在腸神經(jīng)系統(tǒng)中含量最高。ChAT在膽堿能神經(jīng)元胞體中合成，能催化合成促進(jìn)胃腸動(dòng)力激素乙酰膽堿。膽堿能神經(jīng)元的數(shù)量及其合成的ChAT與腸動(dòng)力密切相關(guān)。ChAT是膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)記物，通過(guò)檢測(cè)ChAT能反映結(jié)腸膽堿能神經(jīng)元的數(shù)量及活性。研究表明，膽堿能神經(jīng)元數(shù)量減少，結(jié)腸ChAT表達(dá)降低，腸道神經(jīng)肌肉傳遞減少，釋放促腸動(dòng)力激素不足，則導(dǎo)致腸動(dòng)力下降。ICC是一種廣泛存在于平滑肌組織的間質(zhì)細(xì)胞，特別是胃腸道中存在大量ICC，其能激發(fā)慢波電位，與腸道平滑肌細(xì)胞相互作用，是胃腸動(dòng)力的起搏細(xì)胞。c-Kit是存在于ICC表面的受體之一，能反映ICC的數(shù)量和活性，其能與SCF通過(guò)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成SCF/c-Kit信號(hào)通路，通過(guò)活化酪氨酸激酶，在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，SCF/c-Kit信號(hào)通路的抑制與STC發(fā)病密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率下降，結(jié)腸組織ChAT、SCF、c-Kit 表達(dá)顯著降低，提示結(jié)腸組織ChAT表達(dá)和SCF/c-Kit信號(hào)通路與STC發(fā)生有關(guān)。電針“天樞”“大腸俞”干預(yù)后，大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率明顯恢復(fù)，結(jié)腸組織ChAT、SCF、c-Kit表達(dá)顯著升高，表明電針可促進(jìn)ChAT表達(dá)，恢復(fù)膽堿能神經(jīng)元功能，激活SCF/c-Kit信號(hào)通路，從而改善胃腸道傳輸功能。

綜上所述，電針天樞、大腸俞可能通過(guò)促進(jìn)ChAT表達(dá)、激活SCF/c-Kit 信號(hào)通路，恢復(fù)腸神經(jīng)系統(tǒng)-ICC-平滑肌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮治療便秘作用。